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In questo articolo

  • Riepilogo
  • Abstract
  • Introduzione
  • Protocollo
  • Risultati
  • Discussione
  • Divulgazioni
  • Riconoscimenti
  • Materiali
  • Riferimenti
  • Ristampe e Autorizzazioni

Riepilogo

Le pompe di efflusso xenobiotico sono altamente attive nelle cellule staminali esemiche e progenitrici (HSPC) e causano l'estrusione di TMRM, una membrana mitocondriale potenziale disfunzione fluorescente. Qui, presentiamo un protocollo per misurare con precisione il potenziale della membrana mitocondriale negli HSPC da TMRM in presenza di Verapamil, un inibitore della pompa di efflusso.

Abstract

Poiché il metabolismo cellulare è un regolatore chiave dell'autorinnovamento delle cellule staminali ematopoietiche (HSC), i vari ruoli svolti dai mitocondri nell'omeostasi ematopoietica sono stati ampiamente studiati dai ricercatori dell'HSC. I livelli di attività mitocondriale si riflettono nei loro potenziali della membrana, che possono essere misurati da coloranti cationici per meant delle cellule come TMRM (tetramethylrhodamine, ester metilico). La capacità di pompe di efflusso di estrudere questi coloranti dalle cellule può limitare la loro utilità, tuttavia. La distorsione di misurazione risultante è particolarmente critica nella valutazione degli HSC, poiché i trasportatori xenobiotici presentano livelli di espressione e attività più elevati nelle HSC rispetto alle cellule differenziate. Qui, descriviamo un protocollo che utilizza Verapamil, un inibitore della pompa di efflusso, per misurare con precisione la z -m in più popolazioni di midollo osseo. L'inibizione risultante dell'attività della pompa è indicato per aumentare l'intensità TMRM nelle cellule staminali ematopoietiche e progenitrici (HPC), lasciandolo relativamente invariato in frazioni mature. Ciò evidenzia la particolare attenzione all'attività di tinge-efflux che è necessaria quando si utilizzano coloranti dipendenti da zm, e come scritto e visualizzato, questo protocollo può essere utilizzato per confrontare con precisione diverse popolazioni all'interno del midollo osseo, o la stessa popolazione diversi modelli sperimentali.

Introduzione

Le cellule staminali ematopoietiche (HSC) sono auto-rinnovanti, multi-potenti e in grado di dare origine a tutte le cellule del sangue1,2. Il metabolismo cellulare è un regolatore chiave della manutenzione HSC, insieme a fattori trascrizionali, segnali intrinseci e il microambiente3,4,5. Il corretto controllo della funzione mitocondriale e della qualità è quindi fondamentale per la manutenzione HSC6,7.

Il potenziale della membrana mitocondriale è un parametro chiave nella valutazione dei mitocondri in quanto riflette direttamente la loro funzionalità, che deriva dall'equilibrio dell'attività di pompaggio dei protoni nella catena di trasporto degli elettroni e il flusso di protoni attraverso F 1/FO ATP synthase. Questi sono entrambi necessari (a seconda dell'espressione genica e della disponibilità di substrato) per la fosforodipendente dall'ossigeno di ADP a ATP8,9. Approfittando dell'elettronegatività del compartimento mitocondriale, sono stati sviluppati vari coloranti potentiometrici per misurare il sistema . Uno di questi è il perclorato di estere di tetrametilholhodamine (TMRM), che è stato ampiamente utilizzato per misurare la citometria di flusso in una varietà di cellule10, comprese le cellule staminali ematopoietiche e progenitrici11.

Coloranti mitocondriali devono essere utilizzati con una certa cautela in HSC, tuttavia, perché l'alta attività delle pompe di efflusso xenobiotico di queste cellule può provocare estrusione colorante12. Infatti, l'estrusione di coloranti mitocondriali come Rhodamine 123 ha permesso ai ricercatori di isolare gli HSC13 o identificare le "popolazioni laterali" di HSC sfruttando l'estrusione differenziale dei coloranti Hoechst Blue e Hoechst Red14, 15.È stato anche dimostrato che Fumitremorgin C, un blocco specifico della sottofamiglia ad associazione ATP G membro 2 (ABCG2), non influisce sul modello di colorazione di MitoTracker in HSPC16. Dopo la pubblicazione di questi risultati, sono stati effettuati più studi utilizzando coloranti mitocondriali in assenza di inibitori della pompa di efflusso xenobiotico, portando alla diffusa impressione che gli HSC abbiano solo un piccolo numero di mitocondri con basso , 17 mi lato , 18.

Recentemente, è stato dimostrato, tuttavia, che Verapamil, un inibitore ad ampio spettro delle pompe di flusso di efflusso, modifica significativamente il modello di colorazione del mitocondriale MitoTracker Green19. Questa discrepanza è probabilmente dovuta al fatto che fumitremorgin C è altamente selettivo per Abcg2, mentre gli HSC esprimono anche altri trasportatori come Abcb1a (che è solo debolmente sensibile a Fumitremorgin C)19. Abbiamo anche riferito che altri coloranti mitocondriali, come TMRM, Nonyl acridine orange, e Mitotracker Orange (MTO) presentano gli stessi modelli di Mitotracker Green. Ancora più importante, abbiamo osservato che i modelli citometrici di flusso degli HPC riflettono il loro zm in aggiunta alla massa mitocondriale11.

L'assunzione di tinture TMRM dipende strettamente dalla carica negativa dei mitocondri, ma il conseguente accumulo di tinture è in costante equilibrio tra la sua assunzione e l'eliminazione da pompe di efflusso20. La differenza nell'espressione della pompa di efflusso xenobiotica tra HSC e popolazioni di cellule mature influisce su questo equilibrio e può portare a risultati di parte. L'uso di inibitori dedicati come il Verapamil deve essere considerato nell'analisi di zm da coloranti potentiometrici. Qui descriviamo un protocollo modificato per la misurazione accurata di zm da parte della citometria di flusso basata su TMRM che corregge l'attività del trasportatore xenobiotico attraverso l'uso di inibitori dedicati.

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Protocollo

Tutti i metodi qui descritti sono stati approvati dall'Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) dell'Albert Einstein College of Medicine.

1. Preparazione delle soluzioni

  1. Coloring Buffer (PBS) con buffer di fosfato - siero bovino fetale (FBS) del 2%: aggiungere 10 mL di FBS in 500 mL di una soluzione PBS sterile.
    NOT: Questa soluzione può essere conservata a 4 gradi centigradi per almeno un mese in condizioni sterili. Prima di iniziare le seguenti procedure, mettere una di questa soluzione (50 mL) sul ghiaccio.
  2. Cuscinetto liscivia ACK (cloruro-potassio-potassio): mettere una macchia di tampone di liscivia ACK (1 mL) sul ghiaccio prima di iniziare la procedura.
    NOT: Per preparare lo stesso buffer non commerciale, sciogliere 8,02 g di NH4Cl, 1 g di KHCO3 e 37,2 mg di Na2EDTA in 1 L di H2O. Regolare il pH a 7.2-7.4. Conservare fino a 6 mesi a temperatura ambiente.
  3. Mezzo di coltura: aggiungere il fattore di 50 cellule staminali ng/mL (SCF) e 50 trombopoietina ng/mL (TPO) al mezzo senza siero per la coltura e l'espansione delle cellule ematopoietiche (vedere Tabella dei materiali per il mezzo commerciale consigliato).
  4. Soluzione di stock TMRM: Preparare la soluzione TMRM (1 M) sciogliendo 5 g di polvere TMRM in 10 mL di etanolo. Conservare questa soluzione a -20 gradi centigradi protetti dalla luce.
  5. Verapamil stock solution: Preparare la soluzione Verapamil (50 mM) diluindo 24 mg di Verapamil in 1 mL di etanolo. Conservare questa soluzione a -20 gradi centigradi.
  6. Soluzione di stock FCCP: Preparare la soluzione di carbonilcyanide p-triflouromethoyphenylhydrazone (FCCP) (1 M) sciogliendo 254 mg in 1 mL di etanolo. Conservare questa soluzione a -20 gradi centigradi protetti dalla luce.

2. Isolamento del midollo osseo

  1. Eutanasia il topo per inalazione di CO2 seguendo le linee guida istituzionali e spruzzare i topi con 70% di etanolo.
    NOT: Questo passaggio previene la contaminazione delle cellule di interesse senza compromettere i risultati sperimentali.
  2. Utilizzando un paio di pinze e forbici affilate, fare un piccolo taglio nella pelle ventrale del topo e allungare la pelle.
  3. Estrarre il femore e la tibia facendo attenzione a non spostare le teste del femore in quanto contengono una grande quantità di cellule del midollo osseo. Mettere le ossa rimosse in una piastra di 6 pozzetti riempita con 1,5 mL di tampone di colorazione.
    NOT: Questa procedura non richiede un'area sterile.
  4. Rimuovere i muscoli dalle ossa e tagliare le estremità delle ossa permettendo l'uscita del midollo osseo (Figura 1A). Collocare le ossa pulite in nuovi pozzetti con 1,5 mL di tampone di colorazione.
    NOT: I muscoli e altri tessuti devono essere accuratamente rimossi per evitare l'intasamento delle siringhe nella fase successiva.
  5. Svuotare il midollo osseo utilizzando una siringa da 3 mL con un ago da 25 G.
    NOT: Continuare a lavare il midollo osseo fino a quando l'osso diventa bianco (Figura 1B).
  6. Raccogliere tutte le cellule in un tubo da 1,5 mL, centrifugare per 5 min a 180 x g quindi scartare il sovrentrato (Figura 1C).
  7. Risospendere il pellet a 300 gradi di tampone di liscivia ACK freddo molto attentamente, mettere sul ghiaccio per 1 min e immediatamente inattiva lisi aggiungendo 1 mL di tampone di colorazione. Centrifuga per 5 min a 180 x g.
    NOT: Il pellet delle celle appare bianco (Figura 1D). Il numero totale di cellule isolate è di circa 2-4 x 107.
  8. Risospendere i pellet in 1 mL di macchiatura e filtrare utilizzando un tappo a colino cellulare (12 x 75 mm2, 5 mL di capacità) con una rete di nylon di 35 m incorporata per ottenere celle mononucleari. Dopo il blocco, tenere il campione sul ghiaccio.

3. Immunostaining per il rilevamento di HSC

  1. Preparare il cocktail di lignaggio (Lin). In 400 litri di tampone di colorazione, aggiungere 4 l dei seguenti anticorpi biotitiliati contro CD3e, CD4, CD8, B220, CD11b, Gr1, Ter119, CD19, Nk1.1, IgM e Il7Ra per ottenere una diluizione finale 1:100.
  2. Preparare fluorofori coniugati (Abs). In 400 l di tampone di colorazione, aggiungere 4 l. Streptavidin-Pacific Blue, Sca1-PE/Cy7, c-kit-APC/Cy7, CD48-APC, CD150-PerCP/Cy5.5 e CD34-FITC. Tenere nel ghiaccio, protetto dalla luce.
  3. Centrifugare il campione per 5 min a 180 x g, quindi scartare il super-natante.
  4. Aggiungere 400 l di l di l in cocktail alle cellule pellet. Aggiungete rapidamente 4 ll di Ab. Vortex biotinato CD135 per mescolare e incubare per 30 min di ghiaccio.
  5. Lavare il campione aggiungendo 3 mL di tampone di colorazione, ruotare verso il basso per 5 min a 180 x g e scartare il sovrinterrato.
  6. Aggiungere 400 l di abs soluzione. Vortice rapidamente per mescolare e incubare per 30 min sul ghiaccio.
  7. Lavare i campioni con 3 mL di tampone di colorazione, ruotare verso il basso per 5 min a 180 x g e scartare il sovrinterrato.

4. Colorazione TMRM

  1. Preparare la soluzione di colorazione TMRM. Aggiungere 2,2 l-L di soluzione di stock TMRM e 1,1 di L di Verapamil (2 nM e 50 M come concentrazione finale, rispettivamente) in 1,1 mL di mezzo senza siero per coltura ed espansione delle cellule ematopoietiche (vedi Tabella di Materiale per il mezzo commerciale consigliato) con TPO e SCF.
    NOT: Questo è il passo più importante del protocollo. Verapamil aggiunta è necessaria per bloccare le pompe di efflusso che sono altamente espressi nelle HSC e possono estrusiT Tosl.
  2. Risospendere il midollo osseo in 1 mL di soluzione di colorazione TMRM, vortice rapidamente e incubare per 1 h a 37 gradi centigradi.
    NOT: La colorazione TMRM non deve essere sbiadita. Il controllo di compensazione dedicato al PE viene anche risospeso in 100 gradi di soluzione di colorazione TMRM e sottoposto a incubazione per 1 h a 37 gradi dopo il vortice rapido.
  3. Filtrare il campione utilizzando un tappo di cell-strainer (12 x 75 mm2, 5 mL di capacità) con una rete di nylon 35m incorporare per evitare l'intasamento del cilindro di flusso.
    NOT: La colorazione TMRM aumenta la possibilità di formazione di intasari nel campione. Si raccomanda la filtrazione del campione appena prima dei saggi di flusso.
  4. Aggiungete 1 -L di 4',6-diamidino-2-fenilindole (DAPI) per escludere le cellule morte per citometria di flusso.

5. Acquisizione da parte di Flusso Cytometer

  1. Eseguire il campione di midollo osseo e acquisire almeno 1 x 106 eventi.
  2. Impostare la strategia di gating per identificare le diverse popolazioni ematopoietiche (Figura 2).
    1. Visualizza le celle mononucleari del midollo osseo dal vivo (BM-MNC), DAPI- frazione,in trama per Pacific Blue per identificare CD135,Lin (Lin ) e Lin, frazioni.
    2. Plot Lin- frazione per APC/Cy7 (c-kit) contro PE/Cy7 (Sca-1) per identificare la frazione di progenitori multipotenti (MPP), come c-kit e Sca-1.
    3. Traccia repp frazione per APC (CD48) rispetto a PerCP/Cy5.5 (CD150) per identificare la frazione HSC, come CD150 e CD48.
    4. Visualizzare la frazione HSC per FITC (CD34) per dividere CD34-HSC e CD34 -HSC.
  3. Acquisire l'intensità TMRM (canale PE) in ogni popolazione.
  4. Dopo l'acquisizione, aggiungere al campione 1 : L di FCCP per ottenere la concentrazione finale di 1 mM e incubare a 37 gradi centigradi per 5 min, quindi acquisire 1 x 106 eventi.
    NOT: FCCP è un disaccoppiatore mitocondriale che viene utilizzato per dissipare il z. Viene utilizzato come controllo sperimentale per confermare che la colorazione TMRM funziona correttamente. Dopo l'amministrazione di FCCP, l'intensità TMRM dovrebbe essere drasticamente ridotta (Figura 3A).
  5. Analizzare i dati che normalizzano l'intensità media di PE di ogni popolazione in base all'intensità di PE di tutti i BM-MNC.

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Risultati

Il protocollo descritto in precedenza consente di semplificare l'isolamento dei BM-MNC da un modello di mouse. La figura 1 riassume i passaggi principali del protocollo: isolamento osseo, fuoriscono dal midollo osseo, lisi dei globuli rossi e colorazione degli anticorpi seguita dalla colorazione TMRM per misurare il potenziale della membrana mitocondriale in una popolazione ematopoietica specifica .

BM-MNC contengono diverse popolazioni di cellule, tra cui HSC. I ...

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Discussione

La misurazione potenziale della membrana mitocondriale è una pietra angolare dell'analisi e della valutazione dei mitocondri, che sono fondamentali per lo stato metabolico della cellula. In questo caso, descriviamo un protocollo per l'analisi della colorazione TMRM. TMRM è un colorante fluorescente per meant cellulare che si accumula nei mitocondri attivi a causa di m, e i suoi rispettivi livelli rimangono in equilibrio tra i compartimenti extracellulari, citoplasma e mitocondriali10. Questo pro...

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Divulgazioni

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Riconoscimenti

Gli autori ringraziano tutti i membri del laboratorio Ito, in particolare K Ito e H Sato, e l'Einstein Stem Cell Institute per i commenti e le strutture centrali di Einstein Flow Cytometry and Analytical Imaging (finanziate dalla sovvenzione P30 CA013330 del National Cancer Institute) per contribuire a condurre gli esperimenti. K.I. è supportato da sovvenzioni del National Institutes of Health (R01DK98263, R01DK115577 e R01DK100689) e del Dipartimento della Salute dello Stato di New York come direttore centrale di Einstein Single-Cell Genomics/Epigenomics (C029154). K.I. Ito è uno studioso di ricerca della Leucemia e della Lymphoma Society.

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Materiali

NameCompanyCatalog NumberComments
ACK lysing bufferLife TechnologiesA1049201
B220-biotinBD Bioscience553086
CD3e-biotinLife Technologies13-0031-85
CD4-biotinFischer ScientificBDB553782
CD8-biotinLife Technologies13-0081-85
CD11b-biotinBD Bioscience553309
CD19-biotinBD Bioscience553784
CD34-FITCeBioscience11-0341-85
CD48-APCeBioscience17-0481-82
CD135-biotineBioscience13-1351-82
CD150-PerCP/Cy5.5 Biolegend115922
c-kit-APC/Cy7Biolegend105826
Cyclosporin HMillipore SigmaSML1575-1MG
DAPI solution (1 mg/mL)Life Technologies62248
Fetal Bovine Serum (FBS)DenvilleFB5001-H
FCCPMillipore SigmaC2920-10MG
Gr1-biotinBiolegend108404
IgM-biotinLife Technologies13-5790-85
Il7Rα-biotineBioscience13-1271-85
Nk1.1-biotinFischer ScientificBDB553163
Phosphate buffered saline (PBS)Life Technologies10010023
Sca-1-PE/Cy7eBioscience25-5981-81
SCF murinePEPROTECH250-03-10UG
StemSpan SFEM mediumSTEMCELL technologies9605
Streptavidin-Pacific BlueeBioscience48-4317-82
Ter119-biotinFischer ScientificBDB553672
TMRMMillipore SigmaT5428-25MG
TPOPEPROTECH315-14-10UG
Verapamil hydrochlorideMillipore SigmaV4629-1G

Riferimenti

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