Melhorando a exatidão da avaliação cytometric do fluxo do potencial mitochondrial da membrana em pilhas hematopoietic da haste e do progenitor através da inibição de bombas do Efflux

Resumo

As bombas do efluxo de xenobiotic são altamente ativas na haste e nas pilhas Hematopoietic do progenitor (hspcs) e causam a extrusão de tmrm, uma tintura fluorescente potencial da membrana mitochondrial. Aqui, nós apresentamos um protocolo para medir exatamente o potencial mitochondrial da membrana nos hspcs por tmrm na presença de Verapamil, um inibidor da bomba do efluxo.

Resumo

Como o metabolismo celular é um regulador chave da autorenovação de células-tronco hematopoiéticas (HSC), os vários papéis desempenharam as mitocôndria na homeostase hematopoiética têm sido extensivamente estudados por pesquisadores do HSC. Os níveis de atividade mitocondrial são refletidos em seus potenciais de membrana (Δm), que podem ser medidos por corantes catiônicos celulares, como TMRM (tetrametilrodamina, éster metílico). A capacidade de bombas de efluxo para expulsar esses corantes de células pode limitar a sua utilidade, no entanto. O viés de mensuração resultante é particularmente crítico na avaliação de HSCs, uma vez que os transportadores xenobióticos exibem níveis mais elevados de expressão e atividade em HSCs do que em células diferenciadas. Aqui, nós descrevemos um protocolo que utiliza o verapamil, um inibidor da bomba de efluxo, para medir exatamente o Δ, em várias populações de medula óssea. A inibição resultante da atividade da bomba é mostrada para aumentar a intensidade de TMRM em pilhas hematopoietic da haste e do progenitor (HSPCs), ao deixá-la relativamente inalterada em frações maduras. Isto destaca a atenção estreita à atividade do tingimento-efflux que é exigida quando os corantes Δm-dependentes são usados, e como escrito e visualizado, este protocolo pode ser usado para comparar com precisão as populações diferentes dentro da medula óssea, ou a mesma população em diferentes modelos experimentais.

Introdução

As células-tronco hematopoiéticas (hscs) são autorenováveis, multipotentes e capazes de dar origem a todas as células do sangue^1,2. O metabolismo celular é um regulador chave da manutenção do HSC, juntamente com fatores transcricionais, sinais intrínsecos e o microambiente^3,4,5. O controle adequado da função e qualidade mitocondrial é, portanto^,crítico para a manutenção do HSC^6,7.

O potencial de membrana mitocondrial (Δ, m) é um parâmetro chave na avaliação das mitocôndrias, pois reflete diretamente sua funcionalidade, que deriva do equilíbrio da atividade de bombeamento de prótons na cadeia de transporte de elétrons e o fluxo de prótons através de F ₁/F_O ATP Synthase. Ambos são necessários (dependendo da expressão gênica e da disponibilidade de substrato) para a fosforilação dependente do oxigênio da ADP para o ATP^8,9. Aproveitando-se da eletronegatividade do compartimento mitocondrial, vários corantes potenciométricos foram desenvolvidos para medir Δm. Um deles é o perclorato de éster metílico de tetrametilrhodamina (TMRM), que tem sido amplamente utilizado para medir Δ, por citometria de fluxo em uma variedade de células¹⁰, incluindo tronco hematopoiético e células progenitoras¹¹.

Corantes mitocondriais devem ser usados com algum cuidado em HSCs, no entanto, porque a alta atividade das bombas de efluxo xenobiótica dessas células pode resultar em extrusão de corante¹². Na verdade, a extrusão de corantes mitocondriais, como a Rhodamina 123 permitiu que os pesquisadores isolem HSCs¹³ ou identifiquem HSC "populações laterais" explorando a extrusão diferencial dos corantes Hoechst Blue e Hoechst Red^{14, 15}. também foi demonstrado que o Fumitremorgin C, um bloqueador específico do transportador da subfamília G do membro 2 (ABCG2) do cassette de ligação ATP, não afeta o padrão de coloração de MitoTracker em HSPCs¹⁶. Após a publicação destes resultados, vários estudos foram realizados utilizando corantes mitocondriais na ausência de inibidores da bomba de efluxo xenobióticos, levando à impressão generalizada de que os HSCs têm apenas um pequeno número de mitocôndrias com baixo Δm^{16 , 17} anos de ^, de ^{18 anos}.

Recentemente, demonstrou-se, entretanto, que Verapamil, um inibidor largo do espectro de bombas do efluxo, modifica significativamente o teste padrão de mancha do corante mitochondrial MitoTracker verde¹⁹. Esta discrepância é provavelmente devido ao fato de que Fumitremorgin C é altamente seletivo para Abcg2, enquanto os HSCs também expressam outros transportadores, como Abcb1a (que é apenas fraca sensível a Fumitremorgin C)¹⁹. Nós igualmente relatado que outras tinturas mitochondrial, tais como tmrm, laranja do acridina do Nonyl, e laranja de MitoTracker (mto) exibem os mesmos testes padrões que o verde de MitoTracker. Mais importante, observou-se que os padrões citométricos de fluxo de HSPCs refletem seu Δm em adição à massa mitocondrial¹¹.

A ingestão de corante TMRM depende estritamente da carga negativa das mitocôndrias, mas o acúmulo resultante de corante está em constante equilíbrio entre sua ingestão e folga por bombas de efluxo²⁰. A diferença na expressão da bomba de efluxo xenobiótico entre HSCs e populações de células maduras afeta esse equilíbrio e pode levar a resultados tendenciosos. O uso de inibidores dedicados como o verapamil deve ser considerado na análise de Δm por corantes potenciométricos. Aqui nós descrevemos um protocolo modificado para a medida exata do δ, m pela citometria de fluxo tmrm-baseada que corrige para a atividade do transportador do xenobióticos com o uso de nervos inibidores dedicados.

Protocolo

Todos os métodos aqui descritos foram aprovados pelo Comitê institucional de cuidados e uso de animais (IACUC) da faculdade de medicina Albert Einstein.

1. preparação de soluções

1. Tampão de coloração (soro fisiológico tamponado com fosfato (PBS) + 2% de soro bovino fetal (FBS)): adicionar 10 mL de FBS em 500 mL de uma solução de PBS estéril.
   Nota: Esta solução pode ser armazenada a 4 ° c durante pelo menos um mês em condições estéreis. Antes de iniciar os seguintes procedimentos, coloque uma alíquota desta solução (50 mL) no gelo.
2. Tampão lisando do ACK (cloreto de amônio-potássio): coloc uma alíquota do amortecedor de lise do ACK (1 ml) no gelo antes de começar o procedimento.
   Nota: Para preparar o mesmo tampão não comercial, dissolva 8, 2 g de NH₄CL, 1 g de KHCO₃ e 37,2 mg de na₂EDTA em 1 L de H₂o. Ajuste o pH para 7.2-7.4. Armazene por até 6 meses na temperatura ambiente.
3. Meio de cultura: Adicionar 50 ng/mL fator de células-tronco (SCF) e 50 ng/mL de Trombopoietina (TPO) para o meio livre de soro para a cultura e expansão de células hematopoiéticas (ver tabela de material para meio comercial recomendado).
4. Solução de stock TMRM: Prepare a solução de TMRM (1 μM) dissolvendo 5 μg de pó de TMRM em 10 mL de etanol. Guarde esta solução a-20 ° c protegida da luz.
5. Solução de Verapamil: Prepare a solução de Verapamil (50 mM) diluindo 24 mg de Verapamil em 1 mL de etanol. Guarde esta solução a-20 ° c.
6. Solução de ações da FCCP: Prepare a solução de Carbonilcianeto p-triflourometoxifenilhidrazina (FCCP) (1 M) dissolvendo 254 mg em 1 mL de etanol. Guarde esta solução a-20 ° c protegida da luz.

2. isolamento da medula óssea

1. Eutanizar o rato por CO₂ inalação seguindo as diretrizes institucionais e pulverizar os camundongos com 70% etanol.
   Nota: Este passo impede a contaminação das células de interesse sem comprometer os resultados experimentais.
2. Usando um par de fórceps e tesouras afiadas, faça um Snip pequeno na pele ventral do rato e estique a pele.
3. Extraia o fêmur e a tíbia, tomando cuidado para não desalojar as cabeças do fêmur, pois elas contêm uma grande quantidade de células da medula óssea. Coloque os ossos removidos em uma placa de 6 poços preenchida com 1,5 mL de tampão de coloração.
   Nota: Este procedimento não exige a área estéril.
4. Retire os músculos dos ossos e corte as extremidades dos ossos permitindo a saída da medula óssea (Figura 1a). Coloque os ossos limpos em novos poços com 1,5 mL de tampão de coloração.
   Nota: Os músculos e outros tecidos devem ser cuidadosamente removidos para evitar entupimento da seringa na próxima etapa.
5. Lave a medula óssea utilizando uma seringa de 3 mL com uma agulha de 25 G.
   Nota: Continuar a esvaziar a medula óssea até que o osso se torne branco (Figura 1b).
6. Colete todas as células em um tubo de 1,5 mL, centrifugue por 5 min a 180 x g e descarte o sobrenadante (Figura 1C).
7. Ressuscite o pellet em 300 μL de gelo frio ACK lise tampão com muito cuidado, coloque no gelo por 1 min e lise imediatamente inativa, adicionando 1 ml de mancha tampão. Centrifugador por 5 min a 180 x g.
   Nota: O pellet células aparece branco (Figura 1D). O número total de células isoladas é de cerca de 2-4 x 10⁷.
8. Ressuscitação das pelotas em 1 mL de tampão de coloração e filtro usando uma tampa de peneira celular (12 x 75 mm^2,5ml de capacidade) com uma malha de nylon de 35 μm incorporada para obter células mononucleares. Após o bloqueio, mantenha a amostra no gelo.

3. imunocoloração para detecção de HSC

1. Prepare o cocktail Lineage (Lin). Em 400 μL de tampão de coloração, adicionar 4 μL dos seguintes anticorpos biotinilados contra CD3e, CD4, CD8, B220, CD11b, Gr1, Ter119, CD19, NK 1.1, IgM e Il7Ra para obter uma diluição final 1:100.
2. Prepare os fluoróforos conjugados-anticorpos (ABS). Em 400 μL de tampão de coloração, adicionar 4 μL do seguinte ABS para obter uma diluição final 1:100. Streptavidin-Pacific Blue, Sca1-PE/Cy7, c-kit-APC/Cy7, CD48-APC, CD150-PerCP/Cy 5.5 e CD34-FITC. Mantenha no gelo, protegido da luz.
3. Centrifugue a amostra durante 5 min a 180 x ge, em seguida, elimine o sobrenadante.
4. Adicionar 400 μL de solução de cocktail Lin ao pellet de células. Adicionar 4 μL de CD135-biotinilado AB. Vortex rapidamente para misturar e incubar por 30 min no gelo.
5. Lave a amostra adicionando 3 mL de tampão de coloração, gire para baixo por 5 min a 180 x g e descarte o sobrenadante.
6. Adicionar 400 μL de solução de ABS. Vortex rapidamente para misturar e incubar por 30 min no gelo.
7. Lave as amostras com 3 mL de tampão de coloração, gire para baixo por 5 min a 180 x g e descarte o sobrenadante.

4. coloração TMRM

1. Prepare a solução de coloração TMRM. Adicionar 2,2 μL de solução de stock de TMRM e 1,1 μL de Verapamil (2 nM e 50 μM como concentração final, respetivamente) em 1,1 mL de meio livre de soro para cultura e expansão de células hematopoiéticas (ver tabela de material para meio comercial recomendado) com TPO e SCF.
   Nota: Este é o passo mais importante do protocolo. A adição de Verapamil é necessária para bloquear as bombas de efluxo que são altamente expressas nos HSCs e podem expulsar TMRM.
2. Ressuscitar a medula óssea em 1 mL de solução de coloração de TMRM, vórtice rapidamente e incubar por 1 h a 37 ° c.
   Nota: A coloração de TMRM não deve ser lavada. O controle de compensação PE-dedicado também é redobrado em 100 μL de solução de coloração de TMRM e submetido à incubação por 1 h a 37 ° c após o vórtice rápido.
3. Filtre a amostra usando uma tampa de filtro de células (12 x 75 mm^2,5ml de capacidade) com uma malha de nylon de 35 μm incorporada para evitar entupimento do citometro de fluxo.
   Nota: A coloração por TMRM aumenta a possibilidade de formação de entupimento na amostra. A filtração da amostra pouco antes dos ensaios de fluxo é recomendada.
4. Adicionar 1 μL de 4 ', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) para excluir células mortas por citometria de fluxo.

5. aquisição por Citometro de fluxo

1. Executar amostra de medula óssea e adquirir pelo menos 1 x 10⁶ eventos.
2. Configurar a estratégia de gating para identificar as diferentes populações hematopoiéticas (Figura 2).
   1. Mostre pilhas mono-nucleares da medula óssea viva (BM-MNCs), DAPI-fração, no lote para o azul Pacífico para identificar CD135⁻Lin⁻ (Lin⁻) e Lin⁺ frações.
   2. Plotar Lin⁻ fração para APC/Cy7 (c-Kit) versus PE/Cy7 (SCA-1) para identificar a fração de progenitores MULTIPOTENTES (MPP), como c-kit⁺ e SCA-1⁺.
   3. Plotar a fração MPP para APC (CD48) versus PerCP/Cy 5.5 (CD150) para identificar a fração HSC, como CD150⁺ e CD48⁻.
   4. Mostre a fração HSC para FITC (CD34) para dividir CD34⁻-HSC e CD34⁺-HSC.
3. Adquira a intensidade de TMRM (canal de PE) em cada população.
4. Após a aquisição, acrescente à amostra 1 μL de FCCP para obter a concentração final de 1 mM e incubar a 37 ° c por 5 min, depois adquira 1 x 10⁶ eventos.
   Nota: FCCP é um desengate mitocondrial que é usado para dissipar o Δm. Ele é usado como controle experimental para confirmar que a coloração TMRM funciona corretamente. Após a administração da FCCP, a intensidade do TMRM deve ser drasticamente diminuída (Figura 3a).
5. Analisar dados normalizando a intensidade média de PE de cada população pela intensidade de PE de todas as BM-MNCs.

Resultados

O protocolo descrito acima permite o isolamento fácil de BM-MNCs a partir de um modelo de mouse. A Figura 1 resume as principais etapas do protocolo: isolamento ósseo, rubor da medula óssea, lise de glóbulos vermelhos e coloração de anticorpos seguida de coloração por TMRM para medir o potencial da membrana mitocondrial em uma população hematopoiética específica .

As BM-MNCs contêm várias populações de células, incluindo HSCs. Os coquetéis de ant...

Discussão

A medida do potencial de membrana mitocondrial é uma pedra angular da análise e avaliação das mitocôndrias, que são críticas ao estado metabólico da célula. Aqui, nós descrevemos um protocolo para a análise de Δm pela mancha de TMRM. O TMRM é um corante fluorescente que se acumula nas mitocôndrias ativas devido a Δm, e seus respectivos níveis permanecem em equilíbrio entre os compartimentos extracelular, citoplasmático e mitocondrial¹⁰. Este protocolo pode ser adaptado para vári...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
ACK lysing buffer	Life Technologies	A1049201
B220-biotin	BD Bioscience	553086
CD3e-biotin	Life Technologies	13-0031-85
CD4-biotin	Fischer Scientific	BDB553782
CD8-biotin	Life Technologies	13-0081-85
CD11b-biotin	BD Bioscience	553309
CD19-biotin	BD Bioscience	553784
CD34-FITC	eBioscience	11-0341-85
CD48-APC	eBioscience	17-0481-82
CD135-biotin	eBioscience	13-1351-82
CD150-PerCP/Cy5.5	Biolegend	115922
c-kit-APC/Cy7	Biolegend	105826
Cyclosporin H	Millipore Sigma	SML1575-1MG
DAPI solution (1 mg/mL)	Life Technologies	62248
Fetal Bovine Serum (FBS)	Denville	FB5001-H
FCCP	Millipore Sigma	C2920-10MG
Gr1-biotin	Biolegend	108404
IgM-biotin	Life Technologies	13-5790-85
Il7Rα-biotin	eBioscience	13-1271-85
Nk1.1-biotin	Fischer Scientific	BDB553163
Phosphate buffered saline (PBS)	Life Technologies	10010023
Sca-1-PE/Cy7	eBioscience	25-5981-81
SCF murine	PEPROTECH	250-03-10UG
StemSpan SFEM medium	STEMCELL technologies	9605
Streptavidin-Pacific Blue	eBioscience	48-4317-82
Ter119-biotin	Fischer Scientific	BDB553672
TMRM	Millipore Sigma	T5428-25MG
TPO	PEPROTECH	315-14-10UG
Verapamil hydrochloride	Millipore Sigma	V4629-1G