Améliorer la précision de l'évaluation cytométrique du débit du potentiel de membrane mitochondriale dans les cellules hématopoïétiques de tige et d'ancêtre grâce à l'inhibition des pompes d'Efflux

Résumé

Les pompes à efflux xénobiotiques sont très actives dans les cellules hématopoïétiques des tiges et des progéniteurs (HSPC) et provoquent l'extrusion de TMRM, un colorant fluorescent potentiel de membrane mitochondriale. Ici, nous présentons un protocole pour mesurer avec précision le potentiel de membrane mitochondriale dans HSPCs par TMRM en présence de Verapamil, un inhibiteur de pompe d'efflux.

Résumé

Comme le métabolisme cellulaire est un régulateur clé de l'auto-renouvellement des cellules souches hématopoïétiques (HSC), les divers rôles joués par les mitochondries dans l'homéostasie hématopoïétique ont été largement étudiés par les chercheurs de HSC. Les niveaux d'activité mitochondriale sont reflétés dans leurs potentiels membranaires, qui peuvent être mesurés par des colorants cationic à perméatifs tels que TMRM (tetramethylrhodamine, ester méthyle). La capacité des pompes d'efflux pour extruder ces colorants des cellules peut limiter leur utilité, cependant. Le biais de mesure qui en résulte est particulièrement critique lors de l'évaluation des HSC, car les transporteurs xénobiotiques présentent des niveaux d'expression et d'activité plus élevés dans les HSC que dans les cellules différenciées. Ici, nous décrivons un protocole utilisant Verapamil, un inhibiteur de pompe d'efflux, pour mesurer avec précision le m à travers les populations multiples de moelle. L'inhibition résultante de l'activité de pompe est montrée pour augmenter l'intensité de TMRM dans les cellules hématopoïétiques de tige et d'ancêtre (HSPc), tout en la laissant relativement inchangée dans les fractions mûres. Cela met en évidence l'attention particulière à l'activité de teinture-efflux qui est nécessaire lorsque les colorants dépendants de l'état d'œil sont utilisés, et comme écrit et visualisé, ce protocole peut être utilisé pour comparer avec précision soit différentes populations au sein de la moelle osseuse, ou la même population différents modèles expérimentaux.

Introduction

Les cellules souches hématopoïétiques (HSC) sont auto-renouvelantes, multipotentes, et capables de donner naissance à toutes les cellules du sang^1,2. Le métabolisme cellulaire est un régulateur clé de la maintenance HSC, avec des facteurs transcriptionnels, des signaux intrinsèques et le microenvironnement^3,4,5. Le contrôle approprié de la fonction et de la qualité mitochondriales est donc essentiel à l'entretien de HSC^6,7.

Le potentiel de la membrane mitochondriale est un paramètre clé dans l'évaluation des mitochondries car il reflète directement leur fonctionnalité, qui découle de l'équilibre de l'activité de pompage des protons dans la chaîne de transport d'électrons et du flux de protons à travers F ₁/F_O ATP synthase. Ceux-ci sont tous deux nécessaires (selon l'expression des gènes et la disponibilité du substrat) pour la phosphorylation dépendante de l'oxygène d'ADP à L'ATP^8,9. Profitant de l'électronégativité du compartiment mitochondrial, divers colorants potentialométriques ont été développés pour mesurer l'amon. L'un d'eux est la tétramethylrhodamine méthylester perchlorate (TMRM), qui a été largement utilisé pour mesurer la cytométrie de flux dans une variété de cellules¹⁰, y compris les cellules hématopoïétiques tige et progénitrice¹¹.

Les colorants mitochondriaux doivent être utilisés avec une certaine prudence dans les HSC, cependant, parce que la forte activité des pompes à efflux xénobiotiques de ces cellules peut entraîner l'extrusion de colorant¹². En effet, l'extrusion de colorants mitochondriaux tels que Rhodamine 123 a permis aux chercheurs d'isoler les HSC¹³ ou d'identifier les « populations secondaires » du HSC en exploitant l'extrusion différentielle des teintures Hoechst Blue et Hoechst Red^{14, 15}. Il a également été démontré que fumitremorgin E, un bloqueur spécifique du transporteur de la sous-famille G (ABCG2) de la cassette liant l'ATP, n'affecte pas le modèle de coloration de MitoTracker dans les HSPC¹⁶. Après la publication de ces résultats, de multiples études ont été réalisées à l'aide de colorants mitochondriaux en l'absence d'inhibiteurs de la pompe à efflux xénobiotiques, ce qui a donné l'impression répandue que les HSC n'ont qu'un petit nombre de mitochondries à faible niveau^{16. , 17 Annonces , 18}.

Récemment, il a été démontré, cependant, que Verapamil, un inhibiteur à large spectre des pompes d'efflux, modifie de manière significative le modèle de coloration du colorant mitochondrial MitoTracker Vert¹⁹. Cet écart est probablement dû au fait que fumitremorgin E est très sélectif pour Abcg2, tandis que les HSC expriment également d'autres transporteurs tels que Abcb1a (qui n'est que faiblement sensible à Fumitremorgin C)¹⁹. Nous avons également signalé que d'autres colorants mitochondriaux, tels que TMRM, Nonyl acridine orange, et Mitotracker Orange (MTO) présentent les mêmes modèles que Mitotracker Green. Plus important encore, nous avons observé que les modèles cytométriques de flux des HSPC reflètent leur 'm en plus de la masse mitochondriale¹¹.

La prise de colorant TMRM dépend strictement de la charge négative des mitochondries, mais l'accumulation résultante de colorant est en équilibre constant entre sa prise et le dégagement par des pompes d'efflux²⁰. La différence dans l'expression de pompe d'efflux xénobiotique entre HSCs et populations matures de cellules affecte cet équilibre et peut mener aux résultats biaisés. L'utilisation d'inhibiteurs dédiés tels que Verapamil devrait être prise en compte dans l'analyse de l''amon par les colorants potentialométriques. Ici, nous décrivons un protocole modifié pour la mesure précise de l'écoulement par TMRM qui corrige l'activité du transporteur xénobiotique grâce à l'utilisation d'inhibiteurs dédiés.

Protocole

Toutes les méthodes décrites ici ont été approuvées par le Comité institutionnel de soins et d'utilisation des animaux (IACUC) de l'Albert Einstein College of Medicine.

1. Préparation de solutions

1. Tampon de coloration (saline tamponnée de phosphate (PBS) - sérum bovin fœtal (FBS) : Ajouter 10 ml de FBS dans 500 ml d'une solution stérile de PBS.
   REMARQUE: Cette solution peut être stockée à 4 oC pendant au moins un mois dans un état stérile. Avant de commencer les procédures suivantes, mettez un aliquot de cette solution (50 ml) sur la glace.
2. ACK (ammonium-chloride-potassium) tampon de lysing: Placer un aliquot de tampon de lysing ACK (1 ml) sur la glace avant de commencer la procédure.
   REMARQUE: Pour préparer le même tampon non commercial, dissoudre 8,02 g de NH₄Cl, 1 g de KHCO₃ et 37,2 mg de Na₂EDTA en 1 L de H₂O. Ajustez le pH à 7,2-7,4. Conserver jusqu'à 6 mois à température ambiante.
3. Milieu de culture : Ajouter 50 ng/mL de facteur de cellules souches (SCF) et 50 ng/mL de thrombopoiétine (TPO) au milieu sans sérum pour la culture et l'expansion des cellules hématopoïétiques (voir Tableau de matériel pour le milieu commercial recommandé).
4. Solution de stock TMRM : Préparer la solution TMRM (1 M) en dissolvant 5 g de poudre de TMRM dans 10 ml d'éthanol. Entreposez cette solution à -20 oC à l'abri de la lumière.
5. Solution de bouillon de verapamil : Préparer la solution Verapamil (50 mM) en diluant 24 mg de Verapamil dans 1 ml d'éthanol. Stockez cette solution à -20 oC.
6. Solution de stock FCCP : Préparer la solution de carboneilcyanide p-triflouromethoxyphenylhydrazone (FCCP) (1 M) en dissolvant 254 mg dans 1 ml d'éthanol. Entreposez cette solution à -20 oC à l'abri de la lumière.

2. Isolement de moelle osseuse

1. Euthanasiez la souris par inhalation de CO₂ selon les directives institutionnelles et vaporisez les souris avec 70% d'éthanol.
   REMARQUE: Cette étape empêche la contamination des cellules d'intérêt sans compromettre les résultats expérimentaux.
2. À l'aide d'une paire de forceps et de ciseaux pointus, faire un petit snip dans la peau ventrale de la souris et étirer la peau.
3. Extraire le fémur et le tibia tout en prenant soin de ne pas déloger les têtes du fémur car elles contiennent une grande quantité de cellules de moelle osseuse. Placer les os enlevés dans une plaque de 6 puits remplie de 1,5 ml de tampon de coloration.
   REMARQUE: Cette procédure ne nécessite pas de zone stérile.
4. Enlever les muscles des os et couper les extrémités des os permettant la sortie de la moelle osseuse (Figure 1A). Placer les os nettoyés dans de nouveaux puits avec 1,5 ml de tampon de coloration.
   REMARQUE: Les muscles et autres tissus doivent être soigneusement enlevés pour éviter l'engorgement des seringues à l'étape suivante.
5. Rincer la moelle osseuse à l'aide d'une seringue de 3 ml avec une aiguille de 25 G.
   REMARQUE: Continuer à rincer la moelle osseuse jusqu'à ce que l'os devienne blanc (Figure 1B).
6. Recueillir toutes les cellules dans un tube de 1,5 ml, centrifugeuse pendant 5 min à 180 x g, puis jeter le supernatant (Figure 1C).
7. Resuspendre le granule dans 300 'L de glace froide ACK lysing tampon très soigneusement, mis sur la glace pendant 1 min et lyse immédiatement inactive en ajoutant 1 ml de tampon de coloration. Centrifugeuse de 5 min à 180 x g.
   REMARQUE: La pastille de cellules apparaît blanche (Figure 1D). Le nombre total de cellules isolées est d'environ 2-4 x 10⁷.
8. Resuspendre les granulés dans 1 ml de tampon de coloration et de filtre à l'aide d'un bouchon de cellule-passoire (12 x 75 mm², 5 ml de capacité) avec un maillage en nylon de 35 m incorporé pour obtenir des cellules mononucléaires. Après le blocage, garder l'échantillon sur la glace.

3. Immunostaining pour la détection du HSC

1. Préparer le cocktail Lineage (Lin). Dans 400 L de tampon de coloration, ajoutez 4 'L des anticorps biotinilated suivants contre CD3e, CD4, CD8, B220, CD11b, Gr1, Ter119, CD19, Nk1.1, IgM et Il7Ra pour obtenir une dilution finale 1:100.
2. Préparer des anticorps conjugués aux fluorophores (Abs). Dans 400 l de tampon de coloration, ajouter 4 'L de l'Abs suivant pour obtenir une dilution finale 1:100. Streptavidin-Pacific Blue, Sca1-PE/Cy7, c-kit-APC/Cy7, CD48-APC, CD150-PerCP/Cy5.5 et CD34-FITC. Garder dans la glace, à l'abri de la lumière.
3. Centrifuger l'échantillon pendant 5 min à 180 x g,puis jeter le supernatant.
4. Ajouter 400 l l de solution de cocktail Lin à la granule de cellules. Ajouter rapidement 4 oL de CD135-biotinilated Ab. Vortex pour mélanger et incuber pendant 30 min dans la glace.
5. Laver l'échantillon en ajoutant 3 ml de tampon de coloration, faire tourner vers le bas pendant 5 min à 180 x g et jeter le supernatant.
6. Ajouter la solution 400 'L d'Abs. Vortex rapidement pour mélanger et incuber pendant 30 min sur la glace.
7. Laver les échantillons avec 3 ml de tampon de coloration, faire tourner vers le bas pendant 5 min à 180 x g et jeter le supernatant.

4. TMRM Staining

1. Préparer la solution de coloration TMRM. Ajouter 2,2 L de solution de stock TMRM et 1,1 l de Verapamil (2 nM et 50 M comme concentration finale, respectivement) dans 1,1 ml de milieu sans sérum pour la culture et l'expansion des cellules hématopoïétiques (voir Tableau de matériel pour le milieu commercial recommandé) avec TPO et SCF.
   REMARQUE: C'est l'étape la plus importante du protocole. L'addition de verapamil est nécessaire pour bloquer les pompes d'efflux qui sont fortement exprimées dans les HSC s'ils peuvent extrudre TMRM.
2. Resuspendre la moelle osseuse dans 1 ml de solution de coloration TMRM, vortex rapidement et incuber pendant 1 h à 37 oC.
   REMARQUE: La coloration TMRM ne doit pas être lavée. Le contrôle de compensation dédié à l'EP est également suspendu dans 100 L de solution de coloration TMRM, et soumis à l'incubation pendant 1 h à 37 oC après vortex rapide.
3. Filtrer l'échantillon à l'aide d'un bouchon de passeur cellulaire (12 x 75 mm², 5 ml de capacité) avec un maillage en nylon de 35 m incorporé pour éviter le colmatage du cytomètre d'écoulement.
   REMARQUE: La coloration TMRM augmente la possibilité de formation de sabots dans l'échantillon. Il est recommandé de filtration de l'échantillon juste avant les analyses d'écoulement.
4. Ajouter 1 'L de 4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) pour exclure les cellules mortes par cytométrie de flux.

5. Acquisition par Cytomètre de flux

1. Exécuter l'échantillon de moelle osseuse et d'acquérir au moins 1 x 10⁶ événements.
2. Mettre en place la stratégie de gating pour identifier les différentes populations hématopoïétiques (Figure 2).
   1. Afficher les cellules mononucléaires de moelle osseuse vivante (BM-MNCs), DAPI^- fraction, dans la parcelle pour Pacific Blue pour identifier CD135^-Lin^- (Lin⁾et Lin^- fractions.
   2. Terrain Lin^- fraction pour APC/Cy7 (c-kit) contre PE/Cy7 (Sca-1) pour identifier les progéniteurs multipotents (MPP) fraction, comme c-kit et Sca-1^.
   3. Parcelle fraction MPP pour APC (CD48) contre PerCP/Cy5.5 (CD150) pour identifier la fraction HSC, comme CD150^et CD48^.
   4. Afficher la fraction HSC pour FITC (CD34) pour diviser CD34^--HSC et CD34^--HSC.
3. Acquérir l'intensité TMRM (canal PE) dans chaque population.
4. Après l'acquisition, ajouter à l'échantillon 1 L de FCCP pour obtenir la concentration finale de 1 mm et incuber à 37 oC pendant 5 min, puis acquérir 1 x 10⁶ événements.
   REMARQUE: La FCCP est un découpleur mitochondrial qui est utilisé pour dissiper l''Am. Il est utilisé comme contrôle expérimental pour confirmer que la coloration TMRM fonctionne correctement. Après l'administration de la FCCP, l'intensité du TMRM devrait être considérablement réduite (figure 3A).
5. Analyser les données qui normalisent l'intensité moyenne de l'EP de chaque population par l'intensité de l'EP de tous les BM-MNC.

Résultats

Le protocole décrit ci-dessus permet l'isolement facile des BM-MNC à partir d'un modèle de souris. La figure 1 résume les principales étapes du protocole : isolement osseux, chasse d'eau de la moelle osseuse, lyse des globules rouges et coloration des anticorps, suivie d'une coloration TMRM pour mesurer le potentiel de la membrane mitochondriale dans une population hématopoïétique spécifique. .

Les BM-MNC contiennent plusieurs populations cellulaires, y c...

Discussion

La mesure potentielle de membrane mitochondriale est une pierre angulaire de l'analyse et de l'évaluation des mitochondries, qui sont critiques à l'état métabolique de la cellule. Ici, nous décrivons un protocole pour l'analyse de la coloration de 'm par TMRM. TMRM est un colorant fluorescent à permeant cellulaire qui s'accumule dans les mitochondries actives en raison de l'Am, et ses niveaux respectifs restent en équilibre entre les compartiments extracellulaires, cytoplasmiques et mitochondriaux

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
ACK lysing buffer	Life Technologies	A1049201
B220-biotin	BD Bioscience	553086
CD3e-biotin	Life Technologies	13-0031-85
CD4-biotin	Fischer Scientific	BDB553782
CD8-biotin	Life Technologies	13-0081-85
CD11b-biotin	BD Bioscience	553309
CD19-biotin	BD Bioscience	553784
CD34-FITC	eBioscience	11-0341-85
CD48-APC	eBioscience	17-0481-82
CD135-biotin	eBioscience	13-1351-82
CD150-PerCP/Cy5.5	Biolegend	115922
c-kit-APC/Cy7	Biolegend	105826
Cyclosporin H	Millipore Sigma	SML1575-1MG
DAPI solution (1 mg/mL)	Life Technologies	62248
Fetal Bovine Serum (FBS)	Denville	FB5001-H
FCCP	Millipore Sigma	C2920-10MG
Gr1-biotin	Biolegend	108404
IgM-biotin	Life Technologies	13-5790-85
Il7Rα-biotin	eBioscience	13-1271-85
Nk1.1-biotin	Fischer Scientific	BDB553163
Phosphate buffered saline (PBS)	Life Technologies	10010023
Sca-1-PE/Cy7	eBioscience	25-5981-81
SCF murine	PEPROTECH	250-03-10UG
StemSpan SFEM medium	STEMCELL technologies	9605
Streptavidin-Pacific Blue	eBioscience	48-4317-82
Ter119-biotin	Fischer Scientific	BDB553672
TMRM	Millipore Sigma	T5428-25MG
TPO	PEPROTECH	315-14-10UG
Verapamil hydrochloride	Millipore Sigma	V4629-1G