Ein automatisierter Differential-Nuklearfärbungstest zur genauen Bestimmung der Mitocan-Zytotoxizität

Zusammenfassung

Das Protokoll beschreibt einen schnellen, hohen Durchsatz, zuverlässigen, kostengünstigen und unvoreingenommenen Test zur effizienten Bestimmung der Zelllebensfähigkeit. Dieser Test ist besonders nützlich, wenn die Mitochondrien der Zellen geschädigt wurden, was andere Assays stört. Der Test verwendet die automatisierte Zählung von Zellen, die mit zwei Kernfarbstoffen – Hoechst 33342 und Propidiumiodid – befleckt sind.

Zusammenfassung

Der Beitrag der Mitochondrien zur onkogenen Transformation ist ein Thema von großem Interesse und aktiver Studie. Da das Feld des Krebsstoffwechsels komplexer wird, wird das Ziel, Mitochondrien mit verschiedenen Verbindungen anzugreifen, die mitochondriale Schäden verursachen (sogenannte Mitocans), immer beliebter. Leider benötigen viele bestehende Zytotoxizitätstests, wie z. B. solche, die auf Tetrazoliumsalzen oder Resazurin basieren, funktionelle mitochondriale Enzyme für ihre Leistung. Der Schaden, der durch Verbindungen verursacht wird, die auf Mitochondrien abzielen, beeinträchtigt oft die Genauigkeit dieser Assays. Hier beschreiben wir ein modifiziertes Protokoll, das auf Differentialfärbung mit zwei fluoreszierenden Farbstoffen basiert, von denen einer zellpermeant (Hoechst 33342) und der andere nicht (Propidiumiodid) ist. Der Unterschied in der Färbung ermöglicht es, lebende und abgestorbene Zellen zu diskriminieren. Der Assay ist für die automatisierte Mikroskopie und Bildanalyse zugänglich, was den Durchsatz erhöht und Verzerrungen reduziert. Dies ermöglicht auch die Verwendung des Assays in High-Throughput-Manier mit 96-Well-Platten, so dass es eine praktikable Option für Drogenentdeckungbemühungen, vor allem, wenn die betreffenden Medikamente haben ein gewisses Maß an Mitotoxizität. Wichtig ist, dass die Ergebnisse des Hoechst/PI-Färbetestes eine erhöhte Konsistenz aufweisen, sowohl mit Trypan-Blau-Ausschlussergebnissen als auch zwischen biologischen Replikationen, wenn der Test mit anderen Methoden verglichen wird.

Einleitung

Der erste Schritt zur Identifizierung wirksamer Krebsbehandlungen ist die Auswahl eines robusten, unvoreingenommenen Zytotoxizitäts-Assays, der verwendet werden kann, um die Wirkung der Behandlung zu untersuchen. Eine häufige Wahl für Versuche mit niedrigem Durchsatz ist der Ausschluss von Trypan-Blaufarbstoff enthäupfen zellendes. Diese Methode wird bevorzugt, weil sie eine relativ unvoreingenommene Methode zur Quantifizierung des Zellüberlebens ermöglicht. Trypan blau diffundiert passiv in Zellen, deren Membranen kompromittiert sind, aber es wird effektiv daran gehindert, in gesunde Zellen einzudringen¹. Der Quotient der lebenden Zellen und der Gesamtzellen stellt die prozentuale Lebensfähigkeit dar, was auf die Wirksamkeit der Behandlung hinweist. Der größte Nachteil des Trypan-Blau-Assays ist, dass er für Methoden mit hohem Durchsatz schlecht geeignet ist. Es hat ein relativ niedriges Signal-Rausch-Verhältnis und längere Färbung kann zu Artefakten aufgrund der Färbung lebensfähiger Zellen führen. Folglich wird Trypan-Blau-Ausschluss in der Regel, aber nicht immer², auf manuelle Zählung reduziert. Dies macht es zu langsam und führt die starke Möglichkeit der Voreingenommenheit aufgrund der subjektiven Beurteilung des Forschers (es sei denn, blendende oder unabhängige Zählungen verwendet werden, die den Labordurchsatz weiter reduzieren). Im Allgemeinen ist der Durchsatz dieses Assays nicht ausreichend für die moderne Entdeckung von Medikamenten.

Viability Assays, die im Allgemeinen einen viel höheren Durchsatz haben, ermöglichen es forschern, diese Einschränkung zu umgehen, haben aber erhebliche Vorbehalte (siehe Tabelle 1). Diese Methoden lassen sich in der Regel in zwei Gruppen unterteilen. Eine Gruppe besteht aus kolorimetrischen Assays, die auf der Funktion zellulärer Redoxenzyme basieren. Farblose oder nicht fluoreszierende Substrate werden in lebendige Produkte umgewandelt, die mit einem Spektralphotometer quantifiziert werden können. Klassische Beispiele sind Tetrazoliumsalze (MTT, WST-1, XTT, etc.) und Resazurin. Diese Kategorie umfasst auch lumineszierende Assays, die Luziferin verwenden, um ATP-Niveau zu bewerten. Assays dieser Art haben die zugrunde liegende Einschränkung, dass sie den Zellstoffwechsel messen, was nicht die zelluläre Lebensfähigkeit per se ist. Es ist durchaus üblich, dass Zellen unter widrigen Bedingungen still werden, aber immer noch die Fähigkeit behalten,^3,4,5zu teilen. Zum Beispiel, Krebsstammzellen sind oft relativ metabolisch^{ruhend 6,7,8,9}, und sind wahrscheinlich schwierig, mit diesen Techniken zu assay. Die Wirksamkeit von Behandlungen, die die mitochondriale Funktion schädigen, wie die meisten Mitocans, wird wahrscheinlich ebenfalls deutlich überschätzt.

Eine alternative Methode nutzt die chemischen Eigenschaften verschiedener Substanzen, die es ihnen ermöglichen, biologische Membranen entweder zu kreuzen oder nicht. Ein Beispiel sind nukleare Flecken wie SYTOX oder Propidiumiodid (PI). Diese Kategorie umfasst auch Assays, die im Konzept ähnlich sind, aber in ihrer Funktion unterschiedlich sind, wie z. B. der Lactatdehydrogenase (LDH)-Assay, der die Freisetzung von LDH in das extrazelluläre Milieu als Indikator für zelluläre Nekrose misst (Abbildung 1,Tabelle 1). Diese Assays sind eher in der Lage, zwischen metabolisch inaktiven und abgestorbenen Zellen zu unterscheiden.

Assay/Farbstoff	Typ(e) des zelltoten Todes erkannt	Notwendige Ausrüstung	Hauptmerkmale
MTT, CKK-8, Alamar Blue (Resazurin)	Apoptose/Nekrose	Spektrophotometer	Preiswert, schnell; Endpunkt-Assay; abhängig von der Enzymaktivität (ausschließlich mitochondrial bei MTT) und unterscheidet nicht zwischen den Arten des Zelltodes1,10
LDH-Freigabe	Nekrose	Spektrophotometer	Schnell, unabhängig von der Aktivität mitochondrialer Enzyme; teuer für Tests mit hohem Durchsatz; erkennt nekrotische Zellen mit compromisierter Plasmamembran11,12
Trypan Blue (TB)	Apoptose/Nekrose	Mikroskop	Zellimpermeant; unterscheidet nicht zwischen den Arten des Zelltodes; mühsam und nicht geeignet für Hochdurchsatz-Screening; schwieriger zu verwenden mit anhaftenden Zellen; anfällig für subjektive Beurteilung des Anwenders, gilt aber als Standard-Zelllebensfähigkeitsmessmethode13
Acridine orange (AO)	Apoptose/Nekrose/	Fluoreszenzmikroskop	Ein Nukleinsäurefarbstoff mit einzigartigen spektralen Eigenschaften kann zwischen Apoptose und Nekrose/Nekroroptose14 unterscheiden
	Nekrotose
Hoechst 33342, DAPI	Apoptose	Fluoreszenzmikroskop oder Durchflusszytometer	Zelldurchlässig; für sich allein ungeeignet, den Zelltod zu überwachen; nützlich für die Co-Färbung; kann verwendet werden, um Chromatinkondensation und Kernfragmentierung bei früher Apoptose zu bewerten; kann mit Propidiumjodid gepaart werden, um Apoptose von Nekrose zu unterscheiden15,16
Propidium Iodid (PI)	Späte Apoptose/Nekrose	Fluoreszenzmikroskop oder Durchflusszytometer	Zellimpermeant Intercalator; erkennt sowohl späte Apoptose als auch Nekrosemodi des Zelltodes17. Giftig und durchlässig nach langen Inkubationszeiten18

Tabelle 1. Liste der Zytotoxizitäts-Assays. Cytotoxizität-Assays, von denen einige in dieser Studie verwendet wurden, wurden zusammen mit der kurzen Beschreibung ihrer wichtigsten Merkmale aufgeführt.

Jüngste Studien haben gezeigt, dass der mitochondriale Stoffwechsel bei einigen Krebsarten verändert wird^{19,20,21,22,23,24,25}. Zum Beispiel, akute myeloische Leukämien (AML) haben gezeigt, dass ihre mitochondriale Masse, mtDNA-Gehalt und mitochondriale Atmung zu upregulieren, um ihre Energieanforderungen zu erfüllen^19,26,27. Auf der anderen Seite sind einige solide Tumoren durch mitochondriale Dysfunktion, oder besser gesagt "metabolische Reprogrammierung", wie Downregulation von mitochondrialen Proteinen in OXPHOS beteiligt oder verminderte mtDNA-Gehalt, die mit Tumor-Invasivität, metastasierendem Potenzial und Resistenz gegen Apoptose-induzierende Medikamente verbunden ist^28,29. Darüber hinaus hat in letzter Zeit ein erhöhtes Interesse an der Verwendung mechanistisch vielfältiger Verbindungen, die mitochondriale Funktion beeinflussen (im Allgemeinen mitocans³⁰genannt), als mögliche Therapien für bestimmte Krebsarten. Diese Medikamente zielen auf ATP-Synthese, mitochondriale DNA, OXPHOS, und ROS-Produktion, sowie pro-apoptotische und anti-apoptotische Proteine im Zusammenhang mit Mitochondrien^30,31. Mehrere Studien haben gezeigt, dass dieser Ansatz hat erhebliche Versprechen^19,32,33,34. Diese metabolischen Abweichungen in der Krebszellbiologie oder mitochondrien-targeting-Behandlungen können jedoch die konventionellen Lebensfähigkeitstests, die auf mitochondrialer Funktionalität basieren, signifikant beeinflussen.

Hier wird ein optimiertes Protokoll für einen differenziellen kerniellen Färbetest beschrieben. Das Protokoll ermöglicht eine schnelle und genaue Bestimmung der Zytotoxizität von Mitocanen oder deren Kombinationen mit anderen Verbindungen. Hoechst 33342 ist ein zellpermeant Kernfarbstoff, der Zellmembranen leicht kreuzt, um DNA zu färben, so dass die Gesamtzellzahl ermittelt werden kann. Durch die Co-Färbung mit PI, die nur in die Kerne abgestorbener Zellen eindringt, kann der Anteil der lebenden (nur Hoechst) und toten (mit beiden) Zellen genau bestimmt werden. Dieses Protokoll verfeinert den veröffentlichten Assay³⁵ durch Hinzufügen eines Schritts zur Optimierung der Farbstoffkonzentration (durch Querverweise mit orthogonalen Trypan-Blau-Verfahrens) und Zentrifugieren der Platte vor der Bildgebung. Da viele Zelllinien halbhaft oder suspendiert sind, erhöht die Zentrifugation den Anteil der abgebildeten Zellen und verbessert die Genauigkeit erheblich. Der Test hat mehrere Vorteile, einschließlich, dass Färbung nicht die Entfernung von Medien oder Waschen erfordert. Die Farbstoffmischung ist auch kostengünstig, einfach zu zubereiten und kompatibel mit Mehrkanal-/Roboter-Pipettiersystemen.

Nachdem Zellen gefärbt wurden, werden sie mit einem automatisierten Mikroskop abgebildet. Dies hat den zusätzlichen Vorteil, eine permanente Aufzeichnung der Bilder zu erstellen, die später neu analysiert werden kann und die Auswirkungen bestimmter Verbindungen können durch visuelle Inspektion von aufgenommenen Bildern neu bewertet werden. Sobald Bilder erhalten wurden, können Zellen entweder manuell oder mithilfe eines von mehreren Softwarepaketen gezählt werden, einschließlich freier (z. B. ImageJ, CellProfiler, etc.) und kommerzieller Software (z. B. Metamorph, Gen5 usw.). Automatisierte Zellzählung ist im Allgemeinen vorzuziehen, da ordnungsgemäß entwickelte automatisierte Zellzählpipelines genauer und weniger verzerrt sind als manuelle Zählungen. Sie ignorieren auch leichter Zellablagerungen oder unlösliche Komplexe. Die Entwicklung dieser Rohrleitungen ist im Allgemeinen einfach und wird durch die Effizienz der verwendeten Flecken vereinfacht. Die Ausgabe ist quantitativ, da die tatsächliche Anzahl der abgestorbenen Zellen automatisch in Bezug auf die Gesamtzahl der Zellen berechnet wird und verschiedene Schwellenwerte angewendet werden können, um die Stringenz der Erkennung zu erhöhen oder zu verringern³⁵. Für den Komfort sind optimierte Parameter für das Zählen von Zellen mit Gen5 v. 3.00 softwarekompatiblem Cytation 5 Cell Imaging Multi-Mode Reader enthalten.

Protokoll

1. Zytotoxizitätstest: Setup

1. Herstellung von Lösungen von Verbindungen von Interesse bei gewünschten Konzentrationen in den entsprechenden Medien (serumfrei oder 1, 2,5 oder 5% FBS RPMI-1640).
   1. Zur Messung der Zytotoxizität einer einzelnen Verbindung (z. B. zur Bestimmung der effektiven Dosen) bereiten Sie Verbindungen in 2x Endkonzentration vor.
   2. Zur Messung der Zytotoxizität von zusammengesetzten Kombinationen, bereiten Sie Verbindungen in 4x Endkonzentration vor.
   3. Bereiten Sie nur Lösungsmittelsteuerungen vor, indem Sie die gleiche Menge Lösungsmittel mit dem entsprechenden Medium mischen. Wenn z. B. in DMSO und Methanol gelöste Prüfstoffe hergestellt werden, können Sie für jedes Lösungsmittel nur lösungsmittelhaft steuern.
2. Sammeln Sie Zellen aus Kulturschale oder Kolben in einem 15 ml konischen Rohr.
3. Übertragen Sie 10 l Zellsuspension in ein Mikrozentrifugenrohr und färben Sie mit 10 l 0,4% Trypanblau. Verwenden Sie ein Hämozytometer, um lebensfähige und nicht lebensfähige Zellen für jede Zellquelle zu zählen.
4. Pelletzellen bei 200 g für 5 min. Aspirat oder Dekanat überstand.
5. Zellpellet in assay-geeigneten Medien (serumfrei oder 1, 2,5, 5% FBS RPMI-1640) bei einer Zelldichte von 3*10⁵ Zellen/ml wieder aufsetzen.
   ANMERKUNG 1: Die Zelldichte von 3*10⁵ Zellen/ml bietet eine Sädichte von 15.000 Zellen/Well. Die Saatdichte ist ein wichtiger Parameter und sollte idealerweise vor dem Experiment vordefiniert werden. Die Saatdichte sollte 1) die Zellgröße berücksichtigen – in der Regel werden größere Zellen mit einer niedrigeren Dichte gesät; 2) Behandlungsdauer – Zellen werden in der Regel mit einer niedrigeren Dichte für Experimente gesät, die länger dauern; und 3) Zellteilungsrate – Zellen mit einer höheren Teilungsrate werden mit einer niedrigeren Dichte gesät. Spezifische Beispiele für optimierte Sädichten: K562-Zellen, größer, 24 h Dauer – 10.000 Zellen/Well; MOLM-13-Zellen, moderate Größe, 24 h Behandlung – 15.000/well; MOLM-13-Zellen, 48 h Behandlung – 8.000/well; kleine gesunde periphere mononukleäre Blutzellen (PBMCs), 24 h Behandlung – 50.000/gut; primäre AML-Zellen, 24-h-Behandlung – 15.000-20.000/well.
   ANMERKUNG 2: Das Vorhandensein von FBS in Medien kann die Aktivität der Verbindungen beeinflussen. Die Verringerung der FBS-Konzentration kann die Interpretation der Assay-Ergebnisse vereinfachen, aber auch die physiologische Genauigkeit verringern.
6. Samen 50 l Zellsuspension von Schritt 1,5 in jeden Brunnen einer 96-Well-Platte mit einer Mehrkanalpipette.
7. Fügen Sie Verbindungen wie folgt hinzu:
   1. Für einzelne zusammengesetzte Assays fügen Sie jedem Bohrgut 50 l 2x Compoundlösung hinzu. Für Lösemittel-Kontrollbrunnen 50 l Testmedien hinzufügen, die das Lösungsmittel in der 2x-Konzentration enthalten.
   2. Für Kombinationstests fügen Sie jeweils 25 L der Verbindung (4x Lösungen) in jeden Brunnen ein. Für einzelne Compound-Kontroll-Bohrungen, fügen Sie 25 l 4x Compound-Lösung und 25 l Testmedium. Für Lösemittel-Kontrollbrunnen 50 l Prüfmedium oder Prüfmedium hinzufügen, das das Lösungsmittel enthält.
      ANMERKUNG 1: Die endgültige Konzentration von DMSO sollte 0,5 % nicht überschreiten.
      ANMERKUNG 2: Es wird empfohlen, die Medien, die die Verbindungen enthalten, mit der Pipette hinzuzufügen, die die Wand jedes Brunnens aufgrund des geringen Volumens berührt.
8. Tippen Sie vorsichtig auf die Platte, um das Mischen des Inhalts der Brunnen zu gewährleisten.
9. Inkubieren Sie Platten bei 37 °C in einer befeuchteten 5%_{CO2-Atmosphäre} für eine angemessene Zeit, z.B. 24 h.

2. Cytotoxizität Assay: Färbung mit Hoechst 33342 und Propidium Iodid

1. Bereiten Sie 10x Färbelösung vor. Diese Lösung muss vor jedem Experiment neu vorbereitet werden, sie kann nicht gespeichert werden. Die endgültigen Farbstoffkonzentrationen sollten vor dem Experiment bestimmt werden.
   1. Bei Leukämie-Zelllinien und primären Leukämiezellen enthält 1 ml 10x Färbepuffer 10 l von 20 mM Hoechst 33342 und 50 l von 1 mg/ml Propidiumjodid in sterilem PBS (Endkonzentrationen: Hoechst 33342 20 'M, PI 5 g/ml).
   2. Für gesunde PBMCs enthält 1 ml 10x Färbepuffer 10 l mit 20 mM Hoechst 33342 und 10 l mit 1 mg/ml Propidiumjodid in sterilem PBS (Endkonzentrationen: Hoechst 33342 20 mM, PI 1 g/ml).
      HINWEIS: Die endgültige Konzentration von Propidiumjodid muss vor den Experimenten bestimmt werden. Die Zellen sollten mit einer Reihe von PI-Konzentrationen (1, 2,5, 5 g/ml) getestet werden, und dann sollte die von Hoechst/PI berechnete Lebensfähigkeit mit der Lebensfähigkeit verglichen werden, die über Trypanblau gemessen wird. Die oben aufgeführten PI-Konzentrationen wurden auf der Grundlage der Lebensfähigkeit der Zielzellen in Medienkontrollbrunnen ausgewählt (über 90 % bei Leukämie-Zelllinien, über 70 % für gesunde PBMCs).
      VORSICHT: Hoechst 33342 und Propidiumiodid sind potenzielle Karzinogene. Tragen Sie beim Umgang mit ihnen geeignete persönliche Schutzausrüstungen.
2. Verwenden Sie nach der Inkubation eine Mehrkanalpipette, um jedem Bohrwert 10 L mit 10x Färbepuffer hinzuzufügen.
   HINWEIS: Um Kreuzkontaminationen zu vermeiden, stellen Sie sicher, dass die Pipettenspitzen das Medium nicht berühren.
3. Tippen Sie vorsichtig auf die Platte, um Blasen zu mischen und zu löschen. Bei 37 °C für 15 min.
4. Zentrifugieren Sie die Platte bei 200 g für 4 min, um alle Zellen an den Boden der Platte zu bringen. Wischen Sie den Boden der Platte vorsichtig mit einem feuchten Kimwipe ab, um Fasern und/oder Schmutz zu entfernen, die die Bildgebung stören.
   ANMERKUNG 1: Die Zentrifugierung der Platte stellt die höchsten Chancen sicher, dass alle Zellen im Bild erfasst werden. Oft lösen sich abgestorbene Zellen und schweben, was irreführende Werte der Zytotoxizität liefert. Zentrifugation mildert diesen Effekt.
   ANMERKUNG 2: Die Platte sollte so schnell wie möglich nach der Zentrifugation abgebildet werden, idealerweise innerhalb von 15 min. Zentrifugation kann die Selektivität der PI-Färbung reduzieren und es den Zellen ermöglichen, langsam Propidiumjodid anzusammeln. Die Verbesserung der Genauigkeit, die durch die Visualisierung der abgestorbenen Zellen gewonnen wird, überwiegt den leichten Anstieg der PI-Färbung. Es wird empfohlen, die Bildgebung innerhalb von 1 h zentrifugierend abzuschließen.

3. Cytotoxizität Assay: Datenerfassung

1. Stellen Sie die Software für den automatisierten Mikroskop-/Plattenbildner ein, um Diefluoreszenz sowohl für Hoechst 33342 (Anregungsmaximum 350 nm, Emissionsmaximum 461 nm) als auch für PI (Anregungsmaximum 493 nm, Emissionsmaximum 636 nm) zu erkennen. Erfassen Sie Bilder für jeden Brunnen in beiden Kanälen.
2. Mit der Software (wie CellProfiler, einem kostenlosen Bildanalysestudio basierend auf MatLab http://cellprofiler.org/, ImageJ oder proprietärer Software wie Gen5) zählen die Zellen in jedem Brunnen in jedem Kanal.
   HINWEIS: Da jede Zelle mit Hoechst 33342 gefärbt werden sollte und abgestorbene Zellen mit PI befleckt werden sollten, stellt das Verhältnis von Totzutot zu allen den Bruchteil der toten Zellen dar. Wenn beispielsweise die automatisierte Anzahl in unbehandelten Proben 467 Zellen zeigt, die mit PI (tote Zellen) und 2335 Zellen mit Hoechst 33342 (Gesamtzellen) befleckt sind, beträgt der tote Anteil 0,2 oder 20 %. Dieser Wert wird dann mit einer identisch behandelten Probe verglichen, in der die Behandlung verwendet wurde.
3. Detaillierte Beschreibung der Hoechst/PI Datenerfassung mit Cytation5 Cell Imaging Multi-Mode Reader und Gen5 v. 3.00 Software:
   1. Stellen Sie den Cytation5 Multimode-Plattenleser/-bildwands auf Bildzellen in flachen unteren, 96-well, generischen schwarzen Kunststoffplatten ein.
   2. Legen Sie ein Imaging-Protokoll fest, um die standardmäßigen Filtersätze DAPI und Texas Red zu verwenden. Nehmen Sie Bilder in der Brunnenmitte mit einem 4-fachen Vergrößerungsobjektiv auf. Verwenden Sie keinen Offset (X/Y oder Z). Verwenden Sie die folgenden Bildeinstellungen: DAPI – LED - 10, Integrationszeit - 99, Gain - 0; Texas Red – LED - 8, Integrationszeit - 950, Gewinn - 18. Automatische Stellik mit dem DAPI-Signal durchführen; es sollte keinen Versatz bei der Fokussierung zwischen den Kanälen geben.
   3. Bildanalyse mit Gen5-Software v 3.00 durchführen. Definieren Sie in den Softwareeinstellungen Zellen als Formen zwischen 5 und 25 m größe. Schließen Sie primäre Kantenobjekte aus und teilen Sie berührende Objekte, indem Sie die spezielle Option "Berührende Objekte teilen" aktivieren.  Als Nächstes verarbeiten Sie das Bild, um den Hintergrund zu entfernen (dunkle Hintergrundsubtraktion), wenden Sie eine Kernmaske (Schwellenwert DAPI >= 6000 AE) an und zählen Sie Objekte. Führen Sie eine Subpopulationsanalyse basierend auf PI-Färbung (Schwellenwert Texas Rot >= 5000 AE) durch, und zählen Sie Objekte. Die Zelllebensfähigkeit % ist definiert als (1 - .

Ergebnisse

Das oben genannte Protokoll wurde mit OCI-AML2-Zellen entwickelt, die als repräsentative akute myeloische Leukämie-Zelllinie genommen wurden. AML ist durch abnorme Proliferation undifferenzierter und nicht-funktioneller hämatopoetischer Zellen im Knochenmark^{gekennzeichnet 26}. Trotz der jüngsten Entwicklungen in der AML-gezielten Therapie, ist der Standard der Pflege seit mehreren Jahrzehnten unverändert geblieben, und besteht aus Induktionstherapie (in der Regel bestehend aus drei Tagen Anthr...

Diskussion

Obwohl das Protokoll für Hoechst/PI Cytotoxizität-Assay robust ist und vergleichsweise wenig Hands-on-Zeit erfordert, gibt es mehrere experimentelle Details, die sehr wichtig sind, um genaue Ergebnisse zu gewährleisten. Zunächst ist darauf zu achten, dass die DMSO-Konzentration unter 0,5 % (v/v) bleibt. Es ist allgemein vereinbart, dass die Exposition gegenüber selbst niedrigen Dosen von DMSO die Morphologie und Anhaftung von Zellen wesentlich verändern und die Zellzyklusprogression signifikant verzögern kann

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
2-Deoxy-D-glucose/2-DG	Chem-Impex	50-519-067
3-bromo-pyruvate	Alfa Aesar	1113-59-3
96-Well plates	Greiner Bio-One	655090	Black or clear flat-bottomed 96-well plates
Alamar blue HS cell viability reagent (100mL)	Thermo Fisher	A50101
Countess II automated cell counter	Thermo Fisher
Cytation 5 Cell Imaging Multi-Mode Reader	BioTek
Hoechst 33342	Thermo Fisher	62249	20 mM solution; final concentration 1:1,000
HyClone fetal bovine serum	GE Healthcare	#25-514
m-chlorophenylhydrazone/CCCP	Sigma Aldrich	C2759
PBS tablets	Thermo Fisher	BP2944100	1 tablet + 200 mL of sterile water = 1x PBS solution
Penicillin-Streptomycin-Glutamine (100X)	Gibco	10378016
Pierce LDH assay kit	Thermo Fisher	50-103-5952
Propidium Iodide	Thermo Fisher	50-596-072	Dry powder; stock 1 mg/mL in PBS; final concentration 5 µg/mL (leukemia cells), 1 µg/mL (normal PBMCs)
Rotenone	Ark Pharm	AK115691
RPMI-1640 Medium With L-glutamine and sodium bicarbonate, liquid, sterile-filtered, suitable for cell culture	Sigma Aldrich	R8758-500ML
Thiazolyl blue tetrazolium bromide	ACROS Organics	AC158990010
Trypan blue stain (0.4%)	Gibco	15250-061
Cell lines
K562	ATCC	CCL-243	CML cell line
MOLM-13	ATCC		AML cell line
MOLT-4	ATCC	CRL-1582	ALL cell line
OCI-AML2	ATCC		AML cell line