Betrieb der transversalen Aortenverengung mit resorbierbarer Naht zur Erlangung einer transienten Myokardhypertrophie

Zusammenfassung

Dieses Protokoll stellt eine verbesserte Methode zur Erlangung einer transienten myokardischen Hypertrophie mit resorbierbarer Naht dar, die nach dem Entfernen der Drucküberlastung eine abnehmende linksventrikuläre Hypertrophie simuliert. Es könnte für die Studien über myokardische hypertrophe Vorbedingungen wertvoll sein.

Zusammenfassung

Basierend auf zweimal transversalen Aortenverengungen (TACs) bei Mäusen ist nachgewiesen, dass myokardiale hypertrophe Vorbedingungen (MHP) die Kardiomyozytenhypertrophie dämpfen und das Fortschreiten der Herzinsuffizienz verlangsamen können. Für Anfänger ist das MHP-Modell jedoch in der Regel recht schwierig zu etablieren, da die technischen Hindernisse im Beatmungsbetrieb, das wiederholte Öffnen der Brust und die Blutung durch Entbandierung auftreten. Um dieses Modell zu erleichtern, die chirurgische Erfolgsrate zu erhöhen und die Inzidenz von Blutungen zu reduzieren, haben wir für die erste TAC-Kämmung mit einer lüfterfreien Technik auf resorbierbare Nähte umgestellt. Mit einer 2-wöchigen resorbierbaren Naht, Wir zeigten, dass dieses Verfahren erhebliche Myokardhypertrophie in 2 Wochen verursachen kann; und 4 Wochen nach der Operation wurde die Myokardhypertrophie fast vollständig auf die Grundlinie zurückgefallen. Mit diesem Protokoll konnten die Bediener das MHP-Modell problemlos mit einer geringeren Betriebssterblichkeit beherrschen.

Einleitung

Ischämische Vorbedingung ist ein Phänomen, das kurze nicht-tödliche Episoden von Ischämie und Reperfusion ins Herz induziert und die Fähigkeit hat, Die Myokardverletzung drastisch zu reduzieren¹. Angesichts der offensichtlichen klinischen Implikationen der ischämischen Vorbedingungen, wie die Begrenzung des Myokardinfarkts Größe² und die Unterdrückung ventrikulärer Tachyarrhythmien nach myokarddialer Revaskularisation^3,gab es viele Forschungen, um die Mechanismen zu sezieren, die kardioprotektive Effekte durch Vorkonditionierung^4,5induziert. Im Gegensatz dazu haben andere nicht-ischämische Arten der Vorkonditionierung relativ wenig Beachtung gefunden. Herzhypertrophie kann bei Patienten mit Aortenstenose stumpf werden, die aortenklappenersatz durchläuft⁶. Wo immer der Zustand der pathologischen Myokardhypertrophie existiert, wird das Prinzip der Vorkonditionierung selten gemeldet.

1991 erstellten Rockman et al. zunächst ein Mausmodell der linksventrikulären Hypertrophie durch transversale Aortenverengung (TAC)⁷. Durch die zweimalige Durchführung von TAC bei Mäusen haben wir zuvor bewiesen, dass myokardiale hypertrophe Vorbedingungen (MHP) zu einer transienten hypertrophen Stimulation im Herzen führen und dadurch das Herz in Zukunft resistenter gegen anhaltenden hypertrophen Stress machen⁸. Die Eigenschaften des MHP-Modells wurden durch Ultraschall-Biomikroskop und hämodynamische Bewertung⁹validiert. Die wichtigsten Punkte bei der Konstruktion des Modells waren die dreimale Thorakotomie, die TAC für eine Woche, das Entbanden für eine Woche und die sekundäre TAC für 6 Wochen. Allerdings kann die Entbupinierung Blutungen verursachen, was es schwierig machte, von Anfängern gemeistert zu werden und schwer populär zu werden. Darüber hinaus ist es auch eine technische Herausforderung, Mäuse zu intubieren. Unsachgemäße Intubation kann Trachealverletzungen, Pneumothorax und sogar den Tod bei Mäusen verursachen. Daher ist es notwendig und wertvoll, einige Verfahren beim Erstellen des MHP-Modells zu verbessern.

Um die Schwierigkeit des Modells zu reduzieren und seinen Erfolg zu steigern, haben wir für die erste TAC auf resorbierbare Nähte umgestellt und den Erfolg des Modells überwacht, indem wir den Druckgradienten über die Aortenverengung unter echokardiographie¹⁰gemessen haben. Basierend auf unserem vorläufigen Experiment wäre es schwierig, bei Mäusen mit einem zu niedrigen Druckgradienten eine ausreichende Myokardhypertrophie auszulösen, während Mäuse mit einem zu hohen Druckgradienten eine akute Herzinsuffizienz entwickeln oder sogar sterben würden. Der ideale Druckgradient für das Modell reicht von 40–80 mmHg¹¹. Darüber hinaus stützte sich dieses Experiment nicht auf ein Beatmungsgerät, das effektiv beatmungsbezogene technische Manipulationen und Verletzungen vermeiden konnte¹².

Protokoll

Alle Verfahren wurden gemäß den Richtlinien der Pflege und Verwendung von Labortieren durchgeführt, die von den US National Institutes of Health (NIH-Publikation Nr. 85-23, überarbeitet 1996) veröffentlicht wurden. C57BL/6J männliche Mäuse (8–10 Wochen, 20–25 g) wurden vom Animal Center der South Medical University zur Verfügung gestellt.

1. Präoperative Zubereitung

1. Drücken Sie die Spitze einer 25 G Nadel mit einem Nadelhalter ab und stumpfen Sie sie mit einem harten Gegenstand wie dem Halter ab.
2. Führen Sie eine 5:0-Absorber-Naht durch die Nadel und kurven Sie sie dann mit einem Halter¹³auf 90°.
   HINWEIS: Nach verschiedenen Forschungszwecken konnten die Forscher resorbierbare Linien mit unterschiedlicher Absorptionszeit auswählen. In diesem Protokoll haben wir eine 2-wöchige resorbierbare Naht verwendet, um den Aortenbogen zu verengen.
3. Biegen Sie eine weitere 25 G Nadel auf 120° und glätten Sie die Spitze mit einem Halter, der als Abstandshalter im Ligationsschritt verwendet werden soll.
   HINWEIS: Eine 25 G Nadel wurde als Abstandsraum für Mäuse mit Körpergewicht (BW) >25 g verwendet. Verwenden Sie eine 26 G Nadel für Mäuse mit 19–24 g BW.
4. Desinfizieren Sie die Einsatzstelle mit 75% Alkohol.
5. Stellen Sie die Heizkissentemperatur auf 37 °C ein.
6. Bereiten Sie sterilisierte chirurgische Instrumente (einschließlich 1 Augenschere, 1 Mikroschere, 2 mikrochirurgische Ellbogenpinzette, 1 Nadelhalter und 1 Mikronadelhalter) vor.

2. Induktion von Anästhesie und Rasur

1. Anästhetisieren Sie eine Maus durch intraperitoneale Injektion einer Mischung aus Xylazin (5 mg/kg) und Ketamin (100 mg/kg) in Einer Salinelösung (0,9% NaCl) verdünnt. Bestätigen Sie die vollständige Anästhesie mit dem negativen Pedalentzugsreflex.
2. Halten Sie die Maus in Supine-Position, indem Sie die Schneidezähne mit einer Naht befestigen und die Gliedmaßen mit Klebebändern fixieren.
3. Tragen Sie Enthaarungscreme auf, um Haare am Hals und Xiphoid zu entfernen. Desinfizieren Sie den Bereich mit Jod gefolgt von 75% Alkohol.

3. Chirurgie

1. Machen Sie einen Schnitt über 10 mm an der Mittellinie Position zwischen supra-sternal Kerbe und Brust mit einem Skalpell. Dann trennen Sie die Haut und die oberflächliche Faszien.
2. Identifizieren Sie den ersten interkostalen Raum, indem Sie die Rippen aus dem Sternwinkel zählen. Führen Sie den Schnitt im ersten interkostalen Raum und so nah wie möglich am Brustbein aus. Durchdringen Sie es mit einer Ellbogenpinzette, um diesen Raum zu öffnen.
3. Trennen Sie das Parenchym und den Thymus vorsichtig, bis der Queraortenbogen sichtbar ist.
   HINWEIS: Beschädigen Sie die parietale Pleura nicht, um Pneumothorax zu vermeiden.
4. Passieren Sie die 5:0-Absorber-Naht unter dem Aortenbogen zwischen der brachiocephalen Arterie und der linken gemeinsamen Halsschlagader mit einer Riegelnadel¹⁴. Bitte stellen Sie sicher, dass die brachiocephalische Arterie, die linke gemeinsame Halsschlagader und die linke subklavische Arterie im Operationsfeld sichtbar sind.
5. Legen Sie den Abstandsabstand, in Schritt 1.3 vorbereitet, auf die Queraorta und führen Sie einen doppelten Knoten auf dem Abstandsraum mit der Naht in Schritt 3.4 aus.
   HINWEIS: Die Spitze des Abstandsraums muss stumpf sein, um zu vermeiden, dass die Queraorta beim Entfernen beschädigt wird.
6. Entfernen Sie den Abstandsabstand schnell, aber schonend, und schneiden Sie dann die Enden der Naht.
7. Schließen Sie den ersten interkostalen Raum und die Haut mit 5:0 Nylon Nähte. Desinfizieren Sie die Haut erneut mit 75% Alkohol.
8. Legen Sie die Maus auf das Heizkissen, um die Erholung zu fördern. Buprenorphin (0,1 mg/kg, q12h) in die ersten 3 Tage nach der Operation intraperitoneal injizieren.
9. Bringen Sie die Maus in einem 12 h hellen/dunklen Zyklusraum in den Käfig zurück, wenn sie das Bewusstsein wiedererlangt.
10. Führen Sie Eine Scheinoperation durch, die mit allen oben genannten Schritten identisch ist, jedoch ohne die Verengung (Schritt 3.5).
11. Führen Sie eine Operation für die Seidennahtgruppe durch, die mit allen oben genannten Schritten identisch ist, aber in Schritt 1.2 mit einer 5:0-Seidennaht verwendet wird.

4. Echokardiographische Bewertung erfolgreicher Ligation und Messungen

1. Führen Sie die echokardiographische Bewertung am Tag (D) 7 nach der Operation durch.
2. Anästhesisieren Sie die Maus mit 3% Isofluran durch Inhalation zur Induktion und 1,5% zur Aufrechterhaltung der Anästhesietiefe mit einer Sauerstoffdurchflussrate von 0,5–1 l/min.
3. Legen Sie die Maus in Supine-Position auf der Plattform, bei 37 °C gehalten, und klebe ihre Gliedmaßen an die Elektrode.
4. Entfernen Sie das Brusthaar mit einer Enthaarungscreme und tragen Sie Ultraschall-Kupplungsmittel auf die Brust der Maus auf.
5. Bewerten Sie die transversale Aortenverengung mit einer 30-MHz-Sonde.
   1. Neigen Sie die Plattform ganz links. Halten Sie die Sonde in vertikaler Position und senken Sie sie auf der Brust entlang der rechten parasternalen Linie. Bearbeiten Sie dann x-Achse und Y-Achse unter B-Modus, bis der Aortenbogen deutlich sichtbar ist.
   2. Suchen Sie die Verengung durch den B-Modus, um die Aortenbogenansicht¹¹zu erhalten. Verwenden Sie den Farb-Doppler-Modus und die gepulste Welle, um die Spitzenströmungsgeschwindigkeit zu messen und Mäuse mit einer Geschwindigkeit von mehr als 3.000 mm/s als TAC-Gruppe auszuwählen (Werte basieren auf Vorversuchen).
   3. Berechnen Sie den Druckgradienten gemäß der modifizierten Version von Bernoullis Gleichung¹¹:
      Druckgradient = 4 x V_max².
      HINWEIS: Der ideale Druckgradient für transversale Aortenverengungsmodelle reicht von 40–80 mmHg¹¹.
   4. Speichern Sie die Daten und Bilder mit Cine Store und Frame Store.
6. Bewerten Sie Abmessungen und Kontraktilität von linksventrikulärer (LV) mit einer 30 MHz Sonde.
   1. Setzen Sie die Plattform auf die horizontale Position zurück. Halten Sie die Sonde gegen den Uhrzeigersinn relativ zur linken parasternalen Linie bei 30° gegenüber dem Uhrzeigersinn.
   2. Verwenden Sie den B-Modus und bearbeiten Sie X und Y, um eine klare und langgestreckte Achsenansicht des Herzens zu erhalten.
   3. Drücken Sie den M-Modus, um die Indikatorlinie anzuzeigen. Erfassen Sie Bilder mit Cine Store und Frame Store zur späteren Messung der LV-Kammerabmessung, bruchfraktionelle Verkürzung und LV-Wanddicke.
7. Sobald fertig, stoppen Isofluran inhalation und lassen Sie die Maus von der Anästhesie zu erholen. Dann kehren Sie das Tier in einem 12 h hellen/dunklen Fahrradraum in seinen Käfig zurück.
8. Wiederholen Sie auf D14 und D28 nach der Operation die obigen Schritte, um die Herzparameter zu messen, und ernten Sie dann das Herz für histologische Studien.

Ergebnisse

In dieser Studie teilten wir nach dem Zufallsprinzip 45 Mäuse in drei Gruppen ein, die Scheingruppe, die Seidennahtgruppe und die resorbierbare Nahtgruppe (die Anzahl jeder Gruppe auf D0 (Basis), D14 und D28 nach TAC war 15, 10 bzw. 5). Auf D7, D14, D21 und D28 nach der Operation wurde die verengte Spitzengeschwindigkeit durch Echokardiographie bestimmt. Wir fanden heraus, dass die Durchblutungsgeschwindigkeit an der Verengung in der zweiten Woche nach DER TAC immer noch größer als 3.000 mm/s war, obwohl eine resorbie...

Diskussion

Es gibt immer noch einen weit untererforschten Bereich der kardialen nicht-ischämischen Vorbedingungen. Basierend auf unseren früheren Studien haben wir auf resorbierbare Nähte umgestellt, um das myokarde hypertrophe Vorkonditionierungsmodell zu verbessern.

In früheren Berichten verwendeten viele Forscher Seidennaht, um den Aortenbogen^8,14,15zu verengen. Seidennaht war leicht verfügbar und wurde ...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Absorbable suture (5-0)	Shandong Kang Lida Medical Products Co., Ltd	5-0	Ligation
Animal ultrasound system VEVO2100	Visual Sonic	VEVO2100	Echocardiography
Cold light illuminator	Olympus	ILD-2	Light
Heat pad- thermostatic surgical system (ALC-HTP-S1)	SHANGHAI ALCOTT BIOTECH CO	ALC-HTP-S1	Heating
Isoflurane	RWD life science	R510-22	Inhalant anaesthesia
Matrx VIP 3000 Isofurane Vaporizer	Midmark Corporation	VIP 3000	Anesthetization
Medical nylon suture (5-0)	Ningbo Medical Needle Co.	5-0	Close the skin
Pentobarbital sodium salt	Merck	25MG	Anesthetization
Precision electronic balance	Denver Instrument	TB-114	Weighing sensor
Self-made spacer			25-gauge needle
Silk suture (5-0)	Yangzhou Yuankang Medical Devices Co., Ltd.	5-0	Ligation
Small animal microsurgery equipment	Napox	MA-65	Surgical instruments
Transmission Gel	Guang Gong pai	250ML	Echocardiography
Veet hair removal cream	Reckitt Benchiser	RQ/B 33 Type 2	Remove hair of mice
Vertical automatic electrothermal pressure steam sterilizer	Hefei Huatai Medical Equipment Co.	LX-B50L	Auto clean the surgical instruments