Exploitation de la constriction aortique transversale avec suture absorbable pour obtenir une hypertrophie myocardique transitoire

Résumé

Ce protocole présente une méthode améliorée pour obtenir l’hypertrophie myocardique passagère avec la suture absorbable, simulant la diminution ventriculaire gauche d’hypertrophie après avoir enlevé la surcharge de pression. Il pourrait être utile pour les études sur le préconditionnement hypertrophique myocardique.

Résumé

Basé sur des constrictions aortiques deux fois transversales (TACs) chez la souris, il est prouvé que le préconditionnement hypertrophique myocardique (MHP) pourrait atténuer l’hypertrophie cardiomyocyte et ralentir la progression à l’insuffisance cardiaque. Pour les novices, cependant, le modèle MHP est généralement assez difficile à établir en raison des obstacles techniques dans le fonctionnement du ventilateur, l’ouverture de la poitrine à plusieurs reprises, et les saignements causés par la bande. Pour faciliter ce modèle, pour augmenter le taux de réussite chirurgicale et pour réduire l’incidence des saignements, nous sommes passés à des sutures absorbables pour le premier peignage TAC avec une technique sans ventilateur. Utilisant une suture absorbable de 2 semaines, nous avons démontré que cette procédure pourrait causer l’hypertrophie myocardique significative en 2 semaines ; et 4 semaines après chirurgie, l’hypertrophie myocardique a été presque complètement régressée à la ligne de base. En utilisant ce protocole, les opérateurs pourraient maîtriser facilement le modèle MHP avec une mortalité de fonctionnement plus faible.

Introduction

La conditionnement ischémique est un phénomène qui induit de brefs épisodes non létaux d’ischémie et de reperfusion au cœur et a la capacité de réduire considérablement les lésions myocardiques¹. Compte tenu des implications cliniques évidentes du préconditionnement ischémique, tels que la limitation de la taille infarctus du myocarde^{2 et} la suppression des tachyarrhythmies ventriculaires après la revascularisation myocardique³, il y a eu beaucoup de recherche pour disséquer les mécanismes sous-jacents aux effets cardio-protecteurs induits par la condition^{préalable 4,5}. En revanche, d’autres types non ischémiques de condition préalable ont reçu relativement peu d’attention. L’hypertrophie cardiaque peut être émoussée dans les patients présentant la sténose aortique subissant le remplacement aortique de valve^6. Partout où l’état de l’hypertrophie myocardique pathologique existe, le principe de la condition préalable est rarement rapporté.

En 1991, Rockman et coll. ont d’abord établi un modèle muran d’hypertrophie ventriculaire gauche par constriction aortique transversale (TAC)⁷. En activant le TAC deux fois chez la souris, nous avons précédemment prouvé que le préconditionnement hypertrophique myocardique (MHP) mène à la stimulation hypertrophique passagère dans le coeur rendant ainsi le coeur plus résistant au stress hypertrophique soutenu dans le^{futur 8.} Les caractéristiques du modèle MHP ont été validées par échographie biomicroscope et évaluation hémodynamique⁹. Les points clés dans la construction du modèle a été d’effectuer la thoracotomie trois fois, TAC pendant une semaine, la bande pendant une semaine, et tac secondaire pendant 6 semaines. Cependant, la bande pourrait causer des saignements, ce qui rend difficile d’être maîtrisé par les novices et difficile à populariser. En outre, c’est aussi un défi technique d’intuber les souris. Une intubation inappropriée pourrait causer des lésions trachées, du pneumothorax et même la mort chez la souris. Ainsi, il est nécessaire et précieux d’améliorer certaines procédures lors de la construction du modèle MHP.

Pour réduire la difficulté du modèle et augmenter son succès, nous sommes passés à des sutures absorbables pour le premier TAC et avons surveillé le succès du modèle en mesurant le gradient de pression à travers la constriction aortique sous échocardiographie¹⁰. Sur la base de notre expérience préliminaire, il serait difficile d’induire une hypertrophie myocardique suffisante chez les souris ayant un gradient de pression trop faible, tandis que les souris avec un gradient de pression trop élevée développeraient une insuffisance cardiaque aiguë ou même mourraient. Le gradient de pression idéal pour le modèle varie de 40-80 mmHg¹¹. En outre, cette expérience ne s’est pas fiée à un ventilateur, qui pourrait effectivement éviter la manipulation technique et les blessures associées au^{ventilateur 12}.

Protocole

Toutes les procédures ont été effectuées selon les lignes directrices sur les soins et l’utilisation des animaux de laboratoire publiées par les National Institutes of Health des États-Unis (publication n° 85-23 des NIH, révisée en 1996). Des souris mâles C57BL/6J (8-10 semaines, 20-25 g) ont été fournies par le Centre animal de l’université médicale du sud.

1. Préparation préopératoire

1. Pincez la pointe d’une aiguille de 25 G avec un porte-aiguille et émoussé avec un objet dur comme le support.
2. Passez une suture absorbable 5-0 à travers l’aiguille, puis courbez-la à 90° avec un support^13.
   REMARQUE : Selon différentes fins de recherche, les chercheurs pourraient sélectionner des lignées absorbables avec un temps d’absorption différent. Dans ce protocole, nous avons utilisé une suture absorbable de 2 semaines pour resserrer l’arc aortique.
3. Courbez une autre aiguille de 25 G à 120° et lissez la pointe avec un support à utiliser comme espaceur dans l’étape de ligature.
   NOTE : Une aiguille de 25 G a été employée comme espaceur pour des souris ayant le poids corporel (BW) et gt;25 g. Utilisez une aiguille de 26 G pour les souris ayant 19-24 g BW.
4. Désinfecter le site opératoire avec 75% d’alcool.
5. Réglez la température du coussin chauffant à 37 °C.
6. Préparer des instruments chirurgicaux stérilisés (y compris 1 ciseaux ophtalmiques, 1 micro ciseaux, 2 pinces à coude microchirurgical, 1 porte-aiguilles et 1 micro porte-aiguilles).

2. Induction de l’anesthésie et du rasage

1. Anesthésier une souris par injection intrapénitale d’un mélange de xylazine (5 mg/kg) et de kétamine (100 mg/kg) dilué dans une solution saline (0,9% de NaCl). Confirmez l’anesthésie complète avec le réflexe négatif de retrait de la pédale.
2. Gardez la souris en position supine en fixant les incisives avec une suture et en fixant les membres avec des rubans adhésifs.
3. Appliquer de la crème depilatory pour enlever les cheveux sur son cou et xiphoïde. Désinfecter la zone avec de l’iode suivi de 75% d’alcool.

3. Chirurgie

1. Faire une incision de plus de 10 mm à la position médiane entre l’encoche supra-sternale et la poitrine avec un scalpel. Ensuite, séparez la peau et le fascia superficiel.
2. Identifiez le premier espace intercostal en comptant les côtes de l’angle sternal. Effectuez l’incision dans le premier espace intercostal et aussi près que possible du sternum. Pénétrer brutalement avec des pinces à coude pour ouvrir cet espace.
3. Séparez doucement le parenchyme et le thymus jusqu’à ce que l’arc aortique transversaux soit visible.
   REMARQUE : N’endommagez pas la plèvre pariétale pour éviter le pneumothorax.
4. Passez la suture absorbable 5-0 sous l’arc aortique entre l’artère brachiocéphale et l’artère carotide commune gauche avec une aiguille de loquet^14. S’il vous plaît assurez-vous que l’artère brachiocéphale, l’artère carotide commune gauche, et l’artère subclavienne gauche sont visibles dans le champ d’opération.
5. Placez l’espaceur, préparé à l’étape 1.3, sur l’aorte transversale et effectuez un double nœud sur l’espaceur avec la suture à l’étape 3.4.
   REMARQUE : La pointe de l’espaceur doit être émoussée pour éviter d’endommager l’aorte transversale tout en l’enlevant.
6. Retirer l’espaceur rapidement mais doucement, puis couper les extrémités de la suture.
7. Fermez le premier espace intercostal et la peau à l’aide de sutures en nylon 5-0. Désinfecter la peau à nouveau avec 75% d’alcool.
8. Placez la souris sur le coussin chauffant pour favoriser la récupération. Injecter de la buprénorphine (0,1 mg/kg, q12h) par voie intrapénithique pendant les 3 premiers jours suivant la chirurgie.
9. Retournez la souris dans la cage dans une salle de cycle lumière/obscurité de 12 h lorsqu’elle récupère sa conscience.
10. Effectuer une chirurgie simulée identique à toutes les étapes ci-dessus, mais sans la constriction (étape 3.5).
11. Effectuez une chirurgie pour le groupe de suture de soie, identique à toutes les étapes ci-dessus, mais en utilisant une suture de soie 5-0 dans l’étape 1.2.

4. Évaluation échocardiographique de la ligature et des mesures réussies

1. Effectuer une évaluation échocardiographique le jour (D) 7 après la chirurgie.
2. Anesthésier la souris avec 3% d’isoflurane par inhalation pour l’induction, et 1,5% pour maintenir la profondeur de l’anesthésie, avec un taux de flux d’oxygène de 0,5-1 L/min.
3. Placez la souris en position supinée sur la plate-forme, maintenue à 37 °C, et collez ses membres à l’électrode.
4. Retirer les poils de la poitrine avec une crème depilatory et appliquer un agent de couplage ultrasonique sur la poitrine de la souris.
5. Évaluer la constriction aortique transversale à l’l’œil d’une sonde de 30 MHz.
   1. Inclinez la plate-forme à l’extrême gauche. Gardez la sonde en position verticale et abaissez-la sur la poitrine le long de la ligne parasternale droite. Ensuite, manipulez l’axe X et l’axe Y sous mode B jusqu’à ce que l’arc aortique soit clairement visible.
   2. Localisez la constriction par mode B pour obtenir la vue aortique de l’arc¹¹. Utilisez le mode Doppler couleur et l’onde pulsée pour mesurer la vitesse de débit maximale et sélectionnez des souris avec une vitesse de plus de 3 000 mm/s comme groupe TAC (les valeurs sont basées sur des expériences préliminaires).
   3. Calculez le gradient de pression selon la version modifiée de l’équation^{11 de}Bernoulli :
      gradient de pression = 4 x V_max².
      REMARQUE : Le gradient de pression idéal pour le modèle de constriction aortique transversale varie de 40 à 80 mmHg¹¹.
   4. Enregistrez les données et les images à l’aide de Cine Store et Frame Store.
6. Évaluer les dimensions et la contractilité du ventriculaire gauche (LV) à l’œil d’une sonde de 30 MHz.
   1. Réinitialisez la plate-forme à la position horizontale. Gardez la sonde à 30° dans le sens inverse des aiguilles d’une montre par rapport à la ligne parasternale gauche.
   2. Utilisez le mode B et manipulez X et Y pour obtenir une vue d’axe claire et pleine-longue du coeur.
   3. Appuyez sur le mode M pour afficher la ligne d’indicateur. Obtenez des images avec Cine Store et Frame Store pour une mesure ultérieure de la dimension de chambre LV, du raccourcissement fractionnel et de l’épaisseur du mur LV.
7. Une fois fait, arrêter l’inhalation d’isoflurane et permettre à la souris de récupérer de l’anesthésie. Ensuite, retournez l’animal dans sa cage dans une salle de cycle clair/sombre de 12 h.
8. Sur D14 et D28 après la chirurgie, répétez les étapes ci-dessus pour mesurer les paramètres cardiaques, puis récoltez le cœur pour des études histologiques.

Résultats

Dans cette étude, nous avons divisé au hasard 45 souris en trois groupes, la feinte, le groupe de suture de soie, et le groupe absorbable de suture (le nombre de chaque groupe sur D0 (ligne de base), D14, et D28 après TAC était 15, 10, et 5, respectivement). Sur D7, D14, D21, et D28 après la chirurgie, la vitesse de pointe resserrée a été déterminée par échocardiographie. Nous avons constaté que la vitesse du flux sanguin à la constriction était encore supérieure à 3 000 mm/s dans la deuxième semaine sui...

Discussion

Il y a encore un secteur largement sous-explosé dans le préconditionnement non ischémique cardiaque. Sur la base de nos études précédentes, nous sommes passés à l’utilisation de sutures absorbables pour améliorer le modèle de préconditionnement hypertrophique myocardique.

Dans les rapports précédents, de nombreux chercheurs ont utilisé la suture de soie pour resserrer l’arc aortique^8,14,15...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Absorbable suture (5-0)	Shandong Kang Lida Medical Products Co., Ltd	5-0	Ligation
Animal ultrasound system VEVO2100	Visual Sonic	VEVO2100	Echocardiography
Cold light illuminator	Olympus	ILD-2	Light
Heat pad- thermostatic surgical system (ALC-HTP-S1)	SHANGHAI ALCOTT BIOTECH CO	ALC-HTP-S1	Heating
Isoflurane	RWD life science	R510-22	Inhalant anaesthesia
Matrx VIP 3000 Isofurane Vaporizer	Midmark Corporation	VIP 3000	Anesthetization
Medical nylon suture (5-0)	Ningbo Medical Needle Co.	5-0	Close the skin
Pentobarbital sodium salt	Merck	25MG	Anesthetization
Precision electronic balance	Denver Instrument	TB-114	Weighing sensor
Self-made spacer			25-gauge needle
Silk suture (5-0)	Yangzhou Yuankang Medical Devices Co., Ltd.	5-0	Ligation
Small animal microsurgery equipment	Napox	MA-65	Surgical instruments
Transmission Gel	Guang Gong pai	250ML	Echocardiography
Veet hair removal cream	Reckitt Benchiser	RQ/B 33 Type 2	Remove hair of mice
Vertical automatic electrothermal pressure steam sterilizer	Hefei Huatai Medical Equipment Co.	LX-B50L	Auto clean the surgical instruments