Operación de constricción aórtica transversal con sutura absorbible para obtener hipertrofia miocárdica transitoria

Resumen

Este protocolo presenta un método mejorado para obtener hipertrofia miocárdica transitoria con sutura absorbible, simulando la disminución de la hipertrofia ventricular izquierda después de eliminar la sobrecarga de presión. Podría ser valioso para los estudios sobre el preaccondicionamiento hipertrófico miocárdico.

Resumen

Basado en constricciones aórticas dos veces transversales (TAC) en ratones, se demuestra que el preaccondicionamiento hipertrófico miocárdico (MHP) podría atenuar la hipertrofia de cardiomiocitos y ralentizar la progresión a la insuficiencia cardíaca. Para los principiantes, sin embargo, el modelo MHP suele ser bastante difícil de establecer debido a los obstáculos técnicos en la operación del respirador, la apertura del pecho repetidamente y el sangrado causado por la disolución. Para facilitar este modelo, para aumentar la tasa de éxito quirúrgico y reducir la incidencia de sangrado, cambiamos a suturas absorbibles para el primer peinado TAC con una técnica libre de respiradores. Usando una sutura absorbible de 2 semanas, demostramos que este procedimiento podría causar hipertrofia miocárdica significativa en 2 semanas; y 4 semanas después de la cirugía, la hipertrofia miocárdica se regresión casi por completo a la línea de base. Con este protocolo, los operadores podrían dominar el modelo MHP fácilmente con una menor mortalidad de funcionamiento.

Introducción

El preacondicionamiento isquémico es un fenómeno que induce breves episodios no letales de isquemia y reperfusión al corazón y tiene la capacidad de reducir drásticamente la lesión miocárdica^1. Dadas las evidentes implicaciones clínicas del preaccondicionamiento isquémico, como limitar el tamaño de infarto de miocardio² y suprimir las tachyarrhythmias ventriculares después de la revascularización miocárdica^3,ha habido mucha investigación para diseccionar los mecanismos subyacentes a los efectos cardioprote protectores inducidos por el preaccondicionamiento^4,5. Por el contrario, otros tipos no isquémicos de preacondicionamiento han recibido relativamente poca atención. La hipertrofia cardíaca puede ser contundente en pacientes con estenosis aórtica sometidos a reemplazo de válvula aórtica^6. Dondequiera que exista el estado de hipertrofia miocárdica patológica, rara vez se informa del principio del preaccondicionamiento.

En 1991, Rockman et al. estableció en primer lugar un modelo de ratón de hipertrofia ventricular izquierda por constricción aórtica transversal (TAC)⁷. Al operar TAC dos veces en ratones, hemos demostrado previamente que el preaccondicionamiento hipertrófico miocárdico (MHP) conduce a la estimulación hipertrófica transitoria en el corazón, lo que hace que el corazón sea más resistente al estrés hipertrófico sostenido en el futuro^8. Las características del modelo MHP han sido validadas por biomicroscopio ultrasonido y evaluación hemodinámica^9. Los puntos clave en la construcción del modelo fueron realizar la toracotomía tres veces, TAC durante una semana, debanding por una semana, y TAC secundario durante 6 semanas. Sin embargo, la disolución podría causar sangrado, lo que divió ser dominado por novicios y difícil de popularizar. Además, también es un desafío técnico intubar ratones. La intubación inadecuada podría causar lesiones traqueales, neumotórax e incluso la muerte en ratones. Por lo tanto, es necesario y valioso mejorar algunos procedimientos mientras se construye el modelo MHP.

Para reducir la dificultad del modelo y aumentar su éxito, cambiamos a suturas absorbibles para el primer TAC y monitoreamos el éxito del modelo midiendo el gradiente de presión a través de la constricción aórtica bajo ecocardiografía^10. Basado en nuestro experimento preliminar, sería difícil inducir suficiente hipertrofia miocárdica en ratones con gradiente de presión demasiado baja, mientras que los ratones con gradiente de presión demasiado alta desarrollarían insuficiencia cardíaca aguda o incluso morirían. El gradiente de presión ideal para el modelo oscila entre 40–80 mmHg^11. Además, este experimento no se basó en un respirador, que podría evitar eficazmente la manipulación técnica asociada al respirador y la lesión^12.

Protocolo

Todos los procedimientos se llevaron a cabo siguiendo las directrices de cuidado y uso de animales de laboratorio publicadas por los Institutos Nacionales de Salud de los Estados Unidos (Publicación Nº 85-23 de los NIH, revisada en 1996). C57BL/6J ratones macho (8-10 semanas, 20-25 g) fueron proporcionados por el Centro de Animales de la Universidad Médica del Sur.

1. Preparación preoperatoria

1. Pellizque la punta de una aguja de 25 G con un soporte de aguja y conzúltela con un objeto duro como el soporte.
2. Pase una sutura absorbible de 5-0 a través de la aguja y luego curvarla a 90° con un soporte¹³.
   NOTA: Según diferentes propósitos de investigación, los investigadores podrían seleccionar líneas absorbibles con diferentes tiempos de absorción. En este protocolo, usamos una sutura absorbible de 2 semanas para constreñir el arco aórtico.
3. Curva otra aguja de 25 G a 120° y suaviza la punta con un soporte para ser utilizado como espaciador en el paso de ligadura.
   NOTA: Se utilizó una aguja de 25 G como espaciador para ratones con peso corporal (BW) >25 g. Utilice una aguja de 26 G para ratones con 19-24 g BW.
4. Desinfectar el lugar del operativo con un 75% de alcohol.
5. Ajuste la temperatura de la almohadilla de calefacción a 37 °C.
6. Preparar instrumentos quirúrgicos esterilizados (incluyendo 1 tijera oftálmica, 1 micro tijera, 2 pinzas microquirúrgicas del codo, 1 soporte de aguja y 1 soporte de micro aguja).

2. Inducción de anestesia y afeitado

1. Anestesiar un ratón mediante inyección intraperitoneal de una mezcla de xilazina (5 mg/kg) y ketamina (100 mg/kg) diluida en solución salina (0,9% NaCl). Confirme la anestesia completa con el reflejo negativo de retirada del pedal.
2. Mantenga el ratón en posición supina fijando los incisivos con una sutura y fijando las extremidades con cintas adhesivas.
3. Aplicar crema depilatoria para eliminar el cabello en su cuello y xifoides. Desinfectar la zona con yodo seguido de 75% alcohol.

3. Cirugía

1. Haga una incisión de más de 10 mm en la posición de la línea media entre la muesca supraesternal y el pecho con un bisturí. Luego, separa la piel y la fascia superficial.
2. Identifique el primer espacio intercostal contando las costillas desde el ángulo de esternón. Realice la incisión en el primer espacio intercostal y lo más cerca posible del esternón. Penetrar sin rodeos con pinzas de codo para abrir este espacio.
3. Separe suavemente el parénquima y el timo hasta que el arco aórtico transversal sea visible.
   NOTA: No dañe la pleura parietal para evitar el neumotórax.
4. Pase la sutura absorbible 5-0 debajo del arco aórtico entre la arteria braquiocéfala y la arteria carótida común izquierda con una aguja de pestillo^14. Asegúrese de que la arteria braquiocéfala, la arteria carótida común izquierda y la arteria subclaviana izquierda sean visibles en el campo de operaciones.
5. Coloque el espaciador, preparado en el paso 1.3, en la aorta transversal y realice un doble nudo en el espaciador con la sutura en el paso 3.4.
   NOTA: La punta del espaciador debe ser contundente para evitar dañar la aorta transversal mientras se elimina.
6. Retire el espaciador rápidamente pero suavemente, y luego corte los extremos de la sutura.
7. Cierra el primer espacio intercostal y la piel usando suturas de nylon 5-0. Desinfectar la piel de nuevo con un 75% de alcohol.
8. Coloque el ratón en la almohadilla de calefacción para promover la recuperación. Inyectar buprenorfina (0,1 mg/kg, q12h) por vía intraperitoneally durante los primeros 3 días después de la cirugía.
9. Devuelve el ratón a la jaula en una sala de ciclo claro/oscuro de 12 h cuando recupere el conocimiento.
10. Realizar una cirugía simulada idéntica a todos los pasos anteriores pero sin la constricción (paso 3.5).
11. Realice una cirugía para el grupo de sutura de seda, idéntica a todos los pasos anteriores, pero usando una sutura de seda de 5-0 en el paso 1.2.

4. Evaluación ecocardiográfica de ligaduras y mediciones exitosas

1. Realice una evaluación ecocardiográfica el día (D) 7 después de la cirugía.
2. Anestesiar el ratón con un 3% de isoflurano a través de la inhalación para la inducción, y un 1,5% para mantener la profundidad de la anestesia, con un caudal de oxígeno de 0,5-1 L/min.
3. Coloque el ratón en posición supina en la plataforma, mantenido a 37 °C, y tape sus extremidades al electrodo.
4. Retire el vello torácico con una crema depilatoria y aplique un agente de acoplamiento ultrasónico en el pecho del ratón.
5. Evalúe la constricción aórtica transversal con una sonda de 30 MHz.
   1. Incline la plataforma hacia el extremo izquierdo. Mantenga la sonda en posición vertical y bárela sobre el pecho a lo largo de la línea parasteral derecha. A continuación, manipule el eje X y el eje Y en modo B hasta que el arco aórtico esté claramente visible.
   2. Localice la constricción en modo B para obtener la vista de arco aórtico¹¹. Utilice el modo Color Doppler y la onda pulsada para medir la velocidad máxima de flujo y seleccionar ratones con una velocidad de más de 3.000 mm/s como grupo TAC (los valores se basan en experimentos preliminares).
   3. Calcular el gradiente de presión según la versión modificada de la ecuación¹¹de Bernoulli:
      gradiente de presión = 4 x V_máx.².
      NOTA: El gradiente de presión ideal para modelo de constricción aórtica transversal oscila entre 40 y 80 mmHg¹¹.
   4. Guarde los datos y las imágenes con Cine Store y Frame Store.
6. Evalúe las dimensiones y la contractilidad del ventricular izquierdo (LV) con una sonda de 30 MHz.
   1. Restablezca la plataforma a la posición horizontal. Mantenga la sonda a 30° en sentido contrario a las agujas del reloj en relación con la línea parasteral izquierda.
   2. Utilice el modo B y manipule X e Y para obtener una vista clara y completa del eje del corazón.
   3. Pulse el modo M para mostrar la línea del indicador. Adquiera imágenes con Cine Store y Frame Store para una medición posterior de la dimensión de la cámara LV, el acortamiento fraccionarios y el grosor de la pared LV.
7. Una vez hecho esto, detenga la inhalación de isoflurano y permita que el ratón se recupere de la anestesia. Luego, devuelva al animal a su jaula en una sala de ciclo de 12 h de luz/oscuridad.
8. En D14 y D28 después de la cirugía, repita los pasos anteriores para medir los parámetros cardíacos y luego coseche el corazón para estudios histológicos.

Resultados

En este estudio, dividimos aleatoriamente 45 ratones en tres grupos, la farsa, el grupo de sutura de seda y el grupo de sutura absorbible (el número de cada grupo en D0 (línea base), D14 y D28 después del TAC fue de 15, 10 y 5, respectivamente). En D7, D14, D21 y D28 después de la cirugía, la velocidad máxima constreñida fue determinada por ecocardiografía. Encontramos que la velocidad del flujo sanguíneo en la constricción era todavía mayor que 3.000 mm/s en la segunda semana después del TAC a pesar de que s...

Discusión

Todavía hay un área muy subexplorada en el preacondicionamiento cardíaco no isquémico. Basándonos en nuestros estudios anteriores, pasamos a usar suturas absorbibles para mejorar el modelo de preacondicionamiento hipertrófico miocárdico.

En informes anteriores, muchos investigadores utilizaron sutura de seda para constreñir el arco aórtico^8,14,15. La sutura de seda estaba fácilmente disponib...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Absorbable suture (5-0)	Shandong Kang Lida Medical Products Co., Ltd	5-0	Ligation
Animal ultrasound system VEVO2100	Visual Sonic	VEVO2100	Echocardiography
Cold light illuminator	Olympus	ILD-2	Light
Heat pad- thermostatic surgical system (ALC-HTP-S1)	SHANGHAI ALCOTT BIOTECH CO	ALC-HTP-S1	Heating
Isoflurane	RWD life science	R510-22	Inhalant anaesthesia
Matrx VIP 3000 Isofurane Vaporizer	Midmark Corporation	VIP 3000	Anesthetization
Medical nylon suture (5-0)	Ningbo Medical Needle Co.	5-0	Close the skin
Pentobarbital sodium salt	Merck	25MG	Anesthetization
Precision electronic balance	Denver Instrument	TB-114	Weighing sensor
Self-made spacer			25-gauge needle
Silk suture (5-0)	Yangzhou Yuankang Medical Devices Co., Ltd.	5-0	Ligation
Small animal microsurgery equipment	Napox	MA-65	Surgical instruments
Transmission Gel	Guang Gong pai	250ML	Echocardiography
Veet hair removal cream	Reckitt Benchiser	RQ/B 33 Type 2	Remove hair of mice
Vertical automatic electrothermal pressure steam sterilizer	Hefei Huatai Medical Equipment Co.	LX-B50L	Auto clean the surgical instruments