Constrição aórtica transversal operacional com sutura absorvível para obter hipertrofia miocárica transitória

Resumo

Este protocolo apresenta um método aprimorado para obter hipertrofia miocárdia transitória com sutura absorvível, simulando diminuição da hipertrofia ventricular esquerda após a remoção da sobrecarga de pressão. Pode ser valioso para os estudos sobre pré-condicionamento hipertrófico do miocárdio.

Resumo

Com base em constrições aórticas transversais duas vezes (TACs) em camundongos, é comprovado que o pré-condicionamento hipertrófico do miocárdio (MHP) poderia atenuar a hipertrofia cardiomiocófica e retardar a progressão para insuficiência cardíaca. Para os novatos, no entanto, o modelo MHP geralmente é bastante difícil de estabelecer devido aos obstáculos técnicos na operação do ventilador, abertura do peito repetidamente e sangramento causado pela desbandada. Para facilitar esse modelo, para aumentar a taxa de sucesso cirúrgico e reduzir a incidência de sangramento, mudamos para suturas absorvíveis para o primeiro TAC penteando com uma técnica livre de ventiladores. Usando uma sutura absorvível de 2 semanas, demonstramos que este procedimento pode causar hipertrofia miocárdia significativa em 2 semanas; e 4 semanas após a cirurgia, a hipertrofia do miocárdio foi quase completamente regredida à linha de base. Usando este protocolo, os operadores poderiam dominar o modelo MHP facilmente com uma menor mortalidade operacional.

Introdução

O pré-condicionamento isquêmico é um fenômeno que induz breves episódios não letais de isquemia e reperfusão ao coração e tem a capacidade de reduzir drasticamente a lesão do miocárdio¹. Dadas as óbvias implicações clínicas do pré-condicionamento isquêmico, como limitar o infarto do miocárdio tamanho² e suprimir as taquiarritmias ventriculares após a revascularização do miocárdio^3,tem havido muitas pesquisas para dissecar os mecanismos subjacentes aos efeitos cardioprotetos induzidos pelo pré-condicionamento^4,5. Em contraste, outros tipos não isquêmicos de pré-condicionamento receberam relativamente pouca atenção. A hipertrofia cardíaca pode ser amenada em pacientes com estenose aórtica submetida à substituição da válvula aórtica⁶. Onde quer que exista o estado de hipertrofia patológica do miocárdio, o princípio do pré-condicionamento raramente é relatado.

Em 1991, Rockman et al. estabeleceram em primeiro lugar um modelo de rato de hipertrofia ventricular esquerda por constrição aórtica transversa (TAC)⁷. Ao operar tac duas vezes em camundongos, já provamos anteriormente que o pré-condicionamento hipertrófico do miocárdio (MHP) leva à estimulação hipertrófica transitória no coração, tornando assim o coração mais resistente ao estresse hipertrófico sustentado no futuro⁸. As características do modelo MHP foram validadas por biomicroscópio de ultrassom e avaliação hemodinâmica⁹. Os principais pontos na construção do modelo foram realizar a toracotomia três vezes, TAC por uma semana, debandada por uma semana, e TAC secundário por 6 semanas. No entanto, a desbandada pode causar sangramento, o que dificultou ser dominado por novatos e difícil de ser popularizado. Além disso, também é um desafio técnico entubar ratos. Intubação inadequada pode causar lesões traqueais, pneumotórax e até mesmo morte em camundongos. Por isso, é necessário e valioso melhorar alguns procedimentos ao construir o modelo MHP.

Para reduzir a dificuldade do modelo e aumentar seu sucesso, mudamos para suturas absorvíveis para o primeiro TAC e monitoramos o sucesso do modelo medindo o gradiente de pressão através da constrição aórtica sob ecocardiografia¹⁰. Com base em nosso experimento preliminar, seria difícil induzir hipertrofia mofárdia suficiente em camundongos com gradiente de baixa pressão, enquanto camundongos com gradiente de alta pressão desenvolveriam insuficiência cardíaca aguda ou até mesmo morreriam. O gradiente de pressão ideal para o modelo varia de 40 a 80 mmHg¹¹. Além disso, este experimento não contava com um ventilador, o que poderia efetivamente evitar manipulação técnica associada ao ventilador e lesão¹².

Protocolo

Todos os procedimentos foram realizados seguindo as diretrizes do Cuidado e Uso de Animais de Laboratório publicados pelos Institutos Nacionais de Saúde dos EUA (Publicação NIH nº 85-23, revisado em 1996). Os camundongos machos C57BL/6J (8-10 semanas, 20-25 g) foram fornecidos pelo Centro Animal da Universidade Médica do Sul.

1. Preparação pré-operatória

1. Aperte a ponta de uma agulha de 25 G com um suporte de agulha e corte-a com um objeto duro como o suporte.
2. Passe uma sutura 5-0 absorvível através da agulha e, em seguida, curve-a para 90° com um suporte¹³.
   NOTA: De acordo com diferentes propósitos de pesquisa, os investigadores poderiam selecionar linhas absorvíveis com diferentes tempos de absorção. Neste protocolo, usamos uma sutura absorvível de 2 semanas para restringir o arco aórtico.
3. Curve outra agulha de 25 G a 120° e suavize a ponta com um suporte para ser usado como espaçador na etapa de ligadura.
   NOTA: Uma agulha de 25 G foi usada como espaçador para camundongos com peso corporal (BW) >25 g. Use uma agulha de 26 G para ratos com 19-24 g BW.
4. Desinfete o local operacional com 75% de álcool.
5. Ajuste a temperatura da almofada de aquecimento para 37 °C.
6. Prepare instrumentos cirúrgicos esterilizados (incluindo 1 tesoura oftálmica, 1 micro tesoura, 2 pinças microcirúrgicas de cotovelo, 1 porta-agulhas e 1 micro porta-agulhas).

2. Indução de anestesia e barbear

1. Anestesiar um rato por injeção intraperitoneal de uma mistura de xilazina (5 mg/kg) e cetamina (100 mg/kg) diluída em solução salina (0,9% NaCl). Confirme a anestesia completa com o reflexo negativo de retirada do pedal.
2. Mantenha o mouse em posição supina fixando os incisivos com uma sutura e fixando os membros com fitas adesivas.
3. Aplique creme depilatório para remover o cabelo no pescoço e xiphoide. Desinfetar a área com iodo seguido de 75% de álcool.

3. Cirurgia

1. Faça uma incisão acima de 10 mm na posição média entre entalhe supra-severo e peito com um bisturi. Então, separe a pele e a fáscia superficial.
2. Identifique o primeiro espaço intercostal contando as costelas do ângulo severo. Realize a incisão no primeiro espaço intercostal e o mais próximo possível do esterno. Penetrá-lo sem rodeios com pinças de cotovelo para abrir este espaço.
3. Separe suavemente o parenchyma e o timo até que o arco aórtico transverso seja visível.
   NOTA: Não danifique a pleura parietal para evitar pneumotórax.
4. Passe a sutura 5-0 absorvível sob o arco aórtico entre a artéria braquiocefálica e a artéria carótida comum esquerda com uma agulha de trava¹⁴. Certifique-se de que a artéria braquiocefálica, a artéria carótida comum esquerda e a artéria subclávia esquerda são visíveis no campo de operação.
5. Coloque o espaçador, preparado na etapa 1.3, na aorta transversal e realize um nó duplo no espaçador com a sutura na etapa 3.4.
   NOTA: A ponta do espaçador deve ser cega para evitar danificar a aorta transversal enquanto a remove.
6. Remova o espaçador rapidamente, mas suavemente, e depois corte as extremidades da sutura.
7. Feche o primeiro espaço intercostal e a pele usando suturas de nylon 5-0. Desinfete a pele novamente com 75% de álcool.
8. Coloque o mouse na almofada de aquecimento para promover a recuperação. Injete buprenorfina (0,1 mg/kg, q12h) intraperitonealmente durante os primeiros 3 dias após a cirurgia.
9. Devolva o mouse para a gaiola em uma sala de ciclo claro/escuro de 12 horas quando ele recuperar a consciência.
10. Realizar cirurgia falsa idêntica a todas as etapas acima, mas sem a constrição (passo 3.5).
11. Realize a cirurgia para o grupo de sutura de seda, idêntico a todas as etapas acima, mas usando uma sutura de seda 5-0 na etapa 1.2.

4. Avaliação ecocardiográfica de ligaduras e medidas bem sucedidas

1. Realizar avaliação ecocardiográfica no Dia (D) 7 após a cirurgia.
2. Anestesiar o camundongo com 3% de isoflurane através da inalação para indução, e 1,5% para manter a profundidade da anestesia, com uma taxa de fluxo de oxigênio de 0,5-1 L/min.
3. Coloque o mouse em posição supina na plataforma, mantida a 37 °C, e tape seus membros no eletrodo.
4. Remova o cabelo do peito com um creme depilatório e aplique agente de acoplamento ultrassônico no peito do rato.
5. Avalie a constrição aórtica transversal com uma sonda de 30 MHz.
   1. Incline a plataforma para a extrema esquerda. Mantenha a sonda na posição vertical e abaixe-a no peito ao longo da linha parasternal direita. Em seguida, manipule o eixo X e o eixo Y sob o modo B até que o arco aórtico esteja claramente visível.
   2. Localize a constrição pelo modo B para obter a visão do arco aórtico¹¹. Use o modo Doppler colorido e a onda pulsada para medir a velocidade de fluxo de pico e selecione ratos com uma velocidade de mais de 3.000 mm/s como o grupo TAC (os valores são baseados em experimentos preliminares).
   3. Calcule o gradiente de pressão de acordo com a versão modificada da equação¹¹de Bernoulli:
      gradiente de pressão = 4 x V_max².
      NOTA: O gradiente de pressão ideal para modelo de constrição aórtica transversal varia de 40 a 80 mmHg¹¹.
   4. Salve os dados e imagens usando a Cine Store e a Frame Store.
6. Avalie as dimensões e a contratilidade do ventricular esquerdo (LV) com uma sonda de 30 MHz.
   1. Reinicie a plataforma até a posição horizontal. Mantenha a sonda em 30° no sentido anti-horário em relação à linha parasteronal esquerda.
   2. Use o modo B e manipule X e Y para obter uma visão clara e completa do eixo do coração.
   3. Pressione o modo M para mostrar a linha indicadora. Adquira imagens com Cine Store e Frame Store para posterior medição da dimensão da câmara LV, encurtamento fracionado e espessura da parede LV.
7. Uma vez feito, pare a inalação de isoflurane e permita que o rato se recupere da anestesia. Em seguida, devolva o animal à sua gaiola em uma sala de ciclo claro/escuro de 12 horas.
8. Em D14 e D28 após a cirurgia, repita os passos acima para medir os parâmetros cardíacos e, em seguida, colher o coração para estudos histológicos.

Resultados

Neste estudo, dividimos aleatoriamente 45 camundongos em três grupos, o sham, o grupo de sutura de seda e o grupo de sutura absorvível (o número de cada grupo em D0 (linha de base), D14 e D28 após tac foi 15, 10 e 5, respectivamente). Em D7, D14, D21 e D28 após a cirurgia, a velocidade de pico constrito foi determinada pela ecocardiografia. Descobrimos que a velocidade de fluxo sanguíneo na constrição ainda era superior a 3.000 mm/s na segunda semana após o TAC, embora uma sutura absorvível tivesse sido usada p...

Discussão

Ainda há uma área muito pouco explorada no pré-condicionamento cardíaco não isquêmico. Com base em nossos estudos anteriores, passamos a usar suturas absorvíveis para melhorar o modelo de pré-condicionamento hipertrófico do miocárdio.

Em relatórios anteriores, muitos investigadores usaram sutura de seda para restringir o arco aórtico^8,14,15. A sutura de seda estava facilmente disponível e...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Absorbable suture (5-0)	Shandong Kang Lida Medical Products Co., Ltd	5-0	Ligation
Animal ultrasound system VEVO2100	Visual Sonic	VEVO2100	Echocardiography
Cold light illuminator	Olympus	ILD-2	Light
Heat pad- thermostatic surgical system (ALC-HTP-S1)	SHANGHAI ALCOTT BIOTECH CO	ALC-HTP-S1	Heating
Isoflurane	RWD life science	R510-22	Inhalant anaesthesia
Matrx VIP 3000 Isofurane Vaporizer	Midmark Corporation	VIP 3000	Anesthetization
Medical nylon suture (5-0)	Ningbo Medical Needle Co.	5-0	Close the skin
Pentobarbital sodium salt	Merck	25MG	Anesthetization
Precision electronic balance	Denver Instrument	TB-114	Weighing sensor
Self-made spacer			25-gauge needle
Silk suture (5-0)	Yangzhou Yuankang Medical Devices Co., Ltd.	5-0	Ligation
Small animal microsurgery equipment	Napox	MA-65	Surgical instruments
Transmission Gel	Guang Gong pai	250ML	Echocardiography
Veet hair removal cream	Reckitt Benchiser	RQ/B 33 Type 2	Remove hair of mice
Vertical automatic electrothermal pressure steam sterilizer	Hefei Huatai Medical Equipment Co.	LX-B50L	Auto clean the surgical instruments