JoVE Logo
Autoren
Kontakt

Anmelden

Zum Anzeigen dieser Inhalte ist ein JoVE-Abonnement erforderlich. Melden Sie sich an oder starten Sie Ihre kostenlose Testversion.

In diesem Artikel

  • Zusammenfassung
  • Zusammenfassung
  • Einleitung
  • Protokoll
  • Ergebnisse
  • Diskussion
  • Offenlegungen
  • Danksagungen
  • Materialien
  • Referenzen
  • Nachdrucke und Genehmigungen

Zusammenfassung

Hier stellen wir ein Protokoll zur Verwendung eines curvelet transform-basierten Open-Source-Softwaretools MATLAB zur Quantifizierung der fibrillaren Kollagenorganisation in der extrazellulären Matrix von normalem und krankem Gewebe vor. Dieses Werkzeug kann auf Bilder mit Kollagenfasern oder anderen Arten von linienähnlichen Strukturen angewendet werden.

Zusammenfassung

Fibrillare Kollagene sind prominente komponenten der extrazellulären Matrix (ECM), und ihre topologischen Veränderungen haben sich gezeigt, dass sie mit dem Fortschreiten einer breiten Palette von Krankheiten wie Brust-, Eierstock-, Nieren- und Bauchspeicheldrüsenkrebs in Verbindung gebracht werden. Frei verfügbare Software-Tools zur Faserquantifizierung konzentrieren sich hauptsächlich auf die Berechnung der Faserausrichtung oder -ausrichtung und unterliegen Einschränkungen wie der Anforderung manueller Schritte, ungenauigkeiten bei der Erkennung der Faserkante im lauten Hintergrund oder dem Fehlen einer lokalisierten Feature-Charakterisierung. Das in diesem Protokoll beschriebene Kollagenfaserquantitierungstool zeichnet sich durch eine optimale multiskalierende Bilddarstellung aus, die durch Curvelet-Transformation (CT) ermöglicht wird. Dieser algorithmische Ansatz ermöglicht die Entfernung von Rauschen von fibrillaren Kollagenbildern und die Verbesserung von Faserkanten, um Positions- und Orientierungsinformationen direkt aus einer Faser bereitzustellen, anstatt die indirekten pixel- oder fensterweisen Informationen aus anderen Werkzeugen zu verwenden. Dieses CT-basierte Framework enthält zwei separate, aber verknüpfte Pakete mit den Namen "CT-FIRE" und "CurveAlign", die die Faserorganisation auf globaler, Interessensgebiet-Basis (ROI) oder auf individueller Faserbasis quantifizieren können. Dieses Quantifizierungskonzept wurde seit mehr als zehn Jahren entwickelt und hat sich nun zu einer umfassenden und nutzergesteuerten Collagen-Quantifizierungsplattform entwickelt. Mit dieser Plattform kann man bis zu etwa dreißig Fasermerkmale messen, einschließlich einzelner Fasereigenschaften wie Länge, Winkel, Breite und Geradheit sowie Massenmessungen wie Dichte und Ausrichtung. Darüber hinaus kann der Benutzer den Faserwinkel relativ zu manuelloder automatisch segmentierten Grenzen messen. Diese Plattform bietet auch mehrere zusätzliche Module, einschließlich der Module für die ROI-Analyse, die automatische Grenzerstellung und die Nachbearbeitung. Die Verwendung dieser Plattform erfordert keine Vorkenntnisse in der Programmierung oder Bildverarbeitung und kann große Datensätze einschließlich Hunderter oder Tausender Bilder verarbeiten, was eine effiziente Quantifizierung der Kollagenfaserorganisation für biologische oder biomedizinische Anwendungen ermöglicht.

Einleitung

Fibrillare Kollagene sind prominente, strukturelle ECM-Komponenten. Ihre Organisation ändert Auswirkungen Gewebefunktion und sind wahrscheinlich mit dem Fortschreiten vieler Krankheiten von Osteogenesis imperfecta1, Herzfunktionsstörung2, und Wundheilung3 zu verschiedenen Arten von Krebs einschließlich Brust4,5,6, Eierstock7,8, Niere9und Bauchspeicheldrüsenkrebs10 . Viele etablierte bildgebende Modalitäten können verwendet werden, um fibrillares Kollagen zu visualisieren, wie z. B. Mikroskopie der zweiten harmonischen Generation11, Flecken oder Farbstoffe in Verbindung mit Hellfeld- oder Fluoreszenzmikroskopie oder polarisierter Lichtmikroskopie12, flüssige kristallbasierte Polarisationsmikroskopie (LC-PolScope)13und Elektronenmikroskopie14. Mit der zunehmenden Bedeutung der fibrillaren Kollagenorganisation und der zunehmenden Anwendung dieser Methoden ist auch der Bedarf an verbesserten Ansätzen zur Kollagenfaseranalyse gestiegen.

Es wurden viele Anstrengungen unternommen, um Berechnungsmethoden zur automatisierten Messung von fibrillarem Kollagen zu entwickeln. Frei verfügbare Software-Tools konzentrieren sich hauptsächlich auf die Berechnung der Faserausrichtung oder -ausrichtung, indem entweder der erste Derivat oder der Strukturtensor für die Pixel15,16oder Fourier transform-based spectrum analysis für Bildkacheln17übernommen wird. Alle diese Tools unterliegen Einschränkungen, wie z. B. der Anforderung manueller Schritte, der Ungenauigkeit bei der Erkennung der Faserkante im lauten Hintergrund oder dem Fehlen einer lokalisierten Feature-Charakterisierung.

Im Vergleich zu anderen frei verfügbaren Open-Source-Software-Tools verwenden die in diesem Protokoll beschriebenen Methoden CT – eine optimale, multiskale, gerichtete Bilddarstellungsmethode –, um Rauschen von fibrillaren Kollagenbildern zu entfernen und Faserkanten zu verbessern oder zu verfolgen. Informationen über Standort und Ausrichtung können direkt aus einer Faser bereitgestellt werden, anstatt die indirekten pixel- oder fensterweisen Informationen zu verwenden, um die Metriken der Faserorganisation abzuleiten. Dieses CT-basierte Framework18,19,20,21 kann die Faserorganisation auf globaler, ROI- oder Faserbasis quantifizieren, hauptsächlich über zwei separate, aber verknüpfte Pakete mit den Namen "CT-FIRE"18,21 und "CurveAlign"19,21. Was die Implementierung der Software betrifft, können in CT-FIRE CT-Koeffizienten auf mehreren Skalen verwendet werden, um ein Bild zu rekonstruieren, das Kanten verbessert und Rauschen reduziert. Anschließend wird ein individueller Faserextraktionsalgorithmus auf das CT-rekonstruierte Bild angewendet, um Fasern zu verfolgen, um ihre repräsentativen Mittelpunkte zu finden, Faserzweige von den Mittelpunkten zu erweitern und Faserzweige zu einem Glasfasernetz zu verbinden. In CurveAlign können CT-Koeffizienten auf einer benutzerdefinierten Skala verwendet werden, um die lokale Faserausrichtung zu verfolgen, wobei die Ausrichtung und die Positionen von Kurvengezurteilen extrahiert und gruppiert werden, um die Faserausrichtung an den entsprechenden Positionen zu schätzen. Dieses daraus resultierende Quantifizierungsframework wurde seit mehr als zehn Jahren entwickelt und hat sich in vielen Aspekten wie Funktionalität, Benutzeroberfläche und Modularität stark weiterentwickelt. Dieses Tool kann beispielsweise die lokale Faserausrichtung visualisieren und ermöglicht es dem Benutzer, bis zu dreißig Fasermerkmale einschließlich einzelner Fasereigenschaften wie Länge, Winkel, Breite und Geradheit sowie Massenmessungen wie Dichte und Ausrichtung zu messen. Zusätzlich kann der Anwender den Faserwinkel relativ zu manuell oder automatisch segmentierten Grenzen messen, was beispielsweise eine wichtige Rolle bei der bildbasierten Biomarkerentwicklung beiBrustkrebs-22- und Bauchspeicheldrüsenkrebsstudien10spielt. Diese Plattform bietet mehrere Feature-Module, darunter module für die ROI-Analyse, die automatische Grenzerstellung und die Nachbearbeitung. Das ROI-Modul kann verwendet werden, um verschiedene ROI-Formen zu kommentieren und entsprechende ROI-Analysen durchzuführen. Als Anwendungsbeispiel kann das automatische Boundary Creation Modul verwendet werden, um Hämatoxylin und Eosin (H&E) Helle Feldbilder mit SHG-Bildern der zweiten harmonischen Generation zu registrieren und die Bildmaske von Tumorgrenzen aus den registrierten H&E-Bildern zu erzeugen. Das Nachbearbeitungsmodul kann die Verarbeitung und Integration von Ausgabedatendateien aus einzelnen Bildern für eine mögliche statistische Auswertung erleichtern.

Diese Quantifizierungsplattform erfordert keine Vorkenntnisse in der Programmierung oder Bildverarbeitung und kann große Datensätze einschließlich Hunderter oder Tausender Bilder verarbeiten, was eine effiziente Quantifizierung der Kollagenorganisation für biologische oder biomedizinische Anwendungen ermöglicht. Es wurde in verschiedenen Forschungsbereichen von vielen Forschern auf der ganzen Welt, einschließlich uns selbst, weit verbreitet. Es gibt vier Hauptpublikationen zu CT-FIRE und CurveAlign18,19,20,21, von denen die ersten drei 272 Mal zitiert wurden (Stand 2020-05-04 laut Google Scholar). Eine Überprüfung der Publikationen, die diese Plattform zitierten (CT-FIRE oder CurveAlign), zeigt, dass es ungefähr 110 Zeitschriftenpapiere gibt, die sie direkt für ihre Analyse verwendet haben, in denen etwa 35 Publikationen mit unserer Gruppe kollaboriert wurden, und die anderen (ca. 75) wurden von anderen Gruppen geschrieben. Zum Beispiel, Diese Plattform wurde für die folgenden Studien verwendet: Brustkrebs22,23,24, Bauchspeicheldrüsenkrebs10,25, Nierenkrebs9,26, Wundheilung3,27,28,29,30, Eierstockkrebs8,31,7, uterosacral ligament32, hypophosphatemic dentin33, bas Zellkarzinom34, hypoxisches Sarkom35, Knorpelgewebe36, Herzfunktionsstörungen37, Neuronen38, Glioblastom39, lymphatische Kontraktionen40, faserige Cacffolds41, Magenkrebs42, Mikrotubuli43und Blasenfibrose44. Abbildung 1 zeigt die krebsbildende Anwendung von CurveAlign, um die tumorassoziierten Kollagensignaturen von Brustkrebs19 aus dem SHG-Bild zu finden. Abbildung 2 beschreibt einen typischen schematischen Workflow dieser Plattform. Obwohl diese Tools technisch überprüft wurden18,19,21, und ein reguläres Protokoll20 für die Ausrichtungsanalyse mit CurveAlign ist auch verfügbar, ein visuelles Protokoll, das alle wesentlichen Funktionen demonstriert, könnte nützlich sein. Ein visualisiertes Protokoll, wie hier vorgestellt, wird den Lernprozess der Nutzung dieser Plattform erleichtern und Probleme und Fragen, die Benutzer haben könnten, effizienter behandeln.

Protokoll

HINWEIS: Dieses Protokoll beschreibt die Verwendung von CT-FIRE und CurveAlign für die Kollagenquantifizierung. Diese beiden Instrumente haben einander ergänzende, aber unterschiedliche Hauptziele und sind in gewissem Maße miteinander verbunden. CT-FIRE kann über die CurveAlign-Schnittstelle gestartet werden, um die meisten Operationen mit Ausnahme der erweiterten Nachbearbeitung und ROI-Analyse durchzuführen. Für einen vollständigen Betrieb von CT-FIRE sollte es separat gestartet werden.

1. Bildsammlung und Bildanforderung

HINWEIS: Das Tool kann jede Bilddatei mit linienähnlichen Strukturen verarbeiten, die von MATLAB lesbar sind, unabhängig von der Bildgebungsmodalität, die zum Sammeln verwendet wird.

  1. Verwenden Sie 8-Bit-Graustufen als Bildtyp, da die standardmäßig endenden Parameter auf diesem Format basieren.
    HINWEIS: SHG Imaging ist ein weit verbreitetes etikettenfreies und hochauflösendes fibrillar-Kollagen-Bildgebungsverfahren. SHG-Bilder aus einer Brustkrebsstudie19 werden hier zum Demonstrationszweck verwendet.

2. Software-Installation und Systemanforderung

HINWEIS: Sowohl Standalone- als auch Quellcode-Versionen sind frei verfügbar. Die Quellcodeversion erfordert eine vollständige MATLAB-Installation, einschließlich Toolboxes der Signalverarbeitung, Bildverarbeitung, Statistikanalyse und Parallel Computing. Zum Ausführen der Quellcodeversion sollten alle erforderlichen Ordner, einschließlich einiger aus den Drittanbieterquellen, dem MATLAB-Pfad hinzugefügt werden. Die Verwendung der Standalone-Anwendung (APP) wird für die meisten Benutzer empfohlen, was die Installation einer frei verfügbaren MATLAB Compiler Runtime (MCR) der angegebenen Version erfordert. Das Verfahren zum Installieren und Starten der APP wird unten beschrieben.

  1. Laden Sie CT-FIRE Version 3.0 (CTF3.0) und CurveAlign Version 5.0 (CA5.0) APP-Pakete von https://eliceirilab.org/software/ctfire/ bzw. https://eliceirilab.org/software/curvealign/ herunter.
    HINWEIS: Jedes Paket enthält die eigenständige APP, manuelle und Testbilder.
  2. Befolgen Sie die detaillierten Anforderungen und Installationsanweisungen der oben genannten Websites, um MATLAB MCR 2018bzu installieren.
  3. Starten Sie die APP.
    1. Für ein Windows 64-Bit-System, doppelklicken Sie auf das APP-Symbol, um es zu starten.
    2. Für ein Mac-System, folgen Sie den folgenden Schritten, um es zu starten: Rechtsklick auf die APP (Strg-Klick) | Anzeigen von Paketinhalten | Inhalt | MacOS | applauncher (Rechtsklick und öffnen).
      HINWEIS: Weitere Details finden Sie auf den in 2.1 aufgeführten Software-Websites.

3. Individuelle Faserextraktion mit CT-FIRE

HINWEIS: CT-FIRE verwendet CT, um das Bild zu entrauschen, die Faserkanten zu verbessern und dann einen Faserextraktionsalgorithmus zu verwenden, um einzelne Fasern zu verfolgen. Länge, Winkel, Breite und Geradheit werden für einzelne Fasern berechnet.

  1. CT-FIRE auf Einzelbild oder mehreren Bildern
    1. Starten Sie die APP wie in 2.3 beschrieben.
    2. Klicken Sie auf die Schaltfläche Datei öffnen in der Hauptbenutzeroberfläche (GUI, Abbildung 3A), und wählen Sie dann ein oder mehrere Bilder/oder Bildstapel aus dem Eingabeaufforderungsfenster aus. Verwenden Sie die für das Betriebssystem geeignete Technik, um mehrere Bilder im Dialogfeld auszuwählen (z. B. halten Sie in Windows STRG gedrückt, während Sie mehrere Dateien auswählen).
      HINWEIS: Wenn zwei oder mehr Bilddateien ausgewählt sind, müssen alle Bilder die gleichen laufenden Parameter für die Analyse verwenden. Stellen Sie sicher, dass alle Bilder unter den gleichen oder ähnlichen Bedingungen aufgenommen werden.
    3. Wählen Sie parallele Berechnungsoptionen aus, indem Sie das Kontrollkästchen Parallel in der oberen rechten Ecke für die Analyse mehrerer Bilder aktivieren.
    4. Verschieben Sie für den Bildstapel den Slice-Schieberegler unter das Dateilistenfeld, um das zu analysierende Slice auszuwählen.
    5. Legen Sie laufende Eigenschaften fest. Verwenden Sie Standardparameter für eine erste Analyse einiger Bilder. Wenn Sie Standardparameter verwenden, fahren Sie mit Schritt 3.1.6 fort. Um verschiedene Parameter festzulegen, klicken Sie auf die Schaltfläche Aktualisieren im Parameterbedienfeld. Befolgen Sie das Handbuch, um die Parameter richtig abzustimmen.
      HINWEIS: Zu den am häufigsten angepassten Parametern gehören der Hintergrundschwellenwert (thresh_im2) und der Keimsuchradius (s_xlinkbox). Wenn der Hintergrundgeräuschpegel hoch ist, legen Sie thresh_im2 auf einen größeren Wert fest. s_xlinkbox mit dem durchschnittlichen Radius der Fasern verknüpft ist, legen Sie einen kleineren Wert fest, um dünne Fasern zu erkennen.
    6. Klicken Sie auf die Schaltfläche Ausführen.
      HINWEIS: Die Fortschrittsinformationen werden sowohl im Informationsfenster als auch im Befehlsfenster angezeigt. Nach Abschluss der Analyse wird die Ausgabetabelle angezeigt (Abbildung 3B).
    7. Klicken Sie auf ein beliebiges Element in der Ausgabetabelle, um das Histogramm der Fasermaße (Abbildung 3C und Abbildung 3F) des Bildes einschließlich Länge, Breite, Winkel und Geradheit anzuzeigen.
      HINWEIS: Die Faserbilder mit Fasern, die auf dem Originalbild überlagert sind, werden ebenfalls angezeigt (Abbildung 3E).
    8. Überprüfen Sie den Unterordner mit dem Namen ctFIREout unter dem Bildordner auf die Ausgabedateien einschließlich der überlagerten Bilddatei ".tiff", der Datei ".csv" und der Datei ".mat".
  2. CT-FIRE-Region von Interesse (ROI) Analyse
    1. ROI-Anmerkung mit ROI Manager
      1. Klicken Sie auf die Schaltfläche Datei öffnen in der Haupt-GUI (Abbildung 3A), um ein oder mehrere Bilder zu laden.
      2. Wählen Sie das Bild aus, das in der Dateiliste mit Anmerkungen benotet werden soll.
      3. Wählen Sie den ROI-Manager im Dropdown-Menü des Bedienfelds ROI-Optionen aus.
      4. Klicken Sie auf die Schaltfläche RUN, um das ROI Manager-Modul zu starten (Abbildung 3A).
      5. Klicken Sie in der ROI-Manager-GUI (Abbildung 4A) auf das Dropdown-Menü unter ROI Menu(d ) zeichnen,um die ROIs nacheinander zu zeichnen.
        HINWEIS: Die ROI-Form kann Rechteck, Freihand, Ellipse, Polygon oder angegebenes Rechteck sein. Folgen Sie den Anweisungen auf dem Bildschirm zum Zeichnen, Speichern und Beenden der ROI-Anmerkung.
      6. Nachdem Sie die Methode zum Zeichnen des ROI ausgewählt haben, ziehen Sie das gelbe Rechteck, das auf dem Originalbild angezeigt wird, an die gewünschte Position, und klicken Sie dann auf die Schaltfläche ROI(s speichern), oder drücken Sie die Taste s, um diesen ROI zur ROI-Liste hinzuzufügen. Dieser ROI wird automatisch benannt.
      7. Zeichnen Sie einen neuen ROI, indem Sie den vorherigen ROI an eine neue Position ziehen, und speichern Sie ihn wie in 3.2.1.6 erwähnt, oder wiederholen Sie die Schritte 3.2.1.5–3.2.1.6, um einen neuen ROI zu ziehen.
      8. Drücken Sie x oder wählen Sie Neuer ROI? im Dropdown-Menü ROI-Form aus, um die ROI-Anmerkung zu beenden.
      9. Aktivieren Sie die Kontrollkästchen Alle und Beschriftungen anzeigen, um alle definierten ROIs in der Liste und deren Namen auf dem Originalbild anzuzeigen.
      10. Wählen Sie den ROI in der ROI-Liste aus, um grundlegende ROI-Operationen durchzuführen, einschließlich ROI umbenennen, ROI löschen, ROI-Text speichern, ROI aus Text laden, ROI-Maske speichern, ROI von Maske ladenund ROIs kombinieren.
      11. Überprüfen Sie die Ausgabedatei des ROI-Managers, die als ".mat"-Datei in einem Unterordner mit dem Namen ROI_management unter dem ursprünglichen Bildordner gespeichert ist.
      12. Wiederholen Sie die Schritte 3.2.1.2–3.2.1.11, um ein anderes Bild in der geöffneten Dateiliste zu kommentieren.
      13. Nachdem die Anmerkung abgeschlossen ist, schließen Sie die ROI-Manager-GUI, und setzen Sie die Haupt-GUI zurück, indem Sie auf die Schaltfläche Zurücksetzen in der Haupt-GUI klicken.
    2. ROI-Analyse für ein einzelnes Bild im ROI Manager
      1. Wenn die Vollbild-CT-FIRE-Analyse durchgeführt wird und die Ergebnisse im Standardverzeichnis gespeichert werden, klicken Sie auf einen oder mehrere ROIs in der ROI-Liste, und klicken Sie dann auf die Schaltfläche ctFIRE ROI Analyzer, um das Post-ROI-Analysemodul zu starten.
        HINWEIS: Die Ergebnisse werden automatisch in einem Unterordner gespeichert, der sich in der Datei "[Bildordner]" befindet, CTF_ROI, "Individuell" ROI_post_analysis.
      2. Klicken Sie im Popup-Fenster auf die Schaltfläche Fasern überprüfen, um Fasern innerhalb der ausgewählten ROIs anzuzeigen (Abbildung 4B).
      3. Klicken Sie auf Diagrammstatistik, um Histogramme der einzelnen ROI anzuzeigen (Abbildung 4C). Die entsprechenden Ausgabezahlen werden angezeigt.
      4. Wenn die CT-FIRE-Analyse des vollständigen Bildes nicht durchgeführt wurde, klicken Sie auf einen oder mehrere ROIs in der ROI-Liste, und klicken Sie auf die Schaltfläche ctFIRE auf ROI anwenden, um die CT-FIRE-Analyse direkt auf die ausgewählten ROIs anzuwenden.
      5. Folgen Sie den Anweisungen im Eingabeaufforderungsfenster, um die Analyse auszuführen.
        HINWEIS: Die Parameter für die Ausführung des CT-FIRE werden durch die Haupt-GUI geleitet, und der Benutzer kann die laufenden Parameter wie in Schritt 3.1.5 beschrieben nach Bedarf aktualisieren. Nach Abschluss der Analyse werden die zusammenfassenden Statistiken der Faserkennzahlen in der Ausgabetabelle angezeigt. Die Ergebnisse werden automatisch in einem Unterordner gespeichert, der sich in der Rubrik "[Bildordner]" befindet, CTF_ROI , "Individuell" ROI_analysis.
    3. ROI-Analyse für mehrere Bilder mit ROI Analyzer
      1. Führen Sie die Schritte in 3.2.1 aus, um ROIs für die zu analysierenden Bilder zu kommentieren.
      2. Öffnen Sie ein oder mehrere Bilder, indem Sie auf die Schaltfläche Datei öffnen klicken.
      3. Um die ROI-Post-Analyse auszuführen, wenn die vollständigen Bildanalyseergebnisse verfügbar sind, klicken Sie auf das Dropdown-Menü im Bedienfeld "Optionen ausführen" und wählen Sie die Option CTF post-ROI analyzer.
      4. Klicken Sie auf die Schaltfläche RUN, um die ROI-Analyse für alle geladenen Bilder auszuführen.
      5. Überprüfen Sie die Fortschrittsinformationen, die im Meldungsfenster am unteren Rand der GUI und im Befehlsfenster angezeigt werden.
      6. Überprüfen Sie nach Abschluss der Analyse die Zusammenfassungsstatistiken für jeden ROI, der in einer Ausgabetabelle angezeigt wird.
        ANMERKUNG: Die detaillierten Ausgabedateien werden automatisch in einem Unterordner gespeichert, der sich in der Datei "Bildordner" befindet, CTF_ROI, Batch, ROI_post_analysis.
      7. Um eine direkte Analyse durchzuführen, wenn die vollständigen Bildanalyseergebnisse nicht verfügbar sind, führen Sie die Schritte 3.2.3.1–3.2.3.6 aus, mit der Ausnahme, dass Sie in Schritt 3.2.3.3 die Option CTF-ROI-Analyser auswählen. In Schritt 3.2.3.4 aktualisieren Sie die laufenden Parameter, wie in Schritt 3.1.5 beschrieben, bevor Sie auf die Schaltfläche RUN klicken. Nachdem Sie auf die SCHALTFLÄCHE RUN geklickt haben, wählen Sie in einem Eingabeaufforderungsdialogfenster zwischen Rechteckigem ROI und ROI-Maske einer beliebigen Form.
        HINWEIS: Wenn alle annotierten ROIs rechteckig sind, kann der Benutzer den "Rechteckigen ROI" wählen. In Schritt 3.2.3.6 werden die Ergebnisse der ROI-Analyse in einem Unterordner gespeichert, der sich in der Datei "CTF_ROI ROI_analysis" befindet.
  3. Nachbearbeitung mit CT-FIRE
    HINWEIS: Nach der in 3.1 beschriebenen regelmäßigen CT-FIRE-Analyse kann der Benutzer eine weitere Nachbearbeitung durchführen. Ohne die zeitaufwändige Faserextraktion erneut auszuführen, kann die regelmäßige Nachbearbeitung, die in 3.3.1 beschrieben wird, einige grundlegende Ausgabezahleneigenschaften aktualisieren, während die in 3.3.2 beschriebene erweiterte Nachbearbeitung einzelne Fasern und ihre Eigenschaften visualisieren, komplexe Schwellenwerte zwischen allen vier Fasereigenschaften durchführen, Zusammenfassende Statistiken der ausgewählten Fasern generieren und die ausgewählten Fasern mithilfe einer benutzerdefinierten Farbkarte visualisieren kann.
    1. Regelmäßige Nachbearbeitung mit CT-FIRE
      1. Starten Sie die CT-FIRE-App, oder klicken Sie nach anderen Operationen auf die Schaltfläche Zurücksetzen, um die CT-FIRE-Haupt-GUI zu initialisieren (Abbildung 3A).
      2. Aktivieren Sie das Kontrollkästchen .mat oben in der Haupt-GUI.
      3. Klicken Sie auf die Schaltfläche Datei öffnen, um die CT-FIRE-Ausgabe .mat-Datei im Unterordner ctFIREout auszuwählen.
        HINWEIS: Wenn mehrere Dateien ausgewählt sind, wird das Kontrollkästchen Batch automatisch aktiviert. Der Dateiname der entsprechenden Bilder wird in der Boxliste angezeigt.
      4. Aktualisieren Sie die Optionen im Bedienfeld Ausgabefigur.
      5. Behalten Sie die Standardoptionen in Ausgabeoptionenbei, wodurch sichergestellt wird, dass alle Ausgabedateien entsprechend dem neuen Parametersatz in 3.3.1.4 aktualisiert werden.
      6. Klicken Sie auf die Schaltfläche Nachbearbeitung. Überprüfen Sie die Fortschrittsinformationen im Nachrichtenfenster am unteren Rand der Haupt-GUI sowie im Befehlsfenster.
      7. Nachdem die Analyse abgeschlossen ist, klicken Sie auf ein beliebiges Element in der Ausgabetabelle, um das Histogramm der Fasermaße des Bildes einschließlich Länge, Breite, Winkel und Geradheit anzuzeigen.
        HINWEIS: Neue Ausgabedateien überschreiben die alten dateien im Unterordner ctFIREout.
    2. Erweiterte Nachbearbeitung von CT-FIRE
      1. Starten Sie die CT-FIRE-App, oder klicken Sie nach anderen Operationen auf die Schaltfläche Zurücksetzen, um die CT-FIRE-Haupt-GUI zu initialisieren (Abbildung 3A).
      2. Aktivieren Sie das Kontrollkästchen OUT.adv oben in der Haupt-GUI (Abbildung 3A).
      3. Klicken Sie auf die Schaltfläche Nachbearbeitung, um die erweiterte Nachbearbeitungs-GUI mit dem Namen "Analysis Module" (Abbildung 5A) zu starten.
      4. Klicken Sie auf die Schaltfläche Datei auswählen, um ein Bild auszuwählen.
      5. Klicken Sie auf die Schaltfläche Fibers visualisieren, um die Fasernummer basierend auf den Beschriftungen in der Tab-Figur Original-Faserneinzugeben.
        HINWEIS: Die Messungen der ausgewählten Fasern werden in einer Ausgabetabelle angezeigt (Abbildung 5B), und die entsprechenden Fasern werden auf dem Originalbild in der Registerkartenabbildung mit dem Namen Measured-Fibers (Abbildung 5C) überlagert.
      6. Klicken Sie auf die Schaltfläche Bestätigen/Aktualisieren, um zum Schwellenwertvorgang zu wechseln.
      7. Aktivieren Sie das Schwellenwertfeld, um die Schwellenwerteinstellungen zu aktivieren.
      8. Wählen Sie eine der vier Schwellenwertoptionen aus dem Dropdown-Menü aus.
      9. Geben Sie die gewünschten Schwellenwerte im Bereich Schwellenwerte für eine oder mehrere Fasereigenschaften ein.
      10. Klicken Sie auf die Schaltfläche Schwellenwert Jetzt, um die oben genannten Schwellenwertbedingungen anzuwenden.
      11. Überprüfen Sie die Eingabeaufforderungszahl mit der Namensanzeige, die mit der Visualisierung von Metriken endet, um die ausgewählten Fasern anzuzeigen, die auf den Originalbildern mit den angepassten Farbkarten überlagert sind, wie in Abbildung 5Edargestellt.
      12. Wiederholen Sie die Schritte 3.3.2.9–3.3.2.11, um die wünschenswerten Schwellenwerte festzulegen.
      13. Klicken Sie auf die Schaltfläche Fibers speichern, um die ausgewählten Faserinformationen zu speichern.
        HINWEIS: Entsprechende ausgewählte Fasern werden in der Registerkartenfigur mit dem Namen After-Thresholdingangezeigt.
      14. Klicken Sie auf die Schaltfläche Statistiken generieren, und klicken Sie dann auf die Schaltfläche OK im Popup-Fenster, um zusammenfassende Statistiken zu generieren.
        HINWEIS: Eine Ausgabetabelle (Abbildung 5D) zeigt den Mittelwert der ausgewählten Fasern an. Andere Statistiken der ausgewählten Fasern werden in einer Excel-Datei gespeichert, deren Speicherort im Statusfenster am unteren Rand dieser GUI angezeigt wird.
      15. Um die ausgewählten einzelnen Faserinformationen in die Ausgabedatei aufzunehmen, aktivieren Sie das Feld Blatt für Rohdaten generieren, bevor Sie auf die Schaltfläche OK klicken.
      16. Um Ergebnisse aus mehreren Bildern zu kombinieren, aktivieren Sie in Schritt 3.3.2.4 das Kontrollkästchen Batch-Modus oder Stapelmodus, und wählen Sie die zu analysierenden Bilder oder Stacks aus. Schritte 3.3.2.5–3.3.2.6 überspringen. In den Schritten 3.3.2.8–3.3.2.9 legen Sie Schwellenwertbedingungen fest, aber wenn der Schwellenwert für die Schaltflächen jetzt und "Fasern speichern" deaktiviert sind, überspringen Sie die Schritte 3.3.2.10–3.3.2.13; und schließlich folgen Sie den Anweisungen in Schritt 3.3.2.14, um zusammenfassende Statistiken und individuelle Fasereigenschaften der ausgewählten Fasern zu generieren.

4. Faseranalyse mit CurveAlign

HINWEIS: CurveAlign wurde ursprünglich entwickelt, um die Winkel von Fasern in Bezug auf benutzerdefinierte Grenzen automatisch zu messen. Die aktuelle Version von CurveAlign kann zur Massenbewertung von dichte- und ausrichtungsbasierten Features zusätzlich zur relativen Winkelmessung verwendet werden, indem entweder die einzelnen Faserinformationen geladen werden, die von CT-FIRE extrahiert wurden, oder direkt unter Verwendung der lokalen Ausrichtung der Kurven. CurveAlign berechnet bis zu dreißig Features im Zusammenhang mit globalen oder lokalen Features, vor allem dichte und Ausrichtung sowie individuelle Fasereigenschaften, wenn CT-FIRE als Faserverfolgungsmethode angenommen wird.

  1. Faseranalyse mit Kurven
    1. Starten Sie die APP wie in 2.3 beschrieben.
    2. Klicken Sie auf die Schaltfläche Zurücksetzen, um die APP auf ihren Ursprünglichen Status zurückzusetzen, wenn andere Operationen durchgeführt wurden.
    3. Überprüfen Sie in der Haupt-GUI (Abbildung 6A) die Option Faseranalysemethode, um sicherzustellen, dass CT ausgewählt ist (Standardoption).
      HINWEIS: In diesem Modus wird CT auf dem Bild ausgeführt, und die Ausrichtung jedes Kurvens stellt die Richtung einer Faser an der entsprechenden Position dar.
    4. Klicken Sie auf das Dropdown-Menü "Grenze-Methode", und wählen Sie den Grenzverarbeitungsmodus aus den folgenden Dropdown-Menüoptionen aus: Keine Begrenzung, CSV-Grenze und TIFF-Grenze.
      HINWEIS: Wenn keine Begrenzung erforderlich ist, überspringen Sie diesen Schritt. Unter 4.3 finden Sie die Berechnung von Faserwinkeln in Bezug auf eine Grenze.
    5. Klicken Sie in der Haupt-GUI auf die Schaltfläche Bild abrufen (Abbildung 6A), und wählen Sie dann ein oder mehrere Bilder/oder Bildstapel aus dem Eingabeaufforderungsfenster aus. Verwenden Sie die für Ihr Betriebssystem geeignete Technik, um mehrere Bilder im Dialogfeld auszuwählen (z. B. halten Sie in Windows STRG gedrückt, während Sie mehrere Dateien auswählen).
      HINWEIS: Wenn zwei oder mehr Bilddateien ausgewählt sind, müssen alle Bilder dieselben laufenden Parameter für die Analyse verwenden. Stellen Sie sicher, dass alle Bilder unter den gleichen oder ähnlichen Bedingungen aufgenommen werden.
    6. Verschieben Sie für den Bildstapel den Slice-Schieberegler unter das Dateilistenfeld, um das zu analysierende Slice auszuwählen.
    7. Geben Sie den Anteil der coefs ein, die beibehalten werden sollen. Dieser Wert ist der Bruchteil der größten KV-Koeffizienten, die in der Faseranalyse verwendet werden.
      HINWEIS: Wenn das Bild eine große Variation in der Faserintensität oder des Kontrasts aufweist, kommentieren Sie Bereiche von Interesse mit gleichmäßigem Kontrast für die Faseranalyse, da dieser Modus nur die hellsten Fasern in einem Bild erkennt. Je größer die Bildgröße ist, desto größer ist außerdem ein kleinerer Wert für diesen Bruch.
    8. Behalten Sie alle Parameter in den Ausgabeoptionen und andere in der Option Erweitert als Standard bei. die Ausgabedateien können in anderen zukünftigen Vorgängen benötigt werden.
    9. Klicken Sie auf die Schaltfläche Ausführen am unteren Rand der Haupt-GUI (Abbildung 6A).
      HINWEIS: Die Fortschrittsinformationen werden in einem Meldungsfenster angezeigt, das unten in grüner Farbe hervorgehoben ist. Nachdem der Vorgang abgeschlossen ist, werden einige zusammenfassende Statistiken für jedes Bild in der Ausgabetabelle angezeigt (Abbildung 6B), und alle Ausgabedateien werden automatisch in einem Unterordner mit dem Namen CA_Out im Verzeichnis der Originalbilder gespeichert.
    10. Klicken Sie auf ein beliebiges Element in der Ausgabetabelle (Abbildung 6B), um das Histogramm (Abbildung 6E) oder das Kompassdiagramm (Abbildung 6F) der Faserwinkel anzuzeigen.
      HINWEIS: Das Überlagerungsbild (Abbildung 6C) und die Heatmap (Abbildung 6D) der Ausrichtung oder des Winkels werden ebenfalls angezeigt.
    11. Klicken Sie auf die Schaltfläche Zurücksetzen, um andere Vorgänge auszuführen, oder schließen Sie die Haupt-GUI, um die APP zu beenden.
  2. Individuelle Faseranalyse mit CT-FIRE
    HINWEIS: Das Verfahren ist das gleiche wie das in Abschnitt 4.1 beschriebene Verfahren, mit der Ausnahme, dass in Schritt 4.1.3 der CT-FIRE-bezogene Faseranalysemodusund Schritt 4.1.7 überspringen, da es nicht anwendbar ist und im CT-FIRE-Modus deaktiviert ist. Wählen Sie in Schritt 4.1.3 eine der folgenden drei CT-FIRE-basierten Einzelfaseranalysemethoden aus:
    1. Wählen Sie CT-FIRE Fibers, um den Fasermittelpunkt und den Faserwinkel zur Darstellung der Faser zu verwenden.
      HINWEIS: Diese Option berücksichtigt nicht die Änderungen in der Faserausrichtung entlang der Länge der Faser.
    2. Wählen Sie CT-FIRE-Endpunkte aus, um die beiden Endpunkte einer Faser und den entsprechenden Faserwinkel zur Darstellung der Faser zu verwenden.
      ANMERKUNG: Im Vergleich zu 4.2.1 verwendet diese Option zwei Positionen, um eine Faser anstelle einer (Mittelpunkt der Faser) darzustellen.
    3. Wählen Sie CT-FIRE-Segmente aus, um Segmente einer Faser zur Darstellung der Faser zu verwenden.
      HINWEIS: Jedes Segment hat eine gleiche Länge (standardmäßig auf 5 Pixel in CT-FIRE eingestellt) sowie seine Ausrichtung und Position, die die Änderung der Ausrichtung entlang der gesamten Länge der Faser widerspiegelt. Diese Option wäre die zeitaufwändigste, aber die beste Option unter den drei CT-FIRE-basierten Faseranalysemethoden, um Änderungen in der lokalen Ausrichtung einer kurvigen Faser nachzuverfolgen.
  3. Relative Ausrichtungsanalyse mit Grenze
    ANMERKUNG: Im Vergleich zur regulären Analyse ohne Randbedingungen, die in den Abschnitten 4.2 und 4.3 beschrieben wird, erfordert die relative Ausrichtungsanalyse mit Randbedingungen Folgendes:
    1. Wählen Sie in Schritt 4.1.3 die tiff-Randbedingung aus.
      HINWEIS: Der Benutzer benötigt für jedes Bild oder jeden Stapel eine entsprechende Begrenzungsdatei. Befolgen Sie die Anweisungen auf dem Bildschirm, um entweder eine CSV-Grenzdatei (comma-separated-values format based, x-y coordinates) oder eine Tiff-Grenzdatei manuell zu kommentieren. Die in CurveAlign erstellten Begrenzungsdateien werden automatisch gemäß den im Handbuch beschriebenen Dateiverzeichnis- und Dateibenennungskonventionen gespeichert. Wenn ein Paar H&E-Hellfeld- und SHG-Bilder bereitgestellt werden, verwenden Sie das in Abschnitt 4.4 beschriebene Modul für die automatische Grenzerstellung, um die Begrenzungsdatei zu generieren.
    2. Geben Sie im Bedienfeld "Primärparameter" den Abstand von der nächsten Grenze ein, um nur die Fasern innerhalb dieses Entfernungsbereichs auszuwerten.
    3. Aktivieren Sie im Bedienfeld Ausgabeoptionen das Begrenzungszuordnungsfeld Bdry Assoc, um den Punkt auf der Grenze zu visualisieren, der einer Faser, einem Fasersegment oder einem Kurvenelement zugeordnet ist.
  4. Automatische Grenzerstellung
    1. Starten Sie die APP wie in 2.3 beschrieben.
    2. Klicken Sie auf die Schaltfläche Zurücksetzen, um die APP auf ihren Ursprünglichen Status zurückzusetzen, wenn bereits andere Operationen durchgeführt wurden.
    3. Klicken Sie auf die BD-Erstellungsschaltfläche, um das automatische Boundary-Erstellungsmodul zu starten.
    4. Folgen Sie den Anweisungen/Hinweisen auf dem Bildschirm, um eine Grenzdatei für ein oder mehrere Bilder basierend auf einem Paar H&E-Hellfeld- und SHG-Bilder zu erstellen.
    5. Schließen Sie das Modulfenster, oder klicken Sie auf die Schaltfläche Zurücksetzen in der Haupt-GUI (Abbildung 6A), um dieses Modul zu beenden.
  5. CurveAlign-Interessenbereichsanalyse
    1. ROI-Anmerkung mit ROI Manager
      1. Klicken Sie auf die Schaltfläche Bild(s abrufen) in der Haupt-GUI (Abbildung 6A), um ein oder mehrere Bilder zu laden.
      2. Wählen Sie das Bild aus, das in der Dateiliste mit Anmerkungen benotet werden soll.
      3. Klicken Sie auf den ROI Manager, um das ROI Manager-Modul zu starten (Abbildung 7A).
      4. Befolgen Sie die Schritte 3.2.1.5–3.2.1.13 in Abschnitt 3.2.1.
    2. ROI-Analyse für ein einzelnes Bild im ROI Manager
      1. Wenn die CurveAlign-Analyse des vollständigen Bildes durchgeführt wurde und die Ergebnisse im Standardverzeichnis gespeichert werden, klicken Sie auf einen oder mehrere ROIs in der ROI-Liste, und klicken Sie dann auf die Schaltfläche CA ROI Analyzer, um die Post-ROI-Analyse auszuführen.
        ANMERKUNG: Nach Abschluss der Analyse werden zusammenfassende Statistiken in einer Ausgabetabelle (Abbildung 7C) sowie in einer Histogrammfigur (Abbildung 7D) angezeigt, die die Winkelverteilung anzeigt.
      2. Klicken Sie auf ein beliebiges Element in der Ausgabetabelle, um die Fasern in einem bestimmten ROI (Abbildung 7B) sowie das Histogramm der Faserwinkel zu visualisieren.
      3. Überprüfen Sie die Ausgabedateien, die in einem Unterordner gespeichert sind, der sich in der Datei "[Bildordner]" befindet, CA_ROI, "Individuell" ROI_post_analysis .
      4. Wenn keine Vollständige-Bild-CA-Analyse durchgeführt wurde, klicken Sie auf einen oder mehrere ROIs in der ROI-Liste, und klicken Sie auf die Schaltfläche CA auf ROI anwenden, um die CA-Analyse direkt auf die ausgewählten ROIs anzuwenden. Folgen Sie den Anweisungen im Eingabeaufforderungsfenster, um die Analyse auszuführen.
        HINWEIS: Die Parameter für die Ausführung der CA-Analyse werden durch die Haupt-GUI geleitet; die in Schritt 4.1.7 beschriebenen laufenden Parameter nach Bedarf zu aktualisieren. Nach Abschluss der Analyse werden die Ergebnisse der Zusammenfassenden Statistiken der Faserkennzahlen in der Ausgabetabelle angezeigt. Die Ergebnisse werden automatisch in einem Unterordner gespeichert, der sich in der Datei "[Bildordner]" befindet, CA_ROI ROI_analysis.
    3. ROI-Analyse für mehrere Bilder mit ROI Analyzer
      1. Führen Sie die Schritte in 4.5.1 aus, um ROIs für die zu analysierenden Bilder zu kommentieren.
      2. Öffnen Sie ein oder mehrere Bilder, indem Sie auf die Schaltfläche Bild abrufen klicken.
      3. Um die ROI-Post-Analyse auszuführen, wenn die vollständigen Bildanalyseergebnisse verfügbar sind, klicken Sie auf die Schaltfläche ROI-Analyse und wählen Sie die Option ROI-Nachbearbeitung.
      4. Überprüfen Sie die Fortschrittsinformationen, die im Meldungsfenster am unteren Rand der GUI und im Befehlsfenster angezeigt werden.
      5. Überprüfen Sie nach Abschluss der Analyse die Zusammenfassungsstatistiken für jeden ROI, der in einer Ausgabetabelle angezeigt wird.
        ANMERKUNG: Die detaillierten Ausgabedateien werden automatisch in einem Unterordner gespeichert, der sich in der Datei "Bildordner" befindet, CA_ROI, "Batch" ROI_post_analysis.
      6. Um eine direkte Analyse mit dem CT-Modus auszuführen, wenn die vollständigen Bildanalyseergebnisse nicht verfügbar sind, führen Sie die Schritte 4.5.3.1–4.5.3.5 aus, mit Ausnahme der folgenden Änderungen: Ändern Sie Schritt 4.5.3.3, indem Sie die Option CA für zugeschnittenen rechteckigen ROI oder CA auf maske mit ROI einer beliebigen Formauswählen. Wenn alle annotierten ROIs rechteckige Formen sind, wählen Sie die Option Rechteckiger ROI aus. Aktualisieren Sie nach Schritt 4.5.3.2 die laufenden Parameter, wie in 4.1.7 beschrieben.
        HINWEIS: Die Ergebnisse der ROI-Analyse werden in einem Unterordner gespeichert, der sich unter der Datei "Bildordner" befindet, CA_ROI, Batch, ROI_analysis.
  6. Nachbearbeitung von CurveAlign
    1. Starten Sie die APP wie in Abschnitt 2.3 beschrieben.
    2. Klicken Sie auf die Schaltfläche Zurücksetzen, um die APP auf ihren Ursprünglichen Status zurückzusetzen, wenn bereits andere Operationen ausgeführt wurden.
    3. Klicken Sie auf die Schaltfläche Nachbearbeitung, um das Nachbearbeitungsmodul zu starten.
    4. Folgen Sie den Anweisungen/Hinweisen auf dem Bildschirm, um die Ausgabefunktionen oder -werte aus verschiedenen Bildern zu kombinieren.
    5. Schließen Sie das Modulfenster, oder klicken Sie auf die Schaltfläche Zurücksetzen in der Haupt-GUI (Abbildung 6A), um dieses Modul zu beenden.

5. Geschätzte Laufzeit

  1. Warten Sie die geschätzte Laufzeit für die Verarbeitung eines Bildes mit einer Größe von 1024 Pixelx 1024 Pixel n. B. moderater Faserdichte. Die tatsächliche Rechenzeit hängt im Allgemeinen von mehreren Faktoren ab, einschließlich der Größe der Datei, des Analysemodus, der bereitzustellenden Features, des CPU-Typs (Central Processing Unit) und der Menge des verfügbaren Arbeitsspeichers (oder RAM) mit zu zufälligem Zugriff. CT-FIRE individuelle Faserextraktion dauert ein paar Minuten. CurveAlign CT-Modus ohne Begrenzung dauert ein paar Sekunden. CurveAlign CT-FIRE Faser- oder Faserendenmodus ohne Begrenzung dauert zig Sekunden. CurveAlign CT-FIRE-Fasermodus ohne Begrenzung dauert Hunderte von Sekunden. CurveAlign-Analyse mit Begrenzung dauert je nach Komplexität der Grenzen zig Sekunden bis mehrere Minuten.

Ergebnisse

Diese Methoden wurden in zahlreichen Studien erfolgreich angewandt. Einige typische Anwendungen sind: 1) Conklin et al.22 verwendeten CurveAlign, um tumorassoziierte Kollagensignaturen zu berechnen, und fanden heraus, dass Kollagenfasern häufiger senkrecht zum Kanalumfang bei duktalen Karzinom-In-situ-Läsionen (DCIS) ausgerichtet waren; 2) Drifka et al.10 nutzten den CT-FIRE-Modus in CurveAlign, um die stromale Kollagenausrichtung für pankreastisches duktorzinom und norm...

Diskussion

Dieses Protokoll beschreibt die Verwendung von CT-FIRE und CurveAlign für die fibrillare Kollagenquantifizierung und kann auf jedes Bild mit Kollagenfasern oder anderen linienartigen oder faserähnlichen, länglichen Strukturen angewendet werden, die für die Analyse durch CT-FIRE oder CurveAlign geeignet sind. Beispielsweise könnten Elastin oder elastische Fasern auf dieser Plattform auf ähnliche Weise verarbeitet werden. Wir haben beide Werkzeuge auf rechnerisch erzeugten synthetischen Fasern getestet

Offenlegungen

Die Autoren haben nichts zu verraten.

Danksagungen

Wir danken vielen Mitwirkenden und Anwendern von CT-FIRE und CurveAlign im Laufe der Jahre, dr. Rob Nowak, Dr. Carolyn Pehlke, Dr. Jeremy Bredfeldt, Guneet Mehta, Andrew Leicht, Dr. Adib Keikhosravi, Dr. Matt Conklin, Dr. Jayne Squirrell, Dr. Paolo Provenzano, Dr. Brenda Ogle, Dr. Patricia Keely, Dr. Joseph Szulczewski, Dr. Suzanne Ponik und weitere technische Beiträge von Swati Diese Arbeit wurde durch Fördermittel der Semiconductor Research Corporation, des Morgridge Institute for Research und der NIH-Stipendien R01CA19996, R01CA181385 und U54CA210190 an K.W.E. unterstützt.

Materialien

NameCompanyCatalog NumberComments
CT-FIREUniverity of Wisconsin-MadisonN/Aopen source software available from https://eliceirilab.org/software/ctfire/
CurveAlignUniversity of Wisconsin-MadisonN/Aopen source software available from https://eliceirilab.org/software/curvealign/

Referenzen

  1. Nadiarnykh, O., et al. Second harmonic generation imaging microscopy studies of osteogenesis imperfecta. Journal of Biomedical Optics. 12 (5), 051805 (2007).
  2. Kouris, N. A., et al. A nondenatured, noncrosslinked collagen matrix to deliver stem cells to the heart. Regenerative Medicine. 6 (5), 569-582 (2011).
  3. LeBert, D. C., et al. Matrix metalloproteinase 9 modulates collagen matrices and wound repair. Development. 142 (12), 2136-2146 (2015).
  4. Provenzano, P. P., et al. Collagen reorganization at the tumor-stromal interface facilitates local invasion. BMC Medicine. 4 (1), 38 (2006).
  5. Provenzano, P. P., et al. Collagen density promotes mammary tumor initiation and progression. BMC Medicine. 6 (1), 1 (2008).
  6. Conklin, M. W., et al. Aligned collagen is a prognostic signature for survival in human breast carcinoma. The American Journal of Pathology. 178 (3), 1221-1232 (2011).
  7. Alkmin, S., et al. Migration dynamics of ovarian epithelial cells on micro-fabricated image-based models of normal and malignant stroma. Acta Biomaterialia. 100, 92-104 (2019).
  8. Campbell, K. R., Campagnola, P. J. Assessing local stromal alterations in human ovarian cancer subtypes via second harmonic generation microscopy and analysis. Journal of Biomedical Optics. 22 (11), 116008 (2017).
  9. Best, S. L., et al. Collagen organization of renal cell carcinoma differs between low and high grade tumors. BMC Cancer. 19 (1), 490 (2019).
  10. Drifka, C. R., et al. Periductal stromal collagen topology of pancreatic ductal adenocarcinoma differs from that of normal and chronic pancreatitis. Modern Pathology. 28 (11), 1470-1480 (2015).
  11. Campagnola, P. J., et al. Three-dimensional high-resolution second-harmonic generation imaging of endogenous structural proteins in biological tissues. Biophysical Journal. 82 (1), 493-508 (2002).
  12. Arun Gopinathan, P., et al. Study of collagen birefringence in different grades of oral squamous cell carcinoma using picrosirius red and polarized light microscopy. Scientifica. 2015, 1-7 (2015).
  13. Keikhosravi, A., et al. Quantification of collagen organization in histopathology samples using liquid crystal based polarization microscopy. Biomedical Optics Express. 8 (9), 4243-4256 (2017).
  14. Quan, B. D., Sone, E. D. Cryo-TEM analysis of collagen fibrillar structure. Methods in Enzymology. 532, 189-205 (2013).
  15. Boudaoud, A., et al. FibrilTool, an ImageJ plug-in to quantify fibrillar structures in raw microscopy images. Nature Protocols. 9 (2), 457-463 (2014).
  16. Rezakhaniha, R., et al. Experimental investigation of collagen waviness and orientation in the arterial adventitia using confocal laser scanning microscopy. Biomechanics and Modeling in Mechanobiology. 11 (3-4), 461-473 (2012).
  17. Kartasalo, K., et al. CytoSpectre: a tool for spectral analysis of oriented structures on cellular and subcellular levels. BMC Bioinformatics. 16 (1), 1 (2015).
  18. Bredfeldt, J. S., et al. Computational segmentation of collagen fibers from second-harmonic generation images of breast cancer. Journal of Biomedical Optics. 19 (1), 016007 (2014).
  19. Bredfeldt, J. S., et al. Automated quantification of aligned collagen for human breast carcinoma prognosis. Journal of Pathology Informatics. 5 (1), 28 (2014).
  20. Liu, Y., Keikhosravi, A., Mehta, G. S., Drifka, C. R., Eliceiri, K. W. Methods for quantifying fibrillar collagen alignment. Methods in Molecular Biology. 1627, 429-451 (2017).
  21. Liu, Y., et al. Fibrillar collagen quantification with curvelet transform based computational methods. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 8, 198 (2020).
  22. Conklin, M. W., et al. Collagen alignment as a predictor of recurrence after ductal carcinoma in situ. Cancer Epidemiology and Prevention Biomarkers. 27 (2), 138-145 (2018).
  23. Jallow, F., et al. Dynamic interactions between the extracellular matrix and estrogen activity in progression of ER+ breast cancer. Oncogene. 38 (43), 6913-6925 (2019).
  24. Smirnova, T., et al. Serpin E2 promotes breast cancer metastasis by remodeling the tumor matrix and polarizing tumor associated macrophages. Oncotarget. 7 (50), 82289 (2016).
  25. Fanous, M., Keikhosravi, A., Kajdacsy-Balla, A., Eliceiri, K. W., Popescu, G. Quantitative phase imaging of stromal prognostic markers in pancreatic ductal adenocarcinoma. Biomedical Optics Express. 11 (3), 1354-1364 (2020).
  26. Jiménez-Torres, J. A., Virumbrales-Muñoz, M., Sung, K. E., Lee, M. H., Abel, E. J., Beebe, D. J. Patient-specific organotypic blood vessels as an in vitro model for anti-angiogenic drug response testing in renal cell carcinoma. EBioMedicine. 42, 408-419 (2019).
  27. Govindaraju, P., Todd, L., Shetye, S., Monslow, J., Puré, E. CD44-dependent inflammation, fibrogenesis, and collagenolysis regulates extracellular matrix remodeling and tensile strength during cutaneous wound healing. Matrix Biology. 75, 314-330 (2019).
  28. Henn, D., et al. Cryopreserved human skin allografts promote angiogenesis and dermal regeneration in a murine model. International Wound Journal. 17 (4), 925-936 (2020).
  29. Rico-Jimenez, J., et al. Non-invasive monitoring of pharmacodynamics during the skin wound healing process using multimodal optical microscopy. BMJ Open Diabetes Research and Care. 8 (1), 000974 (2020).
  30. Israel, J. S., et al. Quantification of collagen organization after nerve repair. Plastic and Reconstructive Surgery Global Open. 5 (12), (2017).
  31. Rentchler, E. C., Gant, K. L., Drapkin, R., Patankar, M., Campagnola, P. J. Imaging collagen alterations in STICs and high grade ovarian cancers in the fallopian tubes by second harmonic generation microscopy. Cancers. 11 (11), 1805 (2019).
  32. Hu, C., et al. Imaging collagen properties in the uterosacral ligaments of women with pelvic organ prolapse using spatial light interference microscopy (SLIM). Frontiers in Physics. 7, 72 (2019).
  33. Guirado, E., et al. Disrupted protein expression and altered proteolytic events in hypophosphatemic dentin can be rescued by dentin matrix protein 1. Frontiers in Physiology. 11, 82 (2020).
  34. Kiss, N., et al. Quantitative analysis on ex vivo nonlinear microscopy images of basal cell carcinoma samples in comparison to healthy skin. Pathology & Oncology Research. 25 (3), 1015-1021 (2019).
  35. Lewis, D. M., et al. Collagen fiber architecture regulates hypoxic sarcoma cell migration. ACS Biomaterials Science & Engineering. 4 (2), 400-409 (2018).
  36. Moura, C. C., Bourdakos, K. N., Tare, R. S., Oreffo, R. O., Mahajan, S. Live-imaging of Bioengineered Cartilage Tissue using Multimodal Non-linear Molecular Imaging. Scientific Reports. 9 (1), 1-9 (2019).
  37. Murtada, S. I., et al. Paradoxical aortic stiffening and subsequent cardiac dysfunction in Hutchinson-Gilford progeria syndrome. Journal of The Royal Society Interface. 17 (166), 0066 (2020).
  38. Nichol, R. H., Catlett, T. S., Onesto, M. M., Hollender, D., Gómez, T. M. Environmental elasticity regulates cell-type specific RHOA signaling and neuritogenesis of human neurons. Stem Cell Reports. 13 (6), 1006-1021 (2019).
  39. Pointer, K. B., et al. Association of collagen architecture with glioblastoma patient survival. Journal of Neurosurgery. 126 (6), 1812-1821 (2016).
  40. Razavi, M. S., Leonard-Duke, J., Hardie, B., Dixon, J. B., Gleason, R. L. Axial stretch regulates rat tail collecting lymphatic vessel contractions. Scientific Reports. 10 (1), 1-11 (2020).
  41. Xue, Y., et al. Valve leaflet-inspired elastomeric scaffolds with tunable and anisotropic mechanical properties. Polymers for Advanced Technologies. 31 (1), 94-106 (2020).
  42. Zhou, Z. H., et al. Reorganized collagen in the tumor microenvironment of gastric cancer and its association with prognosis. Journal of Cancer. 8 (8), 1466 (2017).
  43. Zinn, A., et al. The small GTPase RhoG regulates microtubule-mediated focal adhesion disassembly. Scientific Reports. 9 (1), 1-15 (2019).
  44. Zwaans, B. M., et al. Radiation cystitis modeling: A comparative study of bladder fibrosis radio-sensitivity in C57BL/6, C3H, and BALB/c mice. Physiological Reports. 8 (4), (2020).
  45. Devine, E. E., Liu, Y., Keikhosravi, A., Eliceiri, K. W., Jiang, J. J. Quantitative second harmonic generation imaging of leporine, canine, and porcine vocal fold collagen. The Laryngoscope. 129 (11), 2549-2556 (2019).
  46. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  47. Zeitoune, A. A., et al. Epithelial ovarian cancer diagnosis of second-harmonic generation images: A semiautomatic collagen fibers quantification protocol. Cancer Informatics. 16, (2017).
  48. Wershof, E., et al. Matrix feedback enables diverse higher-order patterning of the extracellular matrix. PLoS Computational Biology. 15 (10), 1007251 (2019).
  49. Mostaço-Guidolin, L. B., et al. Fractal dimension and directional analysis of elastic and collagen fiber arrangement in unsectioned arterial tissues affected by atherosclerosis and aging. Journal of Applied Physiology. 126 (3), 638-646 (2019).
  50. Thain, D., Tannenbaum, T., Livny, M. Distributed computing in practice: the Condor experience. Concurrency and Computation: Practice and Experience. 17 (2-4), 323-356 (2005).

Nachdrucke und Genehmigungen

Genehmigung beantragen, um den Text oder die Abbildungen dieses JoVE-Artikels zu verwenden

Genehmigung beantragen

Weitere Artikel entdecken

BioengineeringAusgabe 165Tumormikroumgebungextrazellul re MatrixKrebsKollagenfaserorganisationfibrillare KollagenquantifizierungKurventransformationMikroskopie der zweiten harmonischen GenerationBildanalysesoftware

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Datenschutz

Nutzungsbedingungen

Richtlinien

Kontakt

BIBLIOTHEKS-EMPFEHLUNG

JoVE-Newsletter

Forschung

Lehre

Autoren

Bibliothekare

ÜBER JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. Alle Rechte vorbehalten