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In questo articolo

  • Riepilogo
  • Abstract
  • Introduzione
  • Protocollo
  • Risultati
  • Discussione
  • Divulgazioni
  • Riconoscimenti
  • Materiali
  • Riferimenti
  • Ristampe e Autorizzazioni

Riepilogo

Qui presentiamo un protocollo per utilizzare uno strumento software MATLAB open source a base di trasformata curvelet per quantificare l'organizzazione del collagene fibrilla nella matrice extracellulare dei tessuti normali e malati. Questo strumento può essere applicato a immagini con fibre di collagene o altri tipi di strutture simili a linee.

Abstract

I collageni fibrillari sono componenti prominenti della matrice extracellulare (ECM) e i loro cambiamenti di topologia hanno dimostrato di essere associati alla progressione di una vasta gamma di malattie tra cui tumori al seno, alle ovaie, ai reni e al pancreas. Gli strumenti software di quantificazione delle fibre liberamente disponibili si concentrano principalmente sul calcolo dell'allineamento o dell'orientamento della fibra e sono soggetti a limitazioni come il requisito di passaggi manuali, imprecisione nel rilevamento del bordo della fibra in uno sfondo rumoroso o mancanza di caratterizzazione localizzata delle funzionalità. Lo strumento di quantificazione delle fibre di collagene descritto in questo protocollo è caratterizzato dall'utilizzo di una rappresentazione ottimale dell'immagine su più scale abilitata dalla trasformazione curvelet (CT). Questo approccio algoritmico consente la rimozione del rumore dalle immagini di collagene fibrilla e il miglioramento dei bordi delle fibre per fornire informazioni sulla posizione e sull'orientamento direttamente da una fibra, piuttosto che utilizzare le informazioni indirette per pixel o per finestra ottenute da altri strumenti. Questo framework basato su CT contiene due pacchetti separati, ma collegati, denominati "CT-FIRE" e "CurveAlign" in grado di quantificare l'organizzazione delle fibre su base globale, regione di interesse (ROI) o singola fibra. Questo quadro di quantificazione è stato sviluppato per più di dieci anni e ora si è evoluto in una piattaforma di quantificazione del collagene completa e guidata dall'utente. Utilizzando questa piattaforma, si possono misurare fino a una trentina di caratteristiche della fibra tra cui proprietà individuali della fibra come lunghezza, angolo, larghezza e rettilineità, nonché misurazioni alla rinfusa come densità e allineamento. Inoltre, l'utente può misurare l'angolo della fibra rispetto ai limiti segmentati manualmente o automaticamente. Questa piattaforma fornisce anche diversi moduli aggiuntivi tra cui quelli per l'analisi del ROI, la creazione automatica dei limiti e la post-elaborazione. L'utilizzo di questa piattaforma non richiede una precedente esperienza di programmazione o elaborazione delle immagini e può gestire set di dati di grandi dimensioni tra cui centinaia o migliaia di immagini, consentendo una quantificazione efficiente dell'organizzazione delle fibre di collagene per applicazioni biologiche o biomediche.

Introduzione

I collageni fibrillari sono componenti ECM strutturali prominenti. La loro organizzazione cambia la funzione tissutale di impatto e sono probabilmente associati alla progressione di molte malattie che vanno dall'osteogenesi imperfetta1,disfunzione cardiaca2e guarigionedelle ferite 3 a diversi tipi di cancro tra cuiil seno 4,5,6,ovarico7,8,rene 9e tumori pancreatici10. Molte modalità di imaging consolidate possono essere utilizzate per visualizzare collagene fibrilla come microscopia di seconda generazionearmonica 11,macchie o coloranti in combinazione con microscopia a campo luminoso o fluorescenza o microscopia a luce polarizzata12,microscopia a polarizzazione a cristalli liquidi (LC-PolScope)13e microscopia elettronica14. Man mano che l'importanza dell'organizzazione del collagene fibrilla è diventata più chiara e l'uso di questi metodi è aumentato, è cresciuta anche la necessità di migliori approcci di analisi delle fibre di collagene.

Ci sono stati molti sforzi per sviluppare metodi computazionali per la misurazione automatizzata del collagene fibrilla. Gli strumenti software liberamente disponibili si concentrano principalmente sul calcolo dell'allineamento o dell'orientamento della fibra adottando il primo tensore derivato o di struttura per i pixel15,16o l'analisi dello spettro basata sulla trasformazione di Fourier per i riquadriimmagine 17. Tutti questi strumenti sono soggetti a limitazioni come il requisito di passaggi manuali, imprecisione nel rilevamento del bordo della fibra in uno sfondo rumoroso o mancanza di caratterizzazione localizzata delle funzionalità.

Rispetto ad altri strumenti software liberi open source liberamente disponibili, i metodi descritti in questo protocollo utilizzano ct, un metodo ottimale, multiscala, di rappresentazione direzionale dell'immagine, per rimuovere il rumore dalle immagini di collagene fibrillare e migliorare o tracciare i bordi delle fibre. Le informazioni sulla posizione e l'orientamento possono essere fornite direttamente da una fibra piuttosto che utilizzando le informazioni indirette per pixel o per finestra per dedurre le metriche dell'organizzazione delle fibre. Questo framework basato su CT18,19,20,21 può quantificare l'organizzazione della fibra su base globale, ROI o fibra, principalmente tramite due pacchetti separati, ma collegati, denominati "CT-FIRE"18,21 e "CurveAlign"19,21. Per quanto riguarda l'implementazione del software, in CT-FIRE, i coefficienti CT su più scale possono essere utilizzati per ricostruire un'immagine che migliora i bordi e riduce il rumore. Quindi, un singolo algoritmo di estrazione della fibra viene applicato all'immagine ricostruita dalla TC per tenere traccia delle fibre per trovare i loro punti di centro rappresentativi, estendere i rami di fibra dai punti centrale e collegare i rami di fibra per formare una rete in fibra. In CurveAlign, i coefficienti CT su una scala specificata dall'utente possono essere utilizzati per tenere traccia dell'orientamento della fibra locale, dove l'orientamento e le posizioni delle curvelet vengono estratti e raggruppati per stimare l'orientamento della fibra nelle posizioni corrispondenti. Questo quadro di quantificazione risultante è stato sviluppato per più di dieci anni e si è evoluto notevolmente in molti aspetti come la funzionalità, l'interfaccia utente e la modularità. Ad esempio, questo strumento può visualizzare l'orientamento della fibra locale e consente all'utente di misurare fino a trenta caratteristiche della fibra, tra cui proprietà individuali della fibra come lunghezza, angolo, larghezza e rettilineità, nonché misurazioni di massa come densità e allineamento. Inoltre, l'utente può misurare l'angolo della fibra rispetto ai limiti segmentati manualmente o automaticamente, il che, ad esempio, svolge un ruolo importante nello sviluppo di biomarcatori basati su immagini nel cancro al seno22 e negli studi sul cancro al pancreas10. Questa piattaforma fornisce diversi moduli di funzionalità, tra cui quelli per l'analisi del ROI, la creazione automatica dei limiti e la post-elaborazione. Il modulo ROI può essere utilizzato per annotare diverse forme di ROI e condurre analisi del ROI corrispondenti. Ad esempio, il modulo automatico di creazione dei limiti può essere utilizzato per registrare immagini a campo luminoso ematossilina ed eosina (H&E) con immagini di seconda generazione armonica (SHG) e generare la maschera immagine dei confini tumorali dalle immagini H&E registrate. Il modulo di post-elaborazione può aiutare a facilitare l'elaborazione e l'integrazione di file di dati di output da singole immagini per possibili analisi statistiche.

Questa piattaforma di quantificazione non richiede una precedente esperienza di programmazione o elaborazione delle immagini e può gestire set di dati di grandi dimensioni tra cui centinaia o migliaia di immagini, consentendo una quantificazione efficiente dell'organizzazione del collagene per applicazioni biologiche o biomediche. È stato ampiamente utilizzato in diversi campi di ricerca da molti ricercatori in tutto il mondo, incluso noi stessi. Ci sono quattro pubblicazioni principali su CT-FIRE e CurveAlign18,19,20,21, di cui le prime tre sono state citate 272 volte (a 2020-05-04 secondo Google Scholar). Una recensione delle pubblicazioni che hanno citato questa piattaforma (CT-FIRE o CurveAlign) indica che ci sono circa 110 articoli di riviste che l'hanno utilizzata direttamente per la loro analisi, in cui circa 35 pubblicazioni sono state collaborative con il nostro gruppo e le altre (~ 75) sono state scritte da altri gruppi. Ad esempio, questa piattaforma è stata utilizzata per i seguenti studi: tumore alseno 22,23,24, tumore al pancreas10,25,cancro aireni 9,26,guarigione delleferite 3,27,28,29,30,cancro alle ovaie8,31,7, legamento uterosacrale 32, dentina ipofosfatmica32,dentina ipofosfatmica33 , carcinoma a cellule basali34,sarcoma ipossico35,tessuto cartilagineo36,disfunzione cardiaca37,neuroni38,glioblastoma39,contrazioni linfatiche40,cacffold fibrosi41,cancro gastrico42,microtubulo43e fibrosivescicale 44. La figura 1 dimostra l'applicazione di imaging tumorale di CurveAlign per trovare le firme di collagene associate al tumore del cancro alseno 19 dall'immagine SHG. Nella figura 2 viene descritto un flusso di lavoro schematico tipico di questa piattaforma. Sebbene questi strumenti siano stati esaminati tecnicamente18,19,21e un normale protocollo20 per l'analisi dell'allineamento con CurveAlign, potrebbe essere utile anche un protocollo visivo che dimostri tutte le funzionalità essenziali. Un protocollo visualizzato, come presentato qui, faciliterà il processo di apprendimento dell'utilizzo di questa piattaforma e affronterà in modo più efficiente i problemi e le domande che gli utenti potrebbero avere.

Protocollo

NOTA: Questo protocollo descrive l'uso di CT-FIRE e CurveAlign per la quantificazione del collagene. Questi due strumenti hanno obiettivi principali complementari, ma diversi, e sono in una certa misura collegati tra loro. CT-FIRE può essere lanciato dall'interfaccia CurveAlign per condurre la maggior parte delle operazioni ad eccezione della post-elaborazione avanzata e dell'analisi del ROI. Per un pieno funzionamento di CT-FIRE, dovrebbe essere lanciato separatamente.

1. Raccolta di immagini e requisiti di immagine

NOTA: Lo strumento può elaborare qualsiasi file di immagine con strutture simili a linee leggibili da MATLAB indipendentemente dalla modalità di imaging utilizzata per raccoglierlo.

  1. Usa la scala di grigi a 8 bit come tipo di immagine poiché i parametri di esecuzione predefiniti si basano su questo formato.
    NOTA: L'imaging SHG è un metodo di imaging di collagene fibrilla senza etichette e ad alta risoluzione ampiamente utilizzato. Le immagini SHG di uno studio sulcancro al seno 19 saranno utilizzate qui a scopo dimostrativo.

2. Installazione del software e requisiti di sistema

NOTA: sia le versioni autonome che le versioni del codice sorgente sono liberamente disponibili. La versione del codice sorgente richiede un'installazione MATLAB completa che includa gli strumenti di elaborazione del segnale, elaborazione delle immagini, analisi statistica e calcolo parallelo. Per eseguire la versione del codice sorgente, tutte le cartelle necessarie, incluse alcune provenienti da origini di terze parti, devono essere aggiunte al percorso MATLAB. L'uso dell'applicazione autonoma (APP) è consigliato per la maggior parte degli utenti, il che richiede l'installazione di un MCR (MATLAB Compiler Runtime) liberamente disponibile della versione specificata. La procedura di installazione e avvio dell'APP è descritta di seguito.

  1. Scaricare i pacchetti APP CT-FIRE versione 3.0 (CTF3.0) e CurveAlign versione 5.0 (CA5.0) rispettivamente da https://eliceirilab.org/software/ctfire/ e https://eliceirilab.org/software/curvealign/.
    NOTA: ogni pacchetto include l'APP autonoma, le immagini manuali e di prova.
  2. Seguire i requisiti dettagliati e le istruzioni di installazione dai siti Web di cui sopra per installare MATLAB MCR 2018b.
  3. Avviare l'APP.
    1. Per un sistema Windows a 64 bit, fai doppio clic sull'icona APP per avviarlo.
    2. Per un sistema Mac, attenersi alla seguente procedura per avviarlo: fare clic con il pulsante destro del mouse sull'APP (ctrl-clic) | Mostra contenuto pacchetto | Contenuto | MacOS | applauncher (fare clic con il pulsante destro del mouse e scegliere apri).
      NOTA: Altri dettagli possono essere visti nei siti Web software elencati nella 2.1.

3. Estrazione individuale della fibra con CT-FIRE

NOTA: CT-FIRE utilizza CT per denotare l'immagine, migliorare i bordi della fibra e quindi utilizzare un algoritmo di estrazione delle fibre per tenere traccia delle singole fibre. Lunghezza, angolo, larghezza e rettilineità vengono calcolati per le singole fibre.

  1. CT-FIRE su singola immagine o più immagini
    1. Avviare l'APP come descritto al 2.3.
    2. Fare clic sul pulsante Apri file nell'interfaccia utente grafica principale (GUI, Figura 3A), quindi selezionare una o più immagini/o stack di immagini dalla finestra del prompt. Usa la tecnica appropriata per il sistema operativo per selezionare più immagini nella finestra di dialogo (ad esempio, in Windows, tieni premuto CTRL mentre selezioni più file).
      NOTA: se sono selezionati due o più file di immagine, tutte le immagini devono utilizzare gli stessi parametri in esecuzione per l'analisi. Assicurarsi che tutte le immagini siano acquisite nelle stesse condizioni o in condizioni simili.
    3. Selezionare le opzioni di calcolo parallelo selezionando la casella di controllo Parallelo nell'angolo in alto a destra per l'analisi di più immagini.
    4. Per lo stack di immagini, spostare il dispositivo di scorrimento della sezione sotto la casella di riepilogo dei file per selezionare la sezione da analizzare.
    5. Impostare le proprietà in esecuzione. Usa i parametri predefiniti per un'analisi iniziale di alcune immagini. Se si utilizzano parametri predefiniti, passare al passaggio 3.1.6. Per impostare parametri diversi, fate clic sul pulsante Aggiorna nel pannello Parametri. Seguire il manuale per ottimizzare correttamente i parametri.
      NOTA: I parametri regolati più frequentemente includono la soglia di fondo (thresh_im2) e il raggio di ricerca della nucleazione (s_xlinkbox). Se il livello di rumore di fondo è elevato, impostare thresh_im2 su un valore maggiore; s_xlinkbox è associato al raggio medio delle fibre, impostare un valore più piccolo per rilevare fibre sottili.
    6. Fare clic sul pulsante Esegui.
      NOTA: le informazioni sullo stato di avanzamento verranno visualizzate sia nella finestra delle informazioni che nella finestra di comando. Al termine dell'analisi, verrà visualizzata la tabella di output (Figura 3B).
    7. Fare clic su qualsiasi elemento della tabella di output per visualizzare l'istogramma delle misure in fibra (Figura 3C e Figura 3F) dell'immagine, inclusi lunghezza, larghezza, angolo e rettilineità.
      NOTA: Verranno visualizzate anche le immagini in fibra con fibre sovrapposte all'immagine originale (Figura 3E).
    8. Controllare nella cartella immagine la sottocartella denominata ctFIREout, inclusi il file di immagine sovrapposta ".tiff", il file ".csv" e il file ".mat".
  2. Analisi della regione di interesse CT-FIRE (ROI)
    1. Annotazione roi con ROI Manager
      1. Fare clic sul pulsante Apri file nell'interfaccia utente grafica principale (Figura 3A) per caricare una o più immagini.
      2. Selezionare l'immagine da annotare nell'elenco dei file.
      3. Selezionate Gestione ROI (ROI Manager) nel menu a discesa del pannello Opzioni ROI.
      4. Fare clic sul pulsante RUN per avviare il modulo ROI Manager (Figura 3A).
      5. Nella GUI di ROI Manager (Figura 4A), fare clic sul menu a discesa sotto Draw ROI Menu(d)per disegnare le ROI, una per una.
        NOTA: la forma ROI può essere rettangolo, a mano libera, ellisse, poligono o rettangolo specificato. Seguire le istruzioni visualizzate per disegnare, salvare e uscire dall'annotazione del ROI.
      6. Dopo aver selezionato il metodo per disegnare il ROI, trascinare il rettangolo giallo visualizzato nell'immagine originale nella posizione desiderata, quindi fare clic sul pulsante Salva ROI o premere i tasti per aggiungere questo ROI all'elenco ROI. Questo ROI verrà denominato automaticamente.
      7. Disegna un nuovo ROI trascinando il ROI precedente in una nuova posizione e salvalo come menzionato nella 3.2.1.6 o ripeti i passaggi 3.2.1.5-3.2.1.6 per disegnare un nuovo ROI.
      8. Premere x o selezionare Nuovo ROI nel menu a discesa Forma ROI per uscire dall'annotazione del ROI.
      9. Selezionare le caselle di controllo Mostra tutto ed etichette per visualizzare tutte le ROM definite nell'elenco e i relativi nomi nell'immagine originale.
      10. Selezionare il ROI nell'elenco ROI per eseguire operazioni di ROI di base, tra cui Rinominare il ROI, eliminare il ROI, salvare il testo del ROI, caricare il ROI dal testo, salvare la maschera ROI,caricare il ROIdalla maschera e combinare le ROI.
      11. Controllare il file di output del file DI ROI salvato come file ".mat" in una sottocartella denominata ROI_management nella cartella dell'immagine originale.
      12. Per annotare un'altra immagine nell'elenco dei file aperti, ripetere i passaggi 3.2.1.2–3.2.1.11.
      13. Al termine dell'annotazione, chiudere la GUI del gestore del ROI e reimpostare la GUI principale facendo clic sul pulsante Reimposta nella GUI principale.
    2. Analisi del ROI per una singola immagine in ROI Manager
      1. Se viene condotta un'analisi CT-FIRE a immagine intera e i risultati vengono salvati nella directory predefinita, fare clic su una o più ROI nell'elenco ROI, quindi fare clic sul pulsante ctFIRE ROI Analyzer per avviare il modulo di analisi Post-ROI.
        NOTA: i risultati verranno salvati automaticamente in una sottocartella che si trova in \\[cartella immagine]\ CTF_ROI\Individual\ROI_post_analysis\.
      2. Nella finestra popup, fare clic sul pulsante Controlla fibre per visualizzare le fibre all'interno delle ROM selezionate ( Figura4B).
      3. Fare clic su Statistiche grafico per visualizzare gli istogrammi di ogni ROI ( Figura4C). Verranno visualizzate le cifre di output corrispondenti.
      4. Se l'analisi CT-FIRE dell'immagine completa non è stata condotta, fare clic su uno o più ROI nell'elenco ROI e fare clic sul pulsante Applica ctFIRE sul ROI per applicare direttamente l'analisi CT-FIRE alle ROI selezionate.
      5. Seguire le istruzioni nella finestra del prompt per eseguire l'analisi.
        NOTA: I parametri per l'esecuzione del CT-FIRE vengono passati attraverso la GUI principale e l'utente può aggiornare i parametri in esecuzione come descritto nel passaggio 3.1.5 in base alle esigenze. Al termine dell'analisi, le statistiche di riepilogo delle misure in fibra verranno visualizzate nella tabella di output. I risultati verranno salvati automaticamente in una sottocartella che si trova in \\[cartella immagine]\ CTF_ROI\Individual\ROI_analysis\.
    3. Analisi del ROI per più immagini tramite ROI Analyzer
      1. Seguire i passaggi descritti nella 3.2.1 per annotare le ROM per le immagini da analizzare.
      2. Aprire una o più immagini facendo clic sul pulsante Apri file.
      3. Per eseguire l'analisi post ROI quando sono disponibili i risultati completi dell'analisi delle immagini, fare clic sul menu a discesa nel pannello Opzioni di esecuzione e selezionare l'opzione Analizzatore post-ROI CTF.
      4. Fare clic sul pulsante RUN per eseguire l'analisi del ROI per tutte le immagini caricate.
      5. Controllare le informazioni sullo stato visualizzate nella finestra del messaggio nella parte inferiore dell'interfaccia utente grafica e nella finestra di comando.
      6. Al termine dell'analisi, controllare le statistiche di riepilogo per ogni ROI visualizzato in una tabella di output.
        NOTA: i file di output dettagliati vengono salvati automaticamente in una sottocartella situata in \\ [cartella immagine]\CTF_ROI\Batch\ROI_post_analysis\.
      7. Per eseguire un'analisi diretta quando i risultati completi dell'analisi delle immagini non sono disponibili, attenersi ai passaggi 3.2.3.1-3.2.3.6, con la differenza che nel passaggio 3.2.3.3 selezionare l'opzione CTF ROI analyzer; Nel passaggio 3.2.3.4, prima di fare clic sul pulsante RUN, aggiornare i parametri in esecuzione come descritto al passaggio 3.1.5. Dopo aver fatto clic sul pulsante RUN, in una finestra di dialogo di richiesta scegliere tra ROI rettangolare e maschera ROI di qualsiasi forma.
        NOTA: se tutte le ROI annotate sono rettangolari, l'utente può scegliere il "ROI rettangolare". Nel passaggio 3.2.3.6 i risultati dell'analisi del ROI vengono salvati in una sottocartella che si trova in \\[cartella immagine]\CTF_ROI\Batch\ROI_analysis\.
  3. Post-elaborazione con CT-FIRE
    NOTA: Dopo la normale analisi CT-FIRE descritta al punto 3.1, l'utente può eseguire ulteriori post-elaborazione. Senza eseguire nuovamente l'estrazione di fibre dispendiosa in termini di tempo, la post-elaborazione regolare, descritta al punto 3.3.1, può aggiornare alcune proprietà di base della figura di output, mentre la post-elaborazione avanzata descritta nella 3.3.2 può visualizzare le singole fibre e le loro proprietà, eseguire una soglia complessa tra tutte e quattro le proprietà della fibra, generare statistiche di riepilogo delle fibre selezionate e visualizzare le fibre selezionate utilizzando una mappa dei colori personalizzata.
    1. Post-elaborazione regolare con CT-FIRE
      1. Avviare l'app CT-FIRE oppure fare clic sul pulsante Reimposta dopo altre operazioni per inizializzare la GUI principale CT-FIRE (Figura 3A).
      2. Selezionare la casella di controllo .mat nella parte superiore della GUI principale.
      3. Fare clic sul pulsante Apri file per selezionare il file mat di output CT-FIRE nella sottocartella ctFIREout.
        NOTA: se sono selezionati più file, la casella di controllo Batch verrà selezionata automaticamente. Il nome file delle immagini corrispondenti verrà visualizzato nell'elenco delle caselle.
      4. Aggiornate le opzioni nel pannello Controllo figura di output.
      5. Mantenere le opzioni predefinite in Opzioni di output, che assicureranno che tutti i file di output verranno aggiornati in base al nuovo set di parametri impostato nella 3.3.1.4.
      6. Clicca sul pulsante Post-elaborazione. Controllare le informazioni sullo stato di avanzamento nella finestra del messaggio nella parte inferiore dell'interfaccia utente grafica principale e nella finestra di comando.
      7. Al termine dell'analisi, fare clic su qualsiasi elemento della tabella di output per visualizzare l'istogramma delle misure in fibra dell'immagine, tra cui lunghezza, larghezza, angolo e rettilineità.
        NOTA: i nuovi file di output sovrascriveranno quelli precedenti nella sottocartella ctFIREout.
    2. Post-elaborazione avanzata di CT-FIRE
      1. Avviare l'app CT-FIRE oppure fare clic sul pulsante Reimposta dopo altre operazioni per inizializzare la GUI principale CT-FIRE (Figura 3A).
      2. Controllare la casella di controllo OUT.adv nella parte superiore della GUI principale (Figura 3A).
      3. Fare clic sul pulsante Di post-elaborazione per avviare l'avanzata GUI di post-elaborazione denominata "Modulo dianalisi " (Figura 5A).
      4. Fare clic sul pulsante Seleziona file per selezionare un'immagine.
      5. Fare clic sul pulsante Visualizza fibre per immettere il numero di fibra in base alle etichette nella figura Scheda Fibre originali.
        NOTA: le misure delle fibre selezionate verranno visualizzate in una tabella di output (Figura 5B) e le fibre corrispondenti saranno sovrapposte all'immagine originale mostrata nella figura a schede denominata Measured-Fibers (Figura 5C).
      6. Fare clic sul pulsante Conferma/Aggiorna per passare all'operazione di soglia.
      7. Selezionare la casella di soglia per abilitare le impostazioni di soglia.
      8. Scegliere una delle quattro opzioni di soglia dal menu a discesa.
      9. Immettere le soglie desiderate nel pannello Soglie per una o più proprietà della fibra.
      10. Fare clic sul pulsante Soglia ora per applicare le condizioni di soglia di cui sopra.
      11. Controllare la figura del prompt con il nome che termina con la visualizzazione delle metriche per vedere le fibre selezionate sovrapposte alle immagini originali con le mappe dei colori personalizzate, come illustrato nella figura 5E.
      12. Ripetere i passaggi da 3.3.2.9 a 3.3.2.11 per impostare le soglie desiderabili.
      13. Fare clic sul pulsante Salva fibre per salvare le informazioni sulla fibra selezionate.
        NOTA: le fibre selezionate corrispondenti verranno visualizzate nella figura della scheda denominata After-Thresholding.
      14. Fare clic sul pulsante Genera statistiche e quindi sul pulsante OK nella finestra popup per generare statistiche di riepilogo.
        NOTA: una tabella di output( Figura 5D) mostrerà il valore medio delle fibre selezionate. Altre statistiche delle fibre selezionate verranno salvate in un file excel la cui posizione viene visualizzata nella finestra di stato nella parte inferiore di questa GUI.
      15. Per includere le singole informazioni sulla fibra selezionata nel file di output, selezionare la casella Genera foglio per dati non elaborati prima di fare clic sul pulsante OK.
      16. Per combinare i risultati di più immagini, nel passaggio 3.3.2.4 selezionare la casella Modalità batch o stack mode e selezionare le più immagini o stack da analizzare; saltare i passaggi 3.3.2.5–3.3.2.6. Nei passaggi 3.3.2.8–3.3.2.9, impostare le condizioni di soglia, ma poiché la soglia dei pulsanti ora e Save Fibers sono disabilitati, saltare i passaggi 3.3.2.10–3.3.2.13; e infine, seguire le istruzioni del passaggio 3.3.2.14 per generare statistiche di riepilogo e proprietà delle singole fibre delle fibre selezionate.

4. Analisi delle fibre con CurveAlign

NOTA: CurveAlign è stato inizialmente sviluppato per misurare automaticamente gli angoli delle fibre rispetto ai limiti definiti dall'utente. La versione corrente di CurveAlign può essere utilizzata per la valutazione in blocco delle feature basate su densità e allineamento oltre alla misurazione relativa dell'angolo caricando le singole informazioni sulla fibra estratte da CT-FIRE o utilizzando direttamente l'orientamento locale delle curvelet. CurveAlign calcola fino a trenta funzionalità relative a caratteristiche globali o locali, tra cui principalmente densità e allineamento, nonché proprietà delle singole fibre quando CT-FIRE viene adottato come metodo di tracciamento delle fibre.

  1. Analisi delle fibre con curvelet
    1. Avviare l'APP come descritto al 2.3.
    2. Fare clic sul pulsante Reimposta per ripristinare lo stato iniziale dell'APP se sono state condotte altre operazioni.
    3. Nella GUI principale ( Figura6A), controllare l'opzione del metodo di analisi fibre per assicurarsi che CT sia selezionato (opzione predefinita).
      NOTA: In questa modalità, la TC viene eseguita sull'immagine e l'orientamento di ogni curva rappresenta la direzione di una fibra nella posizione corrispondente.
    4. Fate clic sul menu a discesa Metodo limite (Boundary method) e selezionate la modalità di elaborazione dei limiti tra le seguenti opzioni di menu a discesa: Nessun limite, Limite CSV e Limite TIFF.
      NOTA: se non è necessario alcun limite, ignorare questo passaggio. Fare riferimento a 4.3 per come calcolare gli angoli delle fibre rispetto a un limite.
    5. Fare clic sul pulsante Ottieni immagini nell'interfaccia utente grafica principale (Figura 6A), quindi selezionare una o più immagini/o stack di immagini dalla finestra del prompt. Usa la tecnica appropriata per il tuo sistema operativo per selezionare più immagini nella finestra di dialogo (ad esempio, in Windows, tieni premuto CTRL mentre selezioni più file).
      NOTA: se sono selezionati due o più file di immagine, tutte le immagini devono utilizzare gli stessi parametri in esecuzione per l'analisi. Assicurarsi che tutte le immagini siano acquisite nelle stesse condizioni o in condizioni simili.
    6. Per lo stack di immagini, spostare il dispositivo di scorrimento della sezione sotto la casella di riepilogo dei file per selezionare la sezione da analizzare.
    7. Immettere la frazione di fes per mantenere. Questo valore è la frazione dei più grandi coefficienti di TC che verranno utilizzati nell'analisi delle fibre.
      NOTA: Se l'immagine ha una grande variazione nell'intensità o nel contrasto della fibra, annotare le regioni di interesse con un contrasto uniforme per l'analisi delle fibre in quanto questa modalità rileva solo le fibre più luminose di un'immagine. Inoltre, maggiore è la dimensione dell'immagine, impostare un valore più piccolo per questa frazione.
    8. Mantenete tutti i parametri nelle opzioni di output e altri nell'opzione Avanzate come impostazione predefinita; i file di output potrebbero essere necessari in altre operazioni future.
    9. Fare clic sul pulsante Esegui nella parte inferiore della GUI principale (Figura 6A).
      NOTA: le informazioni sullo stato di avanzamento verranno visualizzate in una finestra di messaggio evidenziata in colore verde nella parte inferiore. Al termine del processo, alcune statistiche di riepilogo per ogni immagine verranno visualizzate nella tabella di output (Figura 6B) e tutti i file di output verranno salvati automaticamente in una sottocartella denominata CA_Out nella directory delle immagini originali.
    10. Fare clic su qualsiasi elemento della tabella di output (Figura 6B) per visualizzare l'istogramma (Figura 6E) o il grafico bussola (Figura 6F) degli angoli della fibra.
      NOTA: verranno visualizzate anche l'immagine sovrapposta (Figura 6C) e la mappa termica (Figura 6D) di allineamento o angolo.
    11. Fare clic sul pulsante Reimposta per eseguire altre operazioni oppure chiudere l'interfaccia utente grafica principale per uscire dall'APP.
  2. Analisi individuale delle fibre con CT-FIRE
    NOTA: La procedura è la stessa descritta nella sezione 4.1, tranne per il fatto che nel passaggio 4.1.3 selezionare la modalità di analisi della fibra correlata a CT-FIREe saltare il passaggio 4.1.7 in quanto non applicabile ed è disabilitato in modalità CT-FIRE. Nello specifico, nel passaggio 4.1.3, selezionare uno dei seguenti tre metodi di analisi delle fibre individuali basati su CT-FIRE:
    1. Selezionare FIBRE CT-FIRE per utilizzare il punto centrale della fibra e l'angolo della fibra per rappresentare la fibra.
      NOTA: Questa opzione non considera i cambiamenti nell'orientamento della fibra lungo la lunghezza della fibra.
    2. Selezionate Endpoint CT-FIRE per utilizzare i due punti finali di una fibra e l'angolo di fibra corrispondente per rappresentare la fibra.
      NOTA: Rispetto a 4.2.1, questa opzione utilizza due posizioni per rappresentare una fibra piuttosto che una (punto centrale della fibra).
    3. Selezionare segmenti CT-FIRE per utilizzare segmenti di una fibra per rappresentare la fibra.
      NOTA: Ogni segmento ha una lunghezza uguale (impostata su 5 pixel per impostazione predefinita in CT-FIRE) così come il suo orientamento e posizione, che riflette il cambiamento di orientamento lungo l'intera lunghezza della fibra. Questa opzione sarebbe la più dispendiosa in termini di tempo, ma sarebbe l'opzione migliore tra i tre metodi di analisi delle fibre basati su CT-FIRE per tenere traccia dei cambiamenti nell'orientamento locale di una fibra sinuosa.
  3. Analisi dell'allineamento relativo con i limiti
    NOTA: Rispetto all'analisi regolare senza condizioni limite descritta nelle sezioni 4.2 e 4.3, l'analisi relativa dell'allineamento con le condizioni limite richiede quanto segue:
    1. Nel passaggio 4.1.3 selezionare la condizione limite di tiff.
      NOTA: l'utente avrà bisogno di un file limite corrispondente per ogni immagine o ogni stack. Seguire le istruzioni visualizzate per annotare manualmente un file limite CSV (comma-separated-values format based, x-y coordinates) o un file limite Tiff. I file limite creati in CurveAlign verranno salvati automaticamente in base alle convenzioni di directory e denominazione dei file descritte nel manuale. Se viene fornita una coppia di immagini H&E a campo luminoso e SHG, utilizzare il modulo di creazione automatica dei limiti descritto nella sezione 4.4 per generare il file limite.
    2. Nel pannello Parametri primari, immettete la distanza dal limite più vicino per valutare solo le fibre all'interno di questo intervallo di distanza.
    3. Nel pannello Opzioni output , selezionare la casella associazione limiti Assoc Bdry per visualizzare il punto sul limite associato a una fibra, un segmento di fibra o una curva.
  4. Creazione automatica dei limiti
    1. Avviare l'APP come descritto al 2.3.
    2. Fare clic sul pulsante Reimposta per ripristinare lo stato iniziale dell'APP se sono già state condotte altre operazioni.
    3. Fare clic sul pulsante Creazione BD per avviare il modulo di creazione automatica dei limiti.
    4. Segui le istruzioni/indizi sullo schermo per creare un file limite per una o più immagini basate su una coppia di immagini H&E a campo luminoso e SHG.
    5. Chiudere la finestra del modulo oppure fare clic sul pulsante Reimposta nell'interfaccia utente grafica principale (Figura 6A) per chiudere il modulo.
  5. Analisi della regione di interesse CurveAlign
    1. Annotazione roi con ROI Manager
      1. Fare clic sul pulsante Ottieni immagini nell'interfaccia utente grafica principale (Figura 6A) per caricare una o più immagini.
      2. Selezionare l'immagine da annotare nell'elenco dei file.
      3. Fare clic su ROI Manager per avviare il modulo ROI Manager (Figura 7A).
      4. Seguire i passaggi 3.2.1.5–3.2.1.13 nella sezione 3.2.1.
    2. Analisi del ROI per una singola immagine in ROI Manager
      1. Se è stata eseguita l'analisi CurveAlign dell'immagine completa e i risultati vengono salvati nella directory predefinita, fare clic su una o più ROI nell'elenco ROI e quindi sul pulsante Analizzatore ROI CA per eseguire l'analisi post-ROI.
        NOTA: al termine dell'analisi, le statistiche di riepilogo verranno visualizzate in una tabella di output (Figura 7C) e in una figura dell'istogramma (Figura 7D) che mostra la distribuzione dell'angolo.
      2. Fare clic su qualsiasi elemento della tabella di output per visualizzare le fibre in un determinato ROI (Figura 7B) e l'istogramma degli angoli della fibra.
      3. Controllare i file di output salvati in una sottocartella che si trova in \\[cartella immagine]\ CA_ROI\Individual\ROI_post_analysis\.
      4. Se l'analisi ca a immagine completa non è stata condotta, fare clic su una o più ROI nell'elenco ROI e fare clic sul pulsante Applica CA sul ROI per applicare direttamente l'analisi CA alle ROI selezionate. Seguire le istruzioni nella finestra del prompt per eseguire l'analisi.
        NOTA: I parametri per l'esecuzione dell'analisi CA vengono passati attraverso la GUI principale; aggiornare i parametri in esecuzione descritti nel passaggio 4.1.7 in base alle esigenze. Al termine dell'analisi, i risultati delle statistiche di riepilogo delle misure in fibra verranno visualizzati nella tabella di output. I risultati verranno salvati automaticamente in una sottocartella che si trova in \\[cartella immagine]\ CA_ROI\Individual\ROI_analysis\.
    3. Analisi del ROI per più immagini tramite ROI Analyzer
      1. Seguire i passaggi descritti nella 4.5.1 per annotare le ROM per le immagini da analizzare.
      2. Aprire una o più immagini facendo clic sul pulsante Ottieni immagini.
      3. Per eseguire l'analisi post ROI quando sono disponibili i risultati completi dell'analisi delle immagini, fare clic sul pulsante Analisi ROI e selezionare l'opzione ROI post-elaborazione.
      4. Controllare le informazioni sullo stato visualizzate nella finestra del messaggio nella parte inferiore dell'interfaccia utente grafica e nella finestra di comando.
      5. Al termine dell'analisi, controllare le statistiche di riepilogo per ogni ROI visualizzato in una tabella di output.
        NOTA: i file di output dettagliati vengono salvati automaticamente in una sottocartella situata in \\ [cartella immagine]\CA_ROI\Batch\ROI_post_analysis\.
      6. Per eseguire un'analisi diretta con la modalità CT quando i risultati completi dell'analisi delle immagini non sono disponibili, attenersi alla procedura 4.5.3.1-4.5.3.5, ad eccezione delle modifiche seguenti: modificare il passaggio 4.5.3.3 selezionando l'opzione CA su ROI rettangolare ritagliato o CA su maschera con ROI di qualsiasi forma. Se tutte le ROI annotate sono di forma rettangolare, scegliere l'opzione ROI rettangolare. Dopo il passaggio 4.5.3.2, aggiornare i parametri in esecuzione, come descritto al 4.1.7.
        NOTA: i risultati dell'analisi del ROI verranno salvati in una sottocartella che si trova in \\ [cartella immagine]\CA_ROI\Batch\ROI_analysis\.
  6. Post-elaborazione di CurveAlign
    1. Avviare l'APP come descritto nella sezione 2.3.
    2. Fare clic sul pulsante Reimposta per ripristinare lo stato iniziale dell'APP se sono già state eseguite altre operazioni.
    3. Clicca sul pulsante Post-Elaborazione per avviare il modulo di post-elaborazione.
    4. Segui le istruzioni/indizi sullo schermo per combinare le funzionalità di output o i valori di immagini diverse.
    5. Chiudere la finestra del modulo oppure fare clic sul pulsante Reimposta nell'interfaccia utente grafica principale (Figura 6A) per chiudere il modulo.

5. Tempo di esecuzione stimato

  1. Attendere il tempo di esecuzione stimato per l'elaborazione di un'immagine con dimensioni di 1024 pixel x 1024 pixel con densità della fibra moderata. Il tempo computazionale effettivo dipende generalmente da più fattori, tra cui la dimensione del file, la modalità di analisi, le funzionalità da distribuire, il tipo di unità di elaborazione centrale (CPU) e la quantità di memoria ad accesso casuale disponibile (o RAM). L'estrazione individuale della fibra CT-FIRE richiede un paio di minuti. La modalità CT CurveAlign senza limite richiede alcuni secondi. La modalità curveAlign CT-FIRE in fibra o in fibra senza limite richiede decine di secondi. La modalità fibra CurveAlign CT-FIRE senza limite richiede centinaia di secondi. L'analisi CurveAlign con limite richiede da decine di secondi a diversi minuti, a seconda della complessità dei limiti.

Risultati

Questi metodi sono stati applicati con successo in numerosi studi. Alcune applicazioni tipiche includono: 1) Conklin etal. 10 ha utilizzato la modalità CT-FIRE in CurveAlign per quantificare l'allineamento del collagene stromale per l'adenocarcinoma duttale pancreatico e i tessuti pancreatititici normali/cronici e ha riscontrato un maggiore allineamento nei tessuti tumorali rispetto a quello dei tessuti normali/cronici; 3) Alkmin et al.7 ha utilizzato

Discussione

Questo protocollo descrive l'uso di CT-FIRE e CurveAlign per la quantificazione del collagene fibrilla e può essere applicato a qualsiasi immagine con fibre di collagene o altre strutture allungate simili a linee o fibre adatte per l'analisi da parte di CT-FIRE o CurveAlign. Ad esempio, l'elastina o le fibre elastiche potrebbero essere lavorate in modo simile su questa piattaforma. Abbiamo testato entrambi gli strumenti sulle fibre sintetiche generate computazally21. A seconda dell'applicazione, ...

Divulgazioni

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Riconoscimenti

Ringraziamo molti collaboratori e utenti di CT-FIRE e CurveAlign nel corso degli anni, incluso il Dr. Rob Nowak, Dr. Carolyn Pehlke, Dr. Jeremy Bredfeldt, Guneet Mehta, Andrew Leicht, Dr. Adib Keikhosravi, Dr. Matt Conklin, Dr. Jayne Squirrell, Dr. Paolo Provenzano, Dr. Brenda Ogle, Dr. Patricia Keely, Dr. Joseph Szulczewski, Dr. Suzanne Ponik e ulteriori contributi tecnici da Swati Anand e Curtis Rueden. Questo lavoro è stato supportato dai finanziamenti di Semiconductor Research Corporation, Morgridge Institute for Research e NIH sovvenzioni R01CA199996, R01CA181385 e U54CA210190 a K.W.E.

Materiali

NameCompanyCatalog NumberComments
CT-FIREUniverity of Wisconsin-MadisonN/Aopen source software available from https://eliceirilab.org/software/ctfire/
CurveAlignUniversity of Wisconsin-MadisonN/Aopen source software available from https://eliceirilab.org/software/curvealign/

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