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Résumé

Ici, nous présentons un protocole pour utiliser un outil logiciel MATLAB à base de transformation de courbes et open-source pour quantifier l’organisation du collagène fibrillar dans la matrice extracellulaire des tissus normaux et maladie. Cet outil peut être appliqué sur des images avec des fibres de collagène ou d’autres types de structures en ligne.

Résumé

Les collagènes fibrillaires sont des composants proéminents de matrice extracellulaire (ECM), et leurs changements de topologie se sont montrés associés à la progression d’un large éventail de maladies comprenant des cancers du sein, de l’ovaire, du rein, et du pancréas. Les outils logiciels de quantification des fibres librement disponibles sont principalement axés sur le calcul de l’alignement ou de l’orientation des fibres, et ils sont soumis à des limitations telles que l’exigence d’étapes manuelles, l’inexactitude dans la détection du bord de la fibre en arrière-plan bruyant, ou le manque de caractérisation localisée des fonctionnalités. L’outil de quantitation de fibre de collagène décrit dans ce protocole est caractérisé par l’utilisation d’une représentation optimale d’image multiscale permise par la transformation de courbe (CT). Cette approche algorithmique permet d’enlever le bruit des images de collagène fibrillaire et l’amélioration des bords de fibre pour fournir des informations d’emplacement et d’orientation directement à partir d’une fibre, plutôt que d’utiliser les informations indirectes pixel-sage ou fenêtre-sage obtenues à partir d’autres outils. Ce cadre basé sur le CT contient deux paquets distincts, mais liés, nommés « CT-FIRE » et « CurveAlign » qui peuvent quantifier l’organisation de la fibre sur une base globale, région d’intérêt (ROI), ou de fibre individuelle. Ce cadre de quantification a été développé depuis plus de dix ans et a maintenant évolué en une plate-forme complète et axée sur l’utilisateur quantification du collagène. En utilisant cette plate-forme, on peut mesurer jusqu’à une trentaine de caractéristiques de fibre, y compris les propriétés individuelles de fibre telles que la longueur, l’angle, la largeur et la droitité, ainsi que des mesures en vrac telles que la densité et l’alignement. En outre, l’utilisateur peut mesurer l’angle de fibre par rapport aux limites segmentées manuellement ou automatiquement. Cette plate-forme fournit également plusieurs modules supplémentaires, y compris ceux pour l’analyse du retour sur investissement, la création automatique des limites et le post-traitement. L’utilisation de cette plate-forme ne nécessite pas d’expérience préalable de la programmation ou du traitement d’image, et elle peut gérer de grands ensembles de données, y compris des centaines ou des milliers d’images, permettant une quantification efficace de l’organisation des fibres de collagène pour les applications biologiques ou biomédicales.

Introduction

Les collagènes fibrillaires sont des composants ECM structurels proéminents. Leur organisation modifie la fonction des tissus d’impact et sont probablement associés à la progression de nombreuses maladies allant de l’ostéogenèse imparfaite1, dysfonctioncardiaque 2, et la cicatrisationdes plaies 3 à différents types decancer,y compris lesein 4,5,6,7 ovarien,8, rein9, et les cancers du pancréas10. De nombreuses modalités d’imagerie établies peuvent être utilisées pour visualiser le collagène fibrillar tel que la microscopie de deuxième génération harmonique11,les taches ou les colorants en conjonction avec la microscopie à champ lumineux ou fluorescence ou la microscopie lumineuse polarisée12,la microscopie polarisation à base de cristaux liquides (LC-PolScope)13, et la microscopie électronique14. Comme l’importance de l’organisation du collagène fibrillaire est devenue plus claire, et l’utilisation de ces méthodes a augmenté, le besoin d’approches améliorées d’analyse des fibres de collagène a également augmenté.

Il y a eu beaucoup d’efforts pour développer des méthodes computationnelles pour la mesure automatisée du collagène fibrillar. Les outils logiciels librement disponibles sont principalement axés sur le calcul de l’alignement ou de l’orientation des fibres en adoptant soit le premier dérivé, soit le tenseur de structure pour les pixels15,16, ou l’analyse du spectre basé sur la transformation fourier pour les tuiles d’image17. Tous ces outils sont soumis à des limitations telles que l’exigence d’étapes manuelles, l’inexactitude dans la détection du bord de la fibre en arrière-plan bruyant, ou le manque de caractérisation localisée des fonctionnalités.

Par rapport à d’autres outils logiciels libres open source librement disponibles, les méthodes décrites dans ce protocole utilisent la Tomodensive — une méthode optimale, multiscale et directionnelle de représentation de l’image — pour éliminer le bruit des images de collagène fibrillaire et améliorer ou suivre les bords des fibres. Les informations sur l’emplacement et l’orientation peuvent être fournies directement à partir d’une fibre plutôt qu’en utilisant les informations indirectes pixel-sage ou fenêtre-sage pour déduire les mesures de l’organisation de fibre. Ce cadre basé sur la CT18,19,20,21 peut quantifier l’organisation de la fibre sur une base globale, roi, ou fibre, principalement via deux ensembles distincts, mais liés, nommés « CT-FIRE »18,21 et « CurveAlign »19,21. En ce qui concerne la mise en œuvre du logiciel, dans CT-FIRE, des coefficients de CT sur plusieurs échelles peuvent être utilisés pour reconstruire une image qui améliore les bords et réduit le bruit. Ensuite, un algorithme individuel d’extraction de fibres est appliqué à l’image reconstruite par CT pour suivre les fibres pour trouver leurs points de centre représentatifs, étendre les branches de fibre des points du centre, et relier les branches de fibre pour former un réseau de fibres. Dans CurveAlign, les coefficients de CT sur une échelle spécifiée par l’utilisateur peuvent être utilisés pour suivre l’orientation des fibres locales, où l’orientation et l’emplacement des courbes sont extraits et regroupés pour estimer l’orientation de la fibre aux emplacements correspondants. Ce cadre de quantification qui en résulte est développé depuis plus de dix ans et a beaucoup évolué dans de nombreux aspects tels que la fonctionnalité, l’interface utilisateur et la modularité. Par exemple, cet outil peut visualiser l’orientation locale de fibre et permet à l’utilisateur de mesurer jusqu’à trente dispositifs de fibre comprenant des propriétés individuelles de fibre telles que la longueur, l’angle, la largeur, et la droitivité, aussi bien que des mesures en vrac telles que la densité et l’alignement. En outre, l’utilisateur peut mesurer l’angle de fibre par rapport aux limites segmentées manuellement ou automatiquement, qui, par exemple, joue un rôle important dans le développement de biomarqueurs basés sur l’image dans le cancer dusein 22 et les études sur le cancer du pancréas10. Cette plate-forme fournit plusieurs modules de fonctionnalités, y compris ceux pour l’analyse du retour sur investissement, la création automatique des limites et le post-traitement. Le module roi peut être utilisé pour annoter différentes formes de retour sur investissement et effectuer une analyse de retour sur investissement correspondante. À titre d’exemple d’application, le module automatique de création de limites peut être utilisé pour enregistrer des images en champ lumineux d’hématoxyline et d’éosine (H&E) avec des images de deuxième génération harmonique (SHG) et générer le masque d’image des limites tumorales à partir des images H&E enregistrées. Le module de post-traitement peut faciliter le traitement et l’intégration des fichiers de données de sortie à partir d’images individuelles pour une analyse statistique possible.

Cette plate-forme de quantification ne nécessite pas d’expérience préalable de la programmation ou du traitement d’images et peut gérer de grands ensembles de données, y compris des centaines ou des milliers d’images, permettant une quantification efficace de l’organisation du collagène pour les applications biologiques ou biomédicales. Il a été largement utilisé dans différents domaines de recherche par de nombreux chercheurs du monde entier, y compris nous-mêmes. Il existe quatre publications principales sur CT-FIRE et CurveAlign18,19,20,21, dont les trois premières ont été citées 272 fois (en 2020-05-04 selon Google Scholar). Un examen des publications qui ont cité cette plate-forme (CT-FIRE ou CurveAlign) indique qu’environ 110 articles de revues l’ont directement utilisé pour leur analyse, dans lesquels environ 35 publications ont été en collaboration avec notre groupe, et les autres (~ 75) ont été écrites par d’autres groupes. Par exemple, cette plate-forme a été utilisée pour les études suivantes: cancer dusein 22,23,24, cancer du pancréas10,25, cancer du rein9,26, cicatrisation desplaies 3,27,28,29,30, cancer del’ovaire 8,31,7, ligament utérinacral32, dentine hypophosphatemique33, carcinome basocellulaire34, sarcome hypoxique35, tissu cartilagineux36, dysfonction cardiaque37, neurones38, glioblastome39, contractions lymphatiques40, cacffolds fibreux41, cancer gastrique42, microtubule43, et fibrose de la vessie44. La figure 1 démontre l’application d’imagerie cancéreuse de CurveAlign pour trouver les signatures de collagène associées à la tumeur du cancer dusein 19 à partir de l’image SHG. La figure 2 décrit un flux de travail schématique typique de cette plate-forme. Bien que ces outils aient été examinéstechniquement 18,19,21, et un protocole régulier20 pour l’analyse d’alignement avec CurveAlign est également disponible, un protocole visuel qui démontre toutes les caractéristiques essentielles pourrait être utile. Un protocole visualisé, tel que présenté ici, facilitera le processus d’apprentissage de l’utilisation de cette plate-forme ainsi que de répondre plus efficacement aux préoccupations et aux questions que les utilisateurs pourraient avoir.

Protocole

REMARQUE : Ce protocole décrit l’utilisation de CT-FIRE et curveAlign pour la quantification du collagène. Ces deux outils ont des objectifs principaux complémentaires, mais différents, et sont liés dans une certaine mesure. CT-FIRE peut être lancé à partir de l’interface CurveAlign pour effectuer la plupart des opérations, à l’exception d’une analyse avancée du post-traitement et du retour sur investissement. Pour une opération complète de CT-FIRE, il doit être lancé séparément.

1. Collection d’images et exigence d’image

REMARQUE : L’outil peut traiter n’importe quel fichier d’image avec des structures en ligne lisibles par MATLAB indépendamment de la modalité d’imagerie utilisée pour le collecter.

  1. Utilisez l’échelle grise 8 bits comme type d’image car les paramètres de fonctionnement par défaut sont basés sur ce format.
    REMARQUE : L’imagerie SHG est une méthode d’imagerie par collagène fibrillaire sans étiquette et haute résolution largement utilisée. Les images SHG d’une étude sur le cancerdu sein 19 seront utilisées ici à des fins de démonstration.

2. Installation logicielle et exigence du système

REMARQUE : Les versions autonomes et source-code sont disponibles gratuitement. La version de code source nécessite une installation MATLAB complète comprenant des boîtes à outils de traitement de signal, de traitement d’image, d’analyse statistique et d’informatique parallèle. Pour exécuter la version code source, tous les dossiers nécessaires, y compris certains provenant de sources tierce, doivent être ajoutés au chemin MATLAB. L’utilisation de l’application autonome (APP) est recommandée pour la plupart des utilisateurs, ce qui nécessite l’installation d’un runtime compilateur MATLAB (MCR) librement disponible de la version spécifiée. La procédure d’installation et de lancement de l’APP est décrite ci-dessous.

  1. Téléchargez les paquets APP CT-FIRE version 3.0 (CTF3.0) et CurveAlign Version 5.0 (CA5.0) de https://eliceirilab.org/software/ctfire/ et https://eliceirilab.org/software/curvealign/, respectivement.
    REMARQUE : Chaque paquet comprend les images app, manuelles et de test autonomes.
  2. Suivez les exigences détaillées et les instructions d’installation des sites Web ci-dessus pour installer MATLAB MCR 2018b.
  3. Lancez l’APP.
    1. Pour un système Windows 64 bits, cliquez deux fois sur l’icône APP pour le lancer.
    2. Pour un système Mac, suivez les étapes suivantes pour le lancer : Cliquez à droite sur l’APP (ctrl-click) | Afficher le contenu du paquet | Contenu | MacOS | applauncher (clic droit et choisir ouvert).
      REMARQUE : D’autres détails peuvent être vus dans les sites Web logiciels répertoriés dans 2.1.

3. Extraction individuelle de fibre avec CT-FIRE

REMARQUE : CT-FIRE utilise le CT pour dénoiser l’image, améliorer les bords de fibre, puis utilise un algorithme d’extraction de fibres pour suivre les fibres individuelles. La longueur, l’angle, la largeur et la droitité sont calculés pour les fibres individuelles.

  1. CT-FIRE sur une seule image ou plusieurs images
    1. Lancez l’APP tel que décrit dans 2.3.
    2. Cliquez sur le bouton Open File(s) dans l’interface utilisateur graphique principale (GUI, Figure 3A),puis sélectionnez une ou plusieurs piles d’images/ou d’images à partir de la fenêtre d’invite. Utilisez la technique appropriée pour que le système d’exploitation sélectionne plusieurs images dans le dialogue (par exemple, dans Windows, maintenez CTRL tout en sélectionnant plusieurs fichiers).
      REMARQUE : Si deux fichiers d’image ou plus sont sélectionnés, toutes les images doivent utiliser les mêmes paramètres de fonctionnement pour l’analyse. Assurez-vous que toutes les images sont acquises dans les mêmes conditions ou dans des conditions similaires.
    3. Sélectionnez des options informatiques parallèles en vérifiant la case à cocher Parallel dans le coin supérieur droit pour l’analyse de plusieurs images.
    4. Pour la pile d’images, déplacez le curseur de tranches sous la boîte de liste de fichiers pour sélectionner la tranche à analyser.
    5. Définissez les propriétés en cours d’exécution. Utilisez des paramètres par défaut pour une analyse initiale de certaines images. Si vous utilisez des paramètres par défaut, passez à l’étape 3.1.6. Pour définir différents paramètres, cliquez sur le bouton Mise à jour dans le panneau Paramètres. Suivez le manuel pour régler correctement les paramètres.
      REMARQUE : Les paramètres les plus fréquemment ajustés incluent le seuild’arrière-plan (thresh_im2)et le rayon de recherche de nucléation(s_xlinkbox). Si le niveau de bruit de fond est élevé, réglez thresh_im2 à une plus grande valeur; s_xlinkbox est associé au rayon moyen des fibres, définir une plus petite valeur pour détecter les fibres minces.
    6. Cliquez sur le bouton Exécuter.
      REMARQUE : Les informations de progression seront affichées à la fois dans la fenêtre d’information et dans la fenêtre de commande. Une fois l’analyse terminée, la table de sortie sera affichée(figure 3B).
    7. Cliquez sur n’importe quel élément de la table de sortie pour voir l’histogramme des mesures de fibre (figure 3C et figure 3F) de l’image, y compris la longueur, la largeur, l’angle et la droitité.
      REMARQUE : Les images en fibre avec des fibres superposées sur l’image d’origine seront également affichées (Figure 3E).
    8. Vérifiez le sous-foldeur nommé ctFIREout sous le dossier d’image pour les fichiers de sortie, y compris le fichier d’image superposé « .tiff », « .csv » fichier, et « .mat » fichier.
  2. Analyse de la région d’intérêt CT-FIRE (ROI)
    1. Annotation roi à l’aide de ROI Manager
      1. Cliquez sur le bouton Open File(s) de l’interface graphique principale(figure 3A)pour charger une ou plusieurs images.
      2. Sélectionnez l’image à annoter dans la liste des fichiers.
      3. Sélectionnez le gestionnaire de retour sur investissement dans le menu dropdown du panneau Options roi.
      4. Cliquez sur le bouton RUN pour lancer le module ROI Manager (Figure 3A).
      5. Dans l’interface graphique du gestionnaire roi (Figure 4A), cliquez sur le menu dropdown ci-dessous Draw ROI Menu(d) pour dessiner les ROM, un par un.
        REMARQUE : La forme roi peut être rectangle, à main levée, ellipse, polygone ou rectangle spécifié. Suivez les instructions à l’écran pour dessiner, enregistrer et arrêter l’annotation du retour sur investissement.
      6. Après avoir sélectionné la méthode pour dessiner le roi, faites glisser le rectangle jaune qui apparaît sur l’image d’origine à la position désirée, puis cliquez sur le bouton Save ROI(s) ou appuyez sur la touche s pour ajouter ce retour sur investissement à la liste roi. Ce retour sur investissement sera automatiquement nommé.
      7. Tirez un nouveau roi en faisant glisser le roi précédent à une nouvelle position, et enregistrez-le comme mentionné dans 3.2.1.6, ou répétez les étapes 3.2.1.5-3.2.1.6 pour tirer un nouveau roi.
      8. Appuyez sur x ou sélectionnez Nouveau ROI? dans le menu de dropdown forme ROI pour quitter l’annotation roi.
      9. Consultez les cases à cocher Afficher tous et les étiquettes pour afficher toutes les IA définies sur la liste et leurs noms sur l’image originale.
      10. Sélectionnez le retour sur investissement sur la liste roi pour mener des opérations de retour sur investissement de base,y compris Rename ROI , Delete ROI, Save ROI Text, Load ROI from Text, Save ROI Mask, Load ROI from Mask, et Combiner ROIs.
      11. Vérifiez le fichier de sortie du gestionnaire roi enregistré sous forme de fichier « .mat » dans un sous-foldeur nommé ROI_management le dossier d’image d’origine.
      12. Pour annoter une autre image dans la liste de fichiers ouverte, répétez les étapes 3.2.1.2-3.2.1.11.
      13. Une fois l’annotation terminée, fermez l’interface graphique du gestionnaire roi et réinitialisez l’interface graphique principale en cliquant sur le bouton Réinitialisation de l’interface graphique principale.
    2. Analyse du retour sur investissement pour une seule image dans ROI Manager
      1. Si l’analyse CT-FIRE à image complète est effectuée et que les résultats sont enregistrés dans l’annuaire par défaut, cliquez sur un ou plusieurs ROM de la liste roi, cliquez sur le bouton analyseur ctFIRE ROI pour lancer le module d’analyse Post-ROI.
        REMARQUE : Les résultats seront automatiquement enregistrés dans un sous-foldeur situé à \\[dossier d’image]\ CTF_ROI\Individual\ROI_post_analysis\.
      2. Dans la fenêtre contextée, cliquez sur le bouton Check Fibers pour afficher les fibres dans les IA sélectionnés (Figure 4B).
      3. Cliquez sur Les statistiques de parcelle pour afficher les histogrammes de chaque retour sur investissement( Figure 4C). Les chiffres de sortie correspondants seront affichés.
      4. Si l’analyse CT-FIRE complète de l’image n’a pas été effectuée, cliquez sur un ou plusieurs ROM de la liste roi et cliquez sur le bouton Appliquer ctFIRE sur roi pour appliquer directement l’analyse CT-FIRE aux ROM sélectionnés.
      5. Suivez les instructions dans la fenêtre d’invite pour exécuter l’analyse.
        REMARQUE : Les paramètres d’exécution du CT-FIRE sont passés par l’interface graphique principale, et l’utilisateur peut mettre à jour les paramètres d’exécution tels que décrits à l’étape 3.1.5 au besoin. Une fois l’analyse terminée, les statistiques sommaires des mesures de fibre seront affichées dans le tableau de sortie. Les résultats seront automatiquement enregistrés dans un sous-foldeur situé à \\[dossier d’image]\ CTF_ROI\Individual\ROI_analysis\.
    3. Analyse du retour sur investissement pour plusieurs images à l’aide de ROI Analyzer
      1. Suivez les étapes en 3.2.1 pour annoter les IA pour que les images soient analysées.
      2. Ouvrez une ou plusieurs images en cliquant sur le bouton Open File(s).
      3. Pour exécuter l’analyse de la publication roi lorsque les résultats complets de l’analyse d’image sont disponibles, cliquez sur le menu dropdown dans le panneau Options d’exécuter et sélectionnez l’analyseur post-ROI de la FCE.
      4. Cliquez sur le bouton RUN pour exécuter l’analyse du retour sur investissement pour toutes les images chargées.
      5. Vérifiez les informations de progression affichées dans la fenêtre de message en bas de l’interface graphique et dans la fenêtre de commande.
      6. Une fois l’analyse terminée, consultez les statistiques sommaires pour chaque retour sur investissement affiché dans un tableau de sortie.
        REMARQUE : Les fichiers de sortie détaillés sont automatiquement enregistrés dans un sous-foldeur situé à \\ [dossier d’image]\CTF_ROI\Batch\ROI_post_analysis\.
      7. Pour exécuter une analyse directe lorsque les résultats complets de l’analyse d’image ne sont pas disponibles, suivez les étapes 3.2.3.1-3.2.3.6, sauf qu’à l’étape 3.2.3.3, sélectionnez l’option CTF ROI analyserr; à l’étape 3.2.3.4, avant de cliquer sur le bouton RUN, mettez à jour les paramètres de fonctionnement décrits à l’étape 3.1.5. Après avoir cliqué sur le bouton RUN, dans une fenêtre de dialogue rapide, choisissez entre le roi rectangulaire et le masque roi de n’importe quelle forme.
        REMARQUE : Si toutes les IA annotées sont rectangulaires, l’utilisateur peut choisir le « retour sur investissement rectangulaire ». Dans l’étape 3.2.3.6, les résultats de l’analyse roi sont enregistrés dans un sous-foldeur situé à \\[dossier d’image]\CTF_ROI\Batch\ROI_analysis\.
  3. Post-traitement avec CT-FIRE
    REMARQUE : Après l’analyse CT-FIRE régulière décrite dans 3.1, l’utilisateur peut effectuer d’autres post-traitement. Sans exécuter l’extraction de fibre de temps encore, le post-traitement régulier, décrit dans 3.3.1, peut mettre à jour quelques propriétés de figure de sortie de base, tandis que le post-traitement avancé décrit dans 3.3.2 peut visualiser les fibres individuelles et leurs propriétés, exécuter le seuil complexe parmi les quatre propriétés de fibre, générer des statistiques sommaires des fibres sélectionnées, et visualiser les fibres sélectionnées à l’aide d’une carte de couleur personnalisée.
    1. Post-traitement régulier avec CT-FIRE
      1. Lancez l’application CT-FIRE ou cliquez sur le bouton Réinitialisation après d’autres opérations pour paraphér l’interface graphique principale CT-FIRE (Figure 3A).
      2. Vérifiez la case à cocher .mat sur le dessus de l’interface graphique principale.
      3. Cliquez sur le bouton Open File(s) pour sélectionner le fichier CT-FIRE output .mat dans le sous-document ctFIREout.
        REMARQUE : Si plusieurs fichiers sont sélectionnés, la case à cocher batch sera vérifiée automatiquement. Le nom du fichier des images correspondantes sera affiché dans la liste des boîtes.
      4. Mettez à jour les options dans le panneau de contrôle des chiffres de sortie.
      5. Conservez les options par défaut dans options desortie , qui s’assurera que tous les fichiers de sortie seront mis à jour en fonction du nouvel ensemble de paramètres définis dans 3.3.1.4.
      6. Cliquez sur le bouton Post-traitement. Vérifiez les informations de progression dans la fenêtre de message au bas de l’interface graphique principale ainsi que dans la fenêtre de commande.
      7. Une fois l’analyse terminée, cliquez sur n’importe quel élément de la table de sortie pour voir l’histogramme des mesures de fibre de l’image, y compris la longueur, la largeur, l’angle et la droitité.
        REMARQUE : Les nouveaux fichiers de sortie écraseront les anciens dans le sous-foldeur ctFIREout.
    2. Post-traitement avancé de CT-FIRE
      1. Lancez l’application CT-FIRE ou cliquez sur le bouton Réinitialisation après d’autres opérations pour paraphér l’interface graphique principale CT-FIRE (Figure 3A).
      2. Consultez la case à cocher OUT.adv en haut de l’interface graphique principale (Figure 3A).
      3. Cliquez sur le bouton Post-traitement pour lancer l’interface graphique post-traitement avancée nommée «Module d’analyse» (Figure 5A).
      4. Cliquez sur le bouton Sélectionnez fichier pour sélectionner une image.
      5. Cliquez sur le bouton Visualise Fibers pour entrer le numéro de fibre en fonction des étiquettes de la figure Tab Original-fibers.
        REMARQUE : Les mesures des fibres sélectionnées seront affichées dans une table de sortie (figure 5B), et les fibres correspondantes seront superposées sur l’image originale indiquée dans la figure de l’onglet nommée Fibres mesurées (Figure 5C).
      6. Cliquez sur le bouton Confirmer/Mise à jour pour passer à l’opération de seuil.
      7. Cochez la case de seuil pour activer les paramètres du seuil.
      8. Choisissez l’une des quatre options de seuil du menu dropdown.
      9. Entrez les seuils désirés dans le panneau Seuils pour une ou plusieurs propriétés de fibre.
      10. Cliquez sur le bouton Threshold Now pour appliquer les conditions de seuil ci-dessus.
      11. Vérifiez la figure rapide avec son nom se terminant par la visualisation des mesures pour voir les fibres sélectionnées superposées sur les images originales avec les cartes couleur personnalisées comme indiqué dans la figure 5E.
      12. Répétez les étapes 3.3.2.9-3.3.2.11 pour fixer les seuils souhaitables.
      13. Cliquez sur le bouton Enregistrer les fibres pour enregistrer les informations fibre sélectionnées.
        REMARQUE : Les fibres sélectionnées correspondantes seront affichées dans la figure de l’onglet nommée After-Thresholding.
      14. Cliquez sur le bouton Générer des statistiques, puis cliquez sur le bouton OK dans la fenêtre contexturée pour générer des statistiques sommaires.
        REMARQUE : Une table de sortie( Figure 5D) affichera la valeur moyenne des fibres sélectionnées. D’autres statistiques des fibres sélectionnées seront enregistrées dans un fichier Excel dont l’emplacement est affiché dans la fenêtre d’état au bas de cette interface graphique.
      15. Pour inclure les informations de fibre individuelles sélectionnées dans le fichier de sortie, cochez la feuille Générer pour la boîte de données brutes avant de cliquer sur le bouton OK.
      16. Pour combiner les résultats de plusieurs images, à l’étape 3.3.2.4, cochez la case mode batch ou le mode Stack et sélectionnez les multiples images ou stack(s) à analyser; sauter les étapes 3.3.2.5-3.3.2.6. Dans les étapes 3.3.2.8-3.3.2.9, définissez les conditions de seuil, mais comme le seuil de boutons maintenant et Save Fibers sont désactivés, sautez les étapes 3.3.2.10-3.3.2.13; et enfin, suivez les instructions dans l’étape 3.3.2.14 pour générer des statistiques sommaires et des propriétés individuelles de fibre des fibres sélectionnées.

4. Analyse de fibre avec CurveAlign

REMARQUE : CurveAlign a d’abord été développé pour mesurer automatiquement les angles des fibres par rapport aux limites définies par l’utilisateur. La version actuelle de CurveAlign peut être utilisée pour l’évaluation en vrac des caractéristiques basées sur la densité et l’alignement en plus de la mesure de l’angle relatif en chargeant les informations individuelles sur les fibres extraites par CT-FIRE ou en utilisant directement l’orientation locale des courbes. CurveAlign calcule jusqu’à trente fonctionnalités liées à des caractéristiques globales ou locales, y compris principalement la densité et l’alignement ainsi que les propriétés individuelles des fibres lorsque CT-FIRE est adopté comme méthode de suivi des fibres.

  1. Analyse des fibres avec des courbes
    1. Lancez l’APP tel que décrit dans 2.3.
    2. Cliquez sur le bouton Réinitialisation pour réinitialiser l’APP à son état initial si d’autres opérations ont été effectuées.
    3. Dans l’interface graphique principale (Figure 6A), vérifiez l’option méthode d’analyse des fibres pour vous assurer que CT est sélectionné (option par défaut).
      REMARQUE : Dans ce mode, le CT est effectué sur l’image, et l’orientation de chaque courbe représente la direction d’une fibre à l’emplacement correspondant.
    4. Cliquez sur le menu dropdown de la méthode Boundary et sélectionnez le mode de traitement des limites à partir des options de menu de dropdown suivantes : No Boundary, CSV Boundary et TIFF Boundary.
      REMARQUE : Si aucune limite n’est nécessaire, sautez cette étape. Reportez-vous à 4,3 pour calculer les angles de fibre par rapport à une limite.
    5. Cliquez sur le bouton Get Image(s) dans l’interface graphique principale(figure 6A),puis sélectionnez une ou plusieurs images/ou piles d’images à partir de la fenêtre d’invite. Utilisez la technique appropriée pour votre système d’exploitation pour sélectionner plusieurs images dans le dialogue (par exemple, dans Windows, maintenez CTRL tout en sélectionnant plusieurs fichiers).
      REMARQUE : Si deux fichiers d’image ou plus sont sélectionnés, toutes les images doivent utiliser les mêmes paramètres d’exécution pour l’analyse. Assurez-vous que toutes les images sont acquises dans les mêmes conditions ou dans des conditions similaires.
    6. Pour la pile d’images, déplacez le curseur de tranches sous la boîte de liste de fichiers pour sélectionner la tranche à analyser.
    7. Entrez la fraction des coefs à garder. Cette valeur est la fraction des plus grands coefficients de CT qui seront utilisés dans l’analyse des fibres.
      REMARQUE : Si l’image a une grande variation dans l’intensité ou le contraste de fibre, annotez des régions d’intérêt avec le contraste même pour l’analyse de fibre car ce mode détecte seulement les fibres les plus lumineuses dans une image. En outre, plus la taille de l’image est grande, définir une valeur plus petite pour cette fraction.
    8. Gardez tous les paramètres dans les options de sortie et d’autres dans l’option Avancée comme valeur par défaut; les fichiers de sortie peuvent être nécessaires dans d’autres opérations futures.
    9. Cliquez sur le bouton Exécuter en bas de l’interface graphique principale (Figure 6A).
      REMARQUE : Les informations de progression seront affichées dans une fenêtre de message mise en surbrillance en couleur verte en bas. Une fois le processus terminé, certaines statistiques sommaires pour chaque image seront affichées dans la table de sortie(figure 6B),et tous les fichiers de sortie seront automatiquement enregistrés dans un sous-dossier nommé CA_Out dans l’annuaire de l’image originale.
    10. Cliquez sur n’importe quel élément de la table de sortie (Figure 6B) pour voir l’histogramme (Figure 6E) ou l’intrigue de boussole (Figure 6F) des angles de fibre.
      REMARQUE : L’image de superposition (figure 6C) et la carte thermique (figure 6D) de l’alignement ou de l’angle seront également affichées.
    11. Cliquez sur le bouton Réinitialisation pour exécuter d’autres opérations ou fermez l’interface graphique principale pour quitter l’APPLICATION.
  2. Analyse individuelle des fibres avec CT-FIRE
    REMARQUE : La procédure est la même que celle décrite à la section 4.1, sauf qu’à l’étape 4.1.3, sélectionnez le mode d’analyse des fibres liées au CT-FIREet sautez l’étape 4.1.7 car elle n’est pas applicable et est désactivée en mode CT-FIRE. Plus précisément, à l’étape 4.1.3, sélectionnez l’une des trois méthodes d’analyse de fibres individuelles basées sur le CT-FIRE suivantes :
    1. Sélectionnez fibres CT-FIRE pour utiliser le point central de la fibre et l’angle de la fibre pour représenter la fibre.
      REMARQUE : Cette option ne tient pas compte des changements dans l’orientation des fibres le long de la longueur de la fibre.
    2. Sélectionnez les critères d’évaluation CT-FIRE pour utiliser les deux points d’évaluation d’une fibre et l’angle de fibre correspondant pour représenter la fibre.
      REMARQUE : Par rapport à 4,2,1, cette option utilise deux positions pour représenter une fibre plutôt qu’une (point central de la fibre).
    3. Sélectionnez segments CT-FIRE pour utiliser des segments d’une fibre pour représenter la fibre.
      REMARQUE : Chaque segment a une longueur égale (réglée à 5 pixels par défaut dans CT-FIRE) ainsi que son orientation et son emplacement, ce qui reflète le changement d’orientation sur toute la longueur de la fibre. Cette option serait la plus longue, mais serait la meilleure option parmi les trois méthodes d’analyse de fibres à base de CT-FIRE pour suivre les changements dans l’orientation locale d’une fibre sinueuse.
  3. Analyse relative de l’alignement avec la limite
    REMARQUE : Par rapport à l’analyse régulière sans conditions limites décrites dans les sections 4.2 et 4.3, l’analyse relative de l’alignement avec les conditions limites doit être la suivante :
    1. À l’étape 4.1.3, sélectionnez l’état limite du tiff.
      REMARQUE : L’utilisateur aura besoin d’un fichier de limite correspondant pour chaque image ou chaque pile. Suivez les instructions à l’écran pour annoter manuellement soit un fichier de limite CSV (format de valeurs séparées de virgule, coordonnées x-y) ou un fichier de limite Tiff. Les fichiers limites créés dans CurveAlign seront automatiquement enregistrés en fonction de l’annuaire des fichiers et des conventions de nommage de fichiers décrites dans le manuel. Si une paire d’images H&E bright-field et SHG sont fournies, utilisez le module de création automatique des limites décrit à la section 4.4 pour générer le fichier limite.
    2. Dans le panneau Paramètres primaires, entrez la distance par rapport à la limite la plus proche pour évaluer uniquement les fibres dans cette plage de distance.
    3. Dans le panneau Options de sortie, cochez la case d’association de limite Bdry Assoc pour visualiser le point sur la limite qui est associé à une fibre, un segment de fibre ou un curvelet.
  4. Création automatique des limites
    1. Lancez l’APP tel que décrit dans 2.3.
    2. Cliquez sur le bouton Réinitialisation pour réinitialiser l’APP à son état initial si d’autres opérations ont déjà été menées.
    3. Cliquez sur le bouton Création BD pour lancer le module de création de limites automatique.
    4. Suivez les instructions/indices à l’écran pour créer un fichier limite pour une ou plusieurs images basées sur une paire d’images H&E bright-field et SHG.
    5. Fermez la fenêtre du module ou cliquez sur le bouton Réinitialisation de l’interface graphique principale (Figure 6A) pour quitter ce module.
  5. CurveAlign région d’analyse d’intérêt
    1. Annotation roi à l’aide de ROI Manager
      1. Cliquez sur le bouton Get Image(s) dans l’interface graphique principale (Figure 6A) pour charger une ou plusieurs images.
      2. Sélectionnez l’image à annoter dans la liste des fichiers.
      3. Cliquez sur le gestionnaire roi pour lancer le module ROI Manager (Figure 7A).
      4. Suivez les étapes 3.2.1.5-3.2.1.13 dans la section 3.2.1.
    2. Analyse du retour sur investissement pour une seule image dans ROI Manager
      1. Si l’analyse courbe d’image complète a été effectuée et que les résultats sont enregistrés dans l’annuaire par défaut, cliquez sur une ou plusieurs IA dans la liste roi, puis cliquez sur le bouton Analyseur CA ROI pour exécuter l’analyse post-ROI.
        REMARQUE : Une fois l’analyse terminée, des statistiques sommaires seront affichées dans un tableau de sortie (figure 7C) ainsi qu’une figure d’histogramme (figure 7D) montrant la répartition de l’angle.
      2. Cliquez sur n’importe quel élément de la table de sortie pour visualiser les fibres dans un retour sur investissement donné (Figure 7B) ainsi que l’histogramme des angles de fibre.
      3. Vérifiez les fichiers de sortie enregistrés dans un sous-foldeur situé à \\[dossier d’image]\ CA_ROI\Individual\ROI_post_analysis\.
      4. Si l’analyse ca pleine image n’a pas été effectuée, cliquez sur un ou plusieurs ROM dans la liste roi, et cliquez sur le bouton Appliquer CA sur roi pour appliquer directement l’analyse CA aux ROM sélectionnés. Suivez les instructions dans la fenêtre d’invite pour exécuter l’analyse.
        REMARQUE : Les paramètres d’exécution de l’analyse CA sont passés par l’interface graphique principale; mettre à jour les paramètres de fonctionnement décrits à l’étape 4.1.7 au besoin. Une fois l’analyse terminée, les résultats des statistiques sommaires des mesures de fibre seront affichés dans le tableau de sortie. Les résultats seront automatiquement enregistrés dans un sous-foldeur situé à \\[dossier d’image]\ CA_ROI\Individual\ROI_analysis\.
    3. Analyse du retour sur investissement pour plusieurs images à l’aide de ROI Analyzer
      1. Suivez les étapes en 4.5.1 pour annoter les IA pour que les images soient analysées.
      2. Ouvrez une ou plusieurs images en cliquant sur le bouton Get Image(s).
      3. Pour exécuter l’analyse de la publication roi lorsque les résultats complets de l’analyse d’image sont disponibles, cliquez sur le bouton Analyse roi et sélectionnez l’option ROI post-traitement.
      4. Vérifiez les informations de progression affichées dans la fenêtre de message en bas de l’interface graphique et dans la fenêtre de commande.
      5. Une fois l’analyse terminée, consultez les statistiques sommaires pour chaque retour sur investissement affiché dans un tableau de sortie.
        REMARQUE : Les fichiers de sortie détaillés sont automatiquement enregistrés dans un sous-foldeur situé à \\ [dossier d’image]\CA_ROI\Batch\ROI_post_analysis\.
      6. Pour exécuter une analyse directe avec le mode CT lorsque les résultats complets de l’analyse d’image ne sont pas disponibles, suivez les étapes 4.5.3.1-4.5.3.5, à l’exception des modifications suivantes : modifiez l’étape 4.5.3.3 en sélectionnant l’option CA sur le roi rectangulaire rectangulaire recadré ou CA sur masque avec roi de n’importe quelle forme. Si toutes les IA annotées sont de forme rectangulaire, choisissez l’option roi rectangulaire. Après l’étape 4.5.3.2, mettez à jour les paramètres de fonctionnement, tels que décrits dans 4.1.7.
        REMARQUE : Les résultats de l’analyse roi seront enregistrés dans un sous-foldeur situé à \\ [dossier d’image]\CA_ROI\Batch\ROI_analysis\.
  6. Post-traitement de CurveAlign
    1. Lancez l’APP tel que décrit à la section 2.3.
    2. Cliquez sur le bouton Réinitialisation pour réinitialiser l’APP à son état initial si d’autres opérations ont déjà été effectuées.
    3. Cliquez sur le bouton Post-Processing pour lancer le module post-traitement.
    4. Suivez les instructions/indices à l’écran pour combiner les fonctionnalités de sortie ou les valeurs de différentes images.
    5. Fermez la fenêtre du module ou cliquez sur le bouton Réinitialisation de l’interface graphique principale (Figure 6A) pour quitter ce module.

5. Durée de fonctionnement estimée

  1. Attendez le temps de fonctionnement estimé pour le traitement d’une image d’une taille de 1024 pixels x 1024 pixels avec une densité de fibre modérée. Le temps de calcul réel dépend généralement de plusieurs facteurs, y compris la taille du fichier, le mode d’analyse, les fonctionnalités à déployer, le type d’unité centrale de traitement (Processeur) et la quantité de mémoire d’accès aléatoire (ou RAM) disponible. L’extraction individuelle de fibre de CT-FIRE prend quelques minutes. CurveAlign CT-mode sans limite prend quelques secondes. CurveAlign CT-FIRE fibre ou fibre se termine mode sans limite prend des dizaines de secondes. CurveAlign CT-FIRE mode fibre sans limite prend des centaines de secondes. L’analyse CurveAlign avec limite prend des dizaines de secondes à plusieurs minutes, selon la complexité des limites.

Résultats

Ces méthodes ont été appliquées avec succès dans de nombreuses études. Quelques applications typiques incluent : 1) Conklin et autres22 ont employé CurveAlign pour calculer des signatures de collagène tumeur-associées, et ont constaté que les fibres de collagène ont été plus fréquemment alignées perpendiculairement au périmètre de conduit dans les lésions in situ (DCIS) de carcinome ductal ; 2) Drifka et autres10 ont employé le mode CT-FIRE dans CurveAlig...

Discussion

Ce protocole décrit l’utilisation de CT-FIRE et CurveAlign pour la quantification du collagène fibrillar et peut être appliqué à n’importe quelle image avec des fibres de collagène ou d’autres structures allongées en forme de ligne ou de fibre adaptées à l’analyse par CT-FIRE ou CurveAlign. Par exemple, l’élastine ou les fibres élastiques peuvent être traitées de la même manière sur cette plate-forme. Nous avons testé les deux outils sur des fibres synthétiques générées par calcul

Déclarations de divulgation

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Remerciements

Nous remercions de nombreux contributeurs et utilisateurs à CT-FIRE et CurveAlign au fil des ans, dont le Dr Rob Nowak, le Dr Carolyn Pehlke, le Dr Jeremy Bredfeldt, Guneet Mehta, Andrew Leicht, le Dr Adib Keikhosravi, le Dr Matt Conklin, le Dr Jayne Squirrell, le Dr Paolo Provenzano, la Dre Brenda Ogle, la Dre Patricia Keely, le Dr Joseph Szulczewski, la Dre Suzanne Ponik et d’autres contributions techniques de Swati Anand et Curtis Rueden. Ces travaux ont été soutenus par le financement de Semiconductor Research Corporation, Morgridge Institute for Research et NIH subventions R01CA199996, R01CA181385 et U54CA210190 à K.W.E.

matériels

NameCompanyCatalog NumberComments
CT-FIREUniverity of Wisconsin-MadisonN/Aopen source software available from https://eliceirilab.org/software/ctfire/
CurveAlignUniversity of Wisconsin-MadisonN/Aopen source software available from https://eliceirilab.org/software/curvealign/

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