JoVE Logo
АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

Здесь мы представляем протокол об использовании программного средства MATLAB на основе кривильной платформы с открытым исходным кодом для количественной оценки организации фибриллярского коллагена во внеклеточной матрице как нормальных, так и больных тканей. Этот инструмент может быть применен к изображениям с коллагеновыми волокнами или другими типами линейных структур.

Аннотация

Фибриллярные коллагены являются видными внеклеточными компонентами матрицы (ЭКМ), и их топологические изменения, как было показано, связаны с прогрессированием широкого спектра заболеваний, включая рак молочной железы, яичников, почек и поджелудочной железы. Свободно доступные программные средства количественной оценки волокон в основном ориентированы на расчет выравнивания волокон или ориентации, и они подвержены ограничениям, таким как требование ручных шагов, неточность в обнаружении края волокна в шумном фоне или отсутствие локализованной характеристики функции. Инструмент количественной оценки коллагенового волокна, описанный в этом протоколе, характеризуется использованием оптимального многомасштабного представления изображения, включенного преобразованием кривой (КТ). Этот алгоритмический подход позволяет удалить шум от изображений фибриллярского коллагена и улучшение краев волокна, чтобы обеспечить расположение и ориентацию информации непосредственно из волокна, а не с помощью косвенных пикселей мудрый или окна мудрый информацию, полученную из других инструментов. Эта КТ-основная структура содержит два отдельных, но связанных пакета под названием "CT-FIRE" и "CurveAlign", которые могут количественно структурировать волокна на глобальной, области интересов (ROI), или индивидуальной основе волокна. Эта квантификация была разработана в течение более десяти лет и в настоящее время превратилась в всеобъемлющую и управляемой пользователем платформу количественной оценки коллагена. Используя эту платформу, можно измерить до тридцати волоконных объектов, включая индивидуальные свойства волокна, такие как длина, угол, ширина и прямота, а также объемные измерения, такие как плотность и выравнивание. Кроме того, пользователь может измерить угол волокна по отношению к вручную или автоматически сегментированных границ. Эта платформа также предоставляет несколько дополнительных модулей, включая модули для анализа рентабельности инвестиций, автоматического создания границ и постобработки. Использование этой платформы не требует предварительного опыта программирования или обработки изображений, и она может обрабатывать большие наборы данных, включая сотни или тысячи изображений, что позволяет эффективно количественной оценки организации коллагенового волокна для биологических или биомедицинских приложений.

Введение

Фибриллярные коллагены являются заметными, структурные компоненты ECM. Их изменения организации влияют на функцию тканей и, вероятно, связаны с прогрессированием многих заболеваний, начиная от остеогенеза imperfecta1,сердечной дисфункции 2,и заживление ран 3 различных видоврака,включая грудь 4,5,6,яичников 7,8, почки9, и ракподжелудочной железы 10. Многие установленные условия визуализации могут быть использованы для визуализации фибриллярскогоколлагена, таких как микроскопия второго гармонического поколения 11, пятна или красители в сочетании с яркой полевой или флуоресцентноймикроскопией или поляризованной световой микроскопией 12, жидкокристаллическая поляризационная микроскопия (LC-PolScope)13, иэлектронная микроскопия 14. По мере того как важность организации фибриллярского коллагена стала яснее, и использование этих методов увеличивало, потребность для улучшенных подходов анализа волокна коллагена также росла.

Было приложить много усилий для разработки вычислительных методов автоматизированного измерения фибриллярского коллагена. Свободно доступные программные средства в основном сосредоточены на расчете выравнивания волокон или ориентации, приняв либо первый производный или структурный тенсордля пикселей 15,16, или Fourier трансформировать на основе анализа спектра для изображения плитки17. Все эти инструменты подвержены ограничениям, таким как требование ручных шагов, неточность в обнаружении края волокна в шумном фоне или отсутствие локализованной характеристики функции.

По сравнению с другими свободно доступными программными инструментами с открытым исходным кодом, методы, описанные в этом протоколе, используют КТ – оптимальный, многомасштабный, направленный метод представления изображений – для удаления шума с изображений фибриллярского коллагена и улучшения или отслеживания краев волокна. Информация о местоположении и ориентации может быть предоставлена непосредственно из волокна, а не с помощью косвенных пикселей мудрый или окно-мудрый информации, чтобы сделать вывод метрик оптоволоконные организации. Эта КТ-основерамки 18,19,20,21 может количественно волокна организации на глобальной, рентабельности инвестиций, или волокна основе, в основном через два отдельных, но связаны, пакеты под названием "CT-FIRE"18,21 и "CurveAlign"19,21. Что касается реализации программного обеспечения, то в CT-FIRE коэффициенты КТ в нескольких масштабах могут быть использованы для реконструкции изображения, которое улучшает края и уменьшает шум. Затем индивидуальный алгоритм извлечения волокон применяется к КТ-реконструированное изображение для отслеживания волокон для поиска их репрезентативных точек центра, расширения волоконных ветвей от центральных точек и соединения волоконных ветвей для формирования волоконной сети. В CurveAlign коэффициенты КТ в заданной пользователем шкале могут использоваться для отслеживания локальной ориентации волокон, где извлекаются и группированы ориентация и расположение кривых для оценки ориентации волокон в соответствующих местах. Полученная в результате этого система количественной оценки разрабатывалась более десяти лет и значительно изменилась во многих аспектах, таких как функциональность, пользовательский интерфейс и модульность. Например, этот инструмент может визуализировать местную ориентацию волокна и позволяет пользователю измерять до тридцати функций волокна, включая индивидуальные свойства волокна, такие как длина, угол, ширина и прямота, а также объемные измерения, такие как плотность и выравнивание. Кроме того, пользователь может измерить угол волокна по отношению к вручную или автоматически сегментированных границ, которые, например, играет важную роль в развитии биомаркера на основе изображенияв исследованиях рака молочной железы 22 и рака поджелудочнойжелезы 10. Эта платформа предоставляет несколько модулей функций, включая модули для анализа рентабельности инвестиций, автоматического создания границ и постобработки. Модуль рентабельности инвестиций может быть использован для аннотации различных форм рентабельности инвестиций и проведения соответствующего анализа рентабельности инвестиций. В качестве примера приложения модуль автоматического создания границ может быть использован для регистрации ярких полевых изображений гематоксилина и эозин (Н И Э) с изображениями второго гармонического поколения (SHG) и создания изображения маски границ опухоли с зарегистрированных изображений Н И Э. Модуль после обработки может способствовать обработке и интеграции выходных файлов данных из отдельных изображений для возможного статистического анализа.

Эта платформа количественной оценки не требует предварительного опыта программирования или обработки изображений и может обрабатывать большие наборы данных, включая сотни или тысячи изображений, что позволяет эффективно количественной оценки организации коллагена для биологических или биомедицинских приложений. Он широко используется в различных областях исследований многими исследователями во всем мире, включая нас самих. Есть четыре основные публикации на CT-FIRE и CurveAlign18,19,20,21, из которых первые три были приведены 272 раз (по данным 2020-05-04 в соответствии с Google Scholar). Обзор публикаций, в которых приводилась эта платформа (CT-FIRE или CurveAlign), показывает, что существует около 110 журнальных статей, которые непосредственно использовали ее для своего анализа, в которых приблизительно 35 публикаций сотрудничали с нашей группой, а остальные (No 75) были написаны другими группами. Например, эта платформа была использована для следующих исследований:рак молочной железы 22,23,24, ракподжелудочной железы 10,25, рак почек9,26,заживление ран 3,27,28,29,30, ракяичников 8,31,7, uterosacralсвязки 32, гипофосфатемный дентин33, базально-клеточнаякарцинома 34, гипоксическаясаркома 35,хрящевая ткань 36,сердечная дисфункция 37,нейроны 38, глиобластома39,лимфатические сокращения 40, волокнистые cacffolds41, рак желудка42, микротрубочка43, имочевого пузыря фиброз 44. Рисунок 1 демонстрирует применение визуализации рака CurveAlign, чтобы найти связанные с опухолью коллагеновые сигнатырака молочной железы 19 с изображения SHG. На рисунке 2 описывается типичный схематический рабочий процесс этой платформы. Хотя эти инструменты былирассмотрены технически 18,19,21, ирегулярный протокол 20 для выравнивания анализа с CurveAlign также доступна, визуальный протокол, который демонстрирует все основные функции могут быть полезны. Представленный здесь визуализированый протокол облегчит процесс обучения использованию этой платформы, а также более эффективно решает проблемы и вопросы, которые могут возникнуть у пользователей.

протокол

ПРИМЕЧАНИЕ: Этот протокол описывает использование CT-FIRE и CurveAlign для количественной оценки коллагена. Эти два инструмента имеют взаимодополняющие, но разные основные цели и в определенной степени взаимосвязаны. CT-FIRE может быть запущен с интерфейса CurveAlign для проведения большинства операций, за исключением продвинутого постобработки и анализа рентабельности инвестиций. Для полноценной работы CT-FIRE он должен быть запущен отдельно.

1. Требование к сбору изображений и изображений

ПРИМЕЧАНИЕ: Инструмент может обрабатывать любой файл изображения с линейными структурами, читаемыми MATLAB, независимо от модальности изображения, используемой для его сбора.

  1. Используйте 8-битный серый масштаб в качестве типа изображения, поскольку параметры выполнения по умолчанию основаны на этом формате.
    ПРИМЕЧАНИЕ: SHG-изображение является широко используемым методом визуализации фибрилляторного коллагена без этикеток и с высоким разрешением. SHG изображения из исследования рака молочнойжелезы 19 будут использоваться здесь с целью демонстрации.

2. Установка программного обеспечения и требования к системе

ПРИМЕЧАНИЕ: Обе автономные версии и исходный код находятся в свободном доступе. Версия с исходным кодом требует полной установки MATLAB, включая наборы инструментов обработки сигналов, обработки изображений, анализа статистики и параллельных вычислений. Для запуска версии исходных кодов все необходимые папки, включая некоторые из сторонних источников, должны быть добавлены в путь MATLAB. Для большинства пользователей рекомендуется использовать автономное приложение (APP), которое требует установки свободно доступного MATLAB Compiler Runtime (MCR) указанной версии. Процедура установки и запуска APP описана ниже.

  1. Скачать CT-FIRE версию 3.0 (CTF3.0) и CurveAlign Версия 5.0 (CA5.0) пакеты APP от https://eliceirilab.org/software/ctfire/ и https://eliceirilab.org/software/curvealign/, соответственно.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Каждый пакет включает в себя автономные изображения APP, руководства и тестирования.
  2. Следуйте подробным требованиям и инструкциям по установке с вышеуказанных веб-сайтов для установки MATLAB MCR 2018b.
  3. Запуск APP.
    1. Для Windows 64-битной системы, дважды нажмите на значок APP, чтобы запустить его.
    2. Для системы Mac, следуйте следующим шагам, чтобы запустить его: Право нажмите на APP (ctrl-нажмите) | Показать содержимое пакета | Содержание | MacOS | applauncher (справа нажмите и выберите открытый).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Другие подробности можно увидеть на веб-сайтах программного обеспечения, перечисленных в 2.1.

3. Индивидуальная экстракция волокна с CT-FIRE

ПРИМЕЧАНИЕ: CT-FIRE использует КТ для детонирования изображения, улучшения краев волокна, а затем использует алгоритм извлечения волокон для отслеживания отдельных волокон. Длина, угол, ширина и прямота рассчитываются для отдельных волокон.

  1. CT-FIRE на одном изображении или нескольких изображениях
    1. Запуск APP, как описано в 2.3.
    2. Нажмите на кнопку Open File (ы) в главном графическом пользовательском интерфейсе (GUI, рисунок 3A),а затем выберите одно или несколько изображений/или стеки изображений из оперативного окна. Используйте метод, подходящий для операционной системы, чтобы выбрать несколько изображений в диалоге (например, в Windows, удерживайте CTRL при выборе нескольких файлов).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Если выбрано два или более файлов изображений, все изображения должны использовать одинаковые параметры бега для анализа. Убедитесь, что все изображения приобретены в одинаковых или одинаковых условиях.
    3. Выберите параллельные вычислительные параметры, проверив параллельный флажок в правом верхнем углу для анализа нескольких изображений.
    4. Для стека изображений переместите ползунок среза под набор файлов, чтобы выбрать срез для анализа.
    5. Установите свойства работы. Используйте параметры по умолчанию для первоначального анализа некоторых изображений. При использовании параметров по умолчанию перейти к шагу 3.1.6. Чтобы установить другой параметр (ы), нажмите на кнопку Обновления в панели параметров. Следуйте руководству, чтобы правильно настроить параметры.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Наиболее часто регулируемые параметры включают фоновый порог(thresh_im2)и радиус поиска нуклеации(s_xlinkbox). Если уровень фонового шума высок, установите thresh_im2 к большему значению; s_xlinkbox связан со средним радиусом волокон, установить меньшее значение для обнаружения тонких волокон.
    6. Нажмите на кнопку Run.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Информация о ходе работы будет отображаться как в информационном окне, так и в окне команды. После завершения анализа будет отображаться таблица вывода (рисунок3B).
    7. Нажмите на любой элемент в таблице вывода, чтобы увидеть гистограммуволоконных мер (рисунок 3C и рисунок 3F) изображения, включая длину, ширину, угол и прямоту.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Волокна изображения с волокнами, наложенными на исходное изображение также будут отображаться(рисунок 3E).
    8. Проверьте подсобный файл под названием ctFIREout под папкой изображений для выводных файлов, включая наложенный файл изображения ".tiff", файл ".csv" и файл ".mat".
  2. Анализ области интереса CT-FIRE (ROI)
    1. Аннотация рентабельности инвестиций с использованием ROI Manager
      1. Нажмите на кнопку Open File (ы) в главном графическом интерфейсе(рисунок 3A),чтобы загрузить одно или несколько изображений.
      2. Выберите изображение, которое будет аннотировано в списке файлов.
      3. Выберите roi Manager в меню roi Options.
      4. Нажмите на кнопку RUN, чтобы запустить модуль ROI Manager (рисунок 3A).
      5. В gui менеджера рентабельности инвестиций(рисунок 4A), нажмите на меню высадки ниже Draw ROI Menu (d), чтобы нарисовать ROIs, один за другим.
        ПРИМЕЧАНИЕ: Форма ROI может быть прямоугольным, от руки, эллипсом, полигоном или указанным прямоугольником. Следуйте инструкциям на экране рисовать, экономить и выйти из аннотации ROI.
      6. Выбрав метод для определения рентабельности инвестиций, перетащите желтый прямоугольник, который отображается на исходном изображении, в нужное положение, а затем нажмите кнопку Save ROI (s) или нажмите клавишу s, чтобы добавить эту рентабельность инвестиций в список рентабельности инвестиций. Эта рентабельность инвестиций будет автоматически названа.
      7. Нарисуйте новую рентабельность инвестиций, перетащив предыдущую рентабельность инвестиций на новую позицию, и сохраните ее, как у упоминалось в 3.2.1.6, или повторите шаги 3.2.1.5-3.2.1.6, чтобы привлечь новую рентабельность инвестиций.
      8. Нажмите x или выберите New ROI? в меню высадки формы ROI, чтобы выйти из аннотации ROI.
      9. Проверьте флажки Показать все и этикетки, чтобы показать все определенные ROIs в списке и их имена на исходное изображение.
      10. Выберите рентабельность инвестиций в списке рентабельности инвестиций для проведения основных операций по окупаемости инвестиций, включая переименовывать рентабельностьинвестиций, удалитьрентабельность инвестиций, сохранить рентабельность инвестиций из текста, сохранить ROI Маска, загрузить рентабельностьинвестиций от маска , и объединить ROIs.
      11. Проверьте выходной файл менеджера ROI, сохраненный как файл ".mat" в субфолдере под названием ROI_management под исходной папкой изображения.
      12. Чтобы аннотировать другое изображение в списке открытых файлов, повторите шаги 3.2.1.2-3.2.1.11.
      13. После того, как аннотация будет выполнена, закройте графический интерфейс менеджера ROI и сбросите основной графический интерфейс, нажав на кнопку сброса в главном графическом интерфейсе.
    2. Анализ рентабельности инвестиций для одного изображения в roi Manager
      1. Если анализ CT-FIRE с полным изображением проводится и результаты сохраняются в каталоге по умолчанию, нажмите на один или несколько ИП в списке рентабельности инвестиций, а затем нажмите кнопку ctFIRE ROI Analyzer для запуска модуля анализа после окупаемости инвестиций.
        ПРИМЕЧАНИЕ: Результаты будут автоматически сохранены в субфолдере, расположенном в папке «изображение» CTF_ROI «Индивидуальный» ROI_post_analysis».
      2. Во всплывающем окне нажмите кнопку Check Fibers для отображения волокон в выбранных ROIs(рисунок 4B).
      3. Нажмите на статистику участка, чтобы отобразить гистограммы каждой рентабельности инвестиций(рисунок 4C). Будут отображаться соответствующие показатели вывода.
      4. Если полный анализ CT-FIRE не был проведен, нажмите на один или несколько ИП в списке рентабельности инвестиций и нажмите на кнопку Apply ctFIRE на кнопке ROI, чтобы непосредственно применить анализ CT-FIRE к выбранным ИП.
      5. Следуйте инструкциям в оперативном окне для запуска анализа.
        ПРИМЕЧАНИЕ: Параметры для запуска CT-FIRE передаются через основной графический интерфейс, и пользователь может обновлять параметры времени, описанные в шаге 3.1.5 по мере необходимости. После завершения анализа сводная статистика волоконных мер будет отображаться в таблице вывода. Результаты будут автоматически сохранены в субфолдере, расположенном в папке «изображение» CTF_ROI «Индивидуальный ROI_analysis».
    3. Анализ рентабельности инвестиций для нескольких изображений с помощью ROI Analyzer
      1. Следуйте шагам в 3.2.1, чтобы аннотировать ROIs для изображений, которые будут проанализированы.
      2. Откройте одно или несколько изображений, нажав на кнопку Open File (ы).
      3. Чтобы вывести анализ roi post, когда будут доступны результаты полного анализа изображений, нажмите на меню высадки в панели Run Options и выберите опцию CTF после ROI-анализатора.
      4. Нажмите на кнопку RUN, чтобы вывести анализ рентабельности инвестиций для всех загруженных изображений.
      5. Проверьте информацию о ходе работы, отображаемую в окне сообщения в нижней части графического интерфейса и в окне команды.
      6. После завершения анализа проверьте сводную статистику по каждой рентабельности инвестиций, отображаемую в таблице вывода.
        ПРИМЕЧАНИЕ: Подробные выходные файлы автоматически сохраняются в субфолдере, расположенном CTF_ROI «ROI_post_analysis».
      7. Чтобы провести прямой анализ, когда полные результаты анализа изображений недоступны, следуйте шагам 3.2.3.1-3.2.3.6, за исключением того, что в шаге 3.2.3.3, выберите опцию CTF ROI анализr; в шаге 3.2.3.4, прежде чем нажать на кнопку RUN, обновите параметры бега, описанные в шаге 3.1.5. После нажатия на кнопку RUN, в быстром окне диалога, выберите между прямоугольной roi и ROI маской любой формы.
        ПРИМЕЧАНИЕ: Если все аннотированные ИИ прямоугольные, пользователь может выбрать "Rectangular ROI". В шаге 3.2.3.6 результаты анализа рентабельности инвестиций сохраняются в субфолдере, расположенном в папке «CTF_ROI»Batch ROI_analysis».
  3. После обработки с CT-FIRE
    ПРИМЕЧАНИЕ: После регулярного анализа CT-FIRE, описанного в 3.1, пользователь может выполнять дальнейшие постобработки. Без запуска трудоемкой добычи волокна снова, регулярные после обработки, описанные в 3.3.1, может обновить некоторые основные свойства выходной фигуры, в то время как передовые пост-обработки описаны в 3.3.2 может визуализировать отдельные волокна и их свойства, выполнять сложные пороговые между всеми четырьмя свойствами волокна, генерировать сводную статистику выбранных волокон, и визуализировать выбранные волокна с помощью индивидуальной цветной карты.
    1. Регулярная после обработки с CT-FIRE
      1. Запустите приложение CT-FIRE или нажмите на кнопку сброса после других операций, чтобы инициализировать основной графический интерфейс CT-FIRE(рисунок 3A).
      2. Проверьте флажок .mat в верхней части основного графического интерфейса.
      3. Нажмите на кнопку Open File (ы), чтобы выбрать выходной файл CT-FIRE .mat в субфолдере ctFIREout.
        ПРИМЕЧАНИЕ: Если выбрано несколько файлов, флажок batch будет автоматически проверен. Название файла соответствующих изображений будет отображаться в списке коробок.
      4. Обновление опций в панели управления выходными рисунками.
      5. Держите параметры по умолчанию в выходных вариантах,которые будут убедиться, что все выходные файлы будут обновляться в соответствии с новым набором параметров, установленных в 3.3.1.4.
      6. Нажмите на кнопку «Постобработки». Проверьте информацию о ходе работы в окне сообщения в нижней части основного графического интерфейса, а также в окне команды.
      7. После завершения анализа нажмите на любой элемент в таблице вывода, чтобы увидеть гистограмму волоконных мер изображения, включая длину, ширину, угол и прямоту.
        ПРИМЕЧАНИЕ: Новые выходные файлы будут перезаписать старые в ctFIREout subfolder.
    2. Расширенная после обработки CT-FIRE
      1. Запустите приложение CT-FIRE или нажмите на кнопку сброса после других операций, чтобы инициализировать основной графический интерфейс CT-FIRE(рисунок 3A).
      2. Проверьте флажок OUT.adv в верхней части основного графического интерфейса(рисунок 3A).
      3. Нажмите на кнопку после обработки, чтобы запустить расширенный графический интерфейс после обработки подназванием " Analysis Module"(рисунок 5A).
      4. Нажмите на кнопку Select File, чтобы выбрать изображение.
      5. Нажмите на кнопку Visualise Fibers, чтобы ввести номер волокна на основе меток в фигуре Tab Original-fibers.
        ПРИМЕЧАНИЕ: Измерения выбранных волокон будут отображаться в таблице вывода(рисунок 5B), и соответствующие волокна будут наложены на исходное изображение, показанное на рисунке вкладки под названием Измеренные волокна (Рисунок 5C).
      6. Нажмите на кнопку Подтверждение/Обновление, чтобы перейти к пороговой операции.
      7. Проверьте пороговое поле, чтобы включить настройки порога.
      8. Выберите один из четырех вариантов пороговых значений из меню высадки.
      9. Введите нужные пороговые значения в панели пороговых значений для одного или нескольких свойств волокна.
      10. Нажмите на кнопку Порог теперь, чтобы применить вышеуказанные пороговые условия.
      11. Проверьте оперативную цифру с ее именем, заканчивающийся визуализацией метрик, чтобы увидеть выбранные волокна, наложенные на исходные изображения с настраиваемыми цветными картами, как показано на рисунке 5E.
      12. Повторите шаги 3.3.2.9-3.3.2.11, чтобы установить желаемые пороги.
      13. Нажмите на кнопку Сохранить волокна, чтобы сохранить выбранную информацию волокна.
        ПРИМЕЧАНИЕ: Соответствующие выбранные волокна будут отображаться на рисунке вкладки под названием After-Thresholding.
      14. Нажмите на кнопку «Создать статистику», а затем нажмите кнопку OK во всплывающем окне для создания сводной статистики.
        ПРИМЕЧАНИЕ: Выходная таблица(рисунок 5D) покажет среднее значение выбранных волокон. Другие статистические данные выбранных волокон будут сохранены в файле Excel, местоположение которого отображается в окне состояния в нижней части этого графического интерфейса.
      15. Чтобы включить выбранную индивидуальную информацию о волокнах в файл вывода, проверьте лист Generate на наличие необработанной коробки данных, прежде чем нажать на кнопку OK.
      16. Чтобы объединить результаты из нескольких изображений, в шаге 3.3.2.4, проверьте поле режима пакета или режим стека и выберите несколько изображений или стек (ы) для анализа; пропустить шаги 3.3.2.5-3.3.2.6. В шагах 3.3.2.8-3.3.2.9 устанавливаются пороговые условия, но по мере того, как кнопки порога сейчас и Сохранить волокна отключены, пропустите шаги 3.3.2.10-3.3.2.13; и, наконец, следуйте инструкциям в шаге 3.3.2.14 для создания сводной статистики и индивидуальных свойств волокна выбранных волокон.

4. Анализ волокна с curveAlign

ПРИМЕЧАНИЕ: CurveAlign был первоначально разработан для автоматического измерения углов волокон по отношению к пользовательским границам. Текущая версия CurveAlign может быть использована для массовой оценки объектов на основе плотности и выравнивания в дополнение к относительному измерению угла либо путем загрузки индивидуальной информации о волокнах, извлеченной CT-FIRE, либо непосредственно с использованием локальной ориентации кривых. CurveAlign вычисляет до тридцати функций, связанных с глобальными или локальными особенностями, в основном включая плотность и выравнивание, а также индивидуальные свойства волокна, когда CT-FIRE принимается в качестве метода отслеживания волокон.

  1. Анализ волокон с кривыми
    1. Запуск APP, как описано в 2.3.
    2. Нажмите на кнопку Сброс, чтобы сбросить APP до исходного состояния, если другие операции были проведены.
    3. В главном графическом интерфейсе(рисунок 6A),проверьте вариант метода анализа волокна, чтобы убедиться, что КТ выбран (вариант по умолчанию).
      ПРИМЕЧАНИЕ: В этом режиме КТ выполняется на изображении, и ориентация каждой кривой представляет направление волокна в соответствующем месте.
    4. Нажмите на меню высадки метода Boundary и выберите режим обработки границ из следующих вариантов меню высадки: No Boundary, CSV Boundary и TIFF Boundary.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Если граница не требуется, пропустите этот шаг. Обратитесь к 4.3 о том, как рассчитать углы волокна по отношению к границе.
    5. Нажмите на кнопку Get Image (ы) в главном графическом интерфейсе(рисунок 6A),а затем выберите одно или несколько изображений/ или стеки изображений из оперативного окна. Используйте технику, соответствующую вашей операционной системе, чтобы выбрать несколько изображений в диалоге (например, в Windows, удерживайте CTRL при выборе нескольких файлов).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Если выбрано два или более файлов изображений, все изображения должны использовать одинаковые параметры для анализа. Убедитесь, что все изображения приобретены в одинаковых или одинаковых условиях.
    6. Для стека изображений переместите ползунок среза под набор файлов, чтобы выбрать срез для анализа.
    7. Введите фракцию coefs держать. Это значение представляет собой долю от самых больших коэффициентов КТ, которые будут использоваться при анализе волокон.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Если изображение имеет большие различия в интенсивности волокна или контрастности, аннотировать области интереса с даже контраст для анализа волокна, как этот режим обнаруживает только яркие волокна в изображении. Кроме того, чем больше размер изображения, тем меньше значение для этой фракции.
    8. Храните все параметры в опционах вывода и другие параметры в расширенном варианте по умолчанию; выходные файлы могут потребоваться в других будущих операциях.
    9. Нажмите на кнопку Run в нижней части основного графического интерфейса(рисунок 6A).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Информация о ходе работы будет отображаться в окне сообщения, выделенном зеленым цветом внизу. После того, как процесс будет выполнен, некоторые сводные статистические данные по каждому изображениюбудут отображаться в таблице вывода (рисунок 6B),и все выходные файлы будут автоматически сохранены в подсшивателе с именем CA_Out в каталоге исходного изображения (ы).
    10. Нажмите на любой элемент в таблице вывода(рисунок 6B), чтобы увидеть гистограмму(рисунок 6E)или компас участок (Рисунок 6F) волоконных углов.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Изображение наложения(рисунок 6C) и тепловая карта(рисунок 6D) выравнивания или угла также будут отображаться.
    11. Нажмите на кнопку сброса для запуска других операций или закройте основной графический интерфейс, чтобы выйти из APP.
  2. Индивидуальный анализ волокон с помощью CT-FIRE
    ПРИМЕЧАНИЕ: Процедура такая же, как описано в разделе 4.1, за исключением того, что в шаге 4.1.3, выберите CT-FIRE связанных волоконно-аналитическогорежима , и пропустить шаг 4.1.7, как это не применимо и отключен в режиме CT-FIRE. В частности, в шаге 4.1.3 выберите один из следующих трех индивидуальных методов анализа волокон на основе CT-FIRE:
    1. Выберите CT-FIRE волокна для использования точки центра волокна и угла волокна для представления волокна.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Этот вариант не рассматривает изменения в ориентации волокна вдоль длины волокна.
    2. Выберите CT-FIRE конечные точки для использования двух конечных точек волокна и соответствующего угла волокна для представления волокна.
      ПРИМЕЧАНИЕ: По сравнению с 4.2.1, эта опция использует две позиции, чтобы представлять волокно, а не один (центральная точка волокна).
    3. Выберите сегменты CT-FIRE для использования сегментов волокна для представления волокна.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Каждый сегмент имеет равную длину (установленную до 5 пикселей по умолчанию в CT-FIRE), а также его ориентацию и расположение, что отражает изменение ориентации по всей длине волокна. Этот вариант будет наиболее трудоемким, но будет лучшим вариантом среди трех CT-FIRE основе методов анализа волокон для отслеживания изменений в местной ориентации пышные волокна.
  3. Относительный анализ выравнивания с границей
    ПРИМЕЧАНИЕ: По сравнению с регулярным анализом без пограничных условий, описанных в разделах 4.2 и 4.3, относительный анализ выравнивания с пограничными условиями требует следующих:
    1. В шаге 4.1.3 выберите условие границы tiff.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Пользователю понадобится соответствующий пограничный файл для каждого изображения или каждого стека. Следуйте инструкциям на экране, чтобы вручную аннотировать либо CSV (формат разделенных значений на основе, x-y координаты) пограничный файл или файл границы Tiff. Пограничные файлы, созданные в CurveAlign, будут автоматически сохранены в соответствии с каталогом файлов и конвенциями по именованию файлов, описанными в руководстве. Если предоставляется пара изображений яркого поля Н И Э и SHG, используйте автоматический модуль создания границ, описанный в разделе 4.4, для создания файла границы.
    2. В панели первичных параметров введите расстояние от ближайшей границы, чтобы оценить только волокна в пределах этого диапазона расстояния.
    3. В панели опционов выхода, проверьте поле ассоциации границ Bdry Assoc, чтобы визуализировать точку на границе, которая связана с волокном, сегмент волокна, или curvelet.
  4. Автоматическое создание границ
    1. Запуск APP, как описано в 2.3.
    2. Нажмите на кнопку сброса, чтобы сбросить APP до исходного состояния, если другие операции уже были проведены.
    3. Нажмите на кнопку создания BD для запуска модуля автоматического создания границ.
    4. Следуйте инструкциям/подсказкам на экране, чтобы создать пограничный файл для одного или нескольких изображений, основанных на паре изображений H и E яркого поля и SHG.
    5. Закройте окно модуля или нажмите кнопку Сброса в главном графическом интерфейсе(рисунок 6A),чтобы выйти из этого модуля.
  5. CurveAlign области анализа интересов
    1. Аннотация рентабельности инвестиций с использованием ROI Manager
      1. Нажмите на кнопку Get Image (ы) в главном графическом интерфейсе(рисунок 6A),чтобы загрузить одно или несколько изображений.
      2. Выберите изображение, которое будет аннотировано в списке файлов.
      3. Нажмите на roi Manager, чтобы запустить модуль ROI Manager (рисунок 7A).
      4. Следуйте шагам 3.2.1.5-3.2.1.13 в разделе 3.2.1.
    2. Анализ рентабельности инвестиций для одного изображения в roi Manager
      1. Если был проведен полный анализ CurveAlign, и результаты сохраняются в каталоге по умолчанию, нажмите на один или несколько ИП в списке рентабельности инвестиций, а затем нажмите кнопку анализатора CA ROI для запуска анализа post-ROI.
        ПРИМЕЧАНИЕ: После завершения анализа сводная статистика будет отображаться в итоговой таблице(рисунок 7C),а также на рисунке гистограммы(рисунок 7D),показывающем распределение угла.
      2. Нажмите на любой элемент в таблице вывода, чтобы визуализировать волокна в данной рентабельности инвестиций(рисунок 7B), а также гистограмма волоконных углов.
      3. Проверьте выходные файлы, сохраненные в субфолдере, расположенном CA_ROI «ROI_post_analysis».
      4. Если анализ полного изображения CA не был проведен, нажмите на один или несколько ИП в списке рентабельности инвестиций и нажмите на кнопку Apply CA на кнопке ROI, чтобы непосредственно применить анализ CA к выбранным ИП. Следуйте инструкциям в оперативном окне для запуска анализа.
        ПРИМЕЧАНИЕ: Параметры для времени анализа CA передаются через основной графический интерфейс; обновлять параметры работать, описанные в шаге 4.1.7 по мере необходимости. После завершения анализа результаты сводной статистики волоконных мер будут отображаться в таблице вывода. Результаты будут автоматически сохранены в субфолдере, расположенном в папке «изображение» CA_ROI «Индивидуальный» ROI_analysis.
    3. Анализ рентабельности инвестиций для нескольких изображений с помощью ROI Analyzer
      1. Следуйте шагам в 4.5.1, чтобы аннотировать ROIs для изображений, которые будут проанализированы.
      2. Откройте одно или несколько изображений, нажав на кнопку Get Image (ы).
      3. Чтобы вывести анализ рентабельности инвестиций при наличии полных результатов анализа изображений, нажмите кнопку анализа рентабельности инвестиций и выберите опцию ROI после обработки.
      4. Проверьте информацию о ходе работы, отображаемую в окне сообщения в нижней части графического интерфейса и в окне команды.
      5. После завершения анализа проверьте сводную статистику по каждой рентабельности инвестиций, отображаемую в таблице вывода.
        ПРИМЕЧАНИЕ: Подробные выходные файлы автоматически сохраняются в субфолдере, расположенном в папке «изображение» CA_ROI «ROI_post_analysis».
      6. Чтобы провести прямой анализ с КТ-режимом, когда полные результаты анализа изображений недоступны, следуйте шагам 4.5.3.1-4.5.3.5, за исключением следующих изменений: измените шаг 4.5.3.3, выбрав опцию CA на обрезанной прямоугольной рентабельности инвестиций или CA на маске с рентабельностью инвестиций любой формы. Если все аннотированные ИИ имеют прямоугольную форму, выберите вариант прямоугольной рентабельности инвестиций. После шага 4.5.3.2 обновим параметры бега, как описано в 4.1.7.
        ПРИМЕЧАНИЕ: Результаты анализа рентабельности инвестиций будут сохранены в субфолдере, расположенном CA_ROI «ROI_analysis».
  6. После обработки CurveAlign
    1. Запустите APP, как описано в разделе 2.3.
    2. Нажмите на кнопку сброса, чтобы сбросить APP до исходного состояния, если другие операции уже выполнены.
    3. Нажмите на кнопку После обработки, чтобы запустить модуль после обработки.
    4. Следуйте инструкциям/подсказкам на экране, чтобы объединить выходные функции или значения из разных изображений.
    5. Закройте окно модуля или нажмите кнопку Сброса в главном графическом интерфейсе(рисунок 6A),чтобы выйти из этого модуля.

5. Ориентировочное время работы

  1. Подождите расчетное время работы для обработки изображения размером 1024 пикселя x 1024 пикселей с умеренной плотностью волокна. Фактическое вычислительное время обычно зависит от нескольких факторов, включая размер файла, режим анализа, функции, которые будут развернуты, тип центрального процессора (CPU) и объем доступной памяти случайного доступа (или оперативной памяти). CT-FIRE индивидуальная экстракция волокна занимает несколько минут. CurveAlign CT-режим без границ занимает несколько секунд. CurveAlign CT-FIRE волокна или волокна заканчивается режим без границ занимает десятки секунд. Режим волокна CurveAlign CT-FIRE без границ занимает сотни секунд. Анализ CurveAlign с границей занимает от десятков секунд до нескольких минут, в зависимости от сложности границ.

Результаты

Эти методы были успешно применены в многочисленных исследованиях. Некоторые типичные применения включают в себя: 1) Conklin et al.22 использовали CurveAlign для расчета связанных с опухолью сигнаций коллагена, и обнаружили, что коллагеновые волокна чаще выравнивались перпендикулярно...

Обсуждение

Этот протокол описывает использование CT-FIRE и CurveAlign для фибрилляционной количественной оценки коллагена и может быть применен к любому изображению с коллагеновыми волокнами или другими линейными или оптоволоконными удлиненными структурами, пригодными для анализа CT-FIRE или CurveAlign. Напр?...

Раскрытие информации

Авторов нечего раскрывать.

Благодарности

Мы благодарим многих участников и пользователей CT-FIRE и CurveAlign на протяжении многих лет, в том числе д-р Роб Новак, д-р Каролин Pehlke, д-р Джереми Bredfeldt, Guneet Мехта, Эндрю Лейхт, д-р Адиб Keikhosravi, д-р Мэтт Конклин, д-р Джейн Белкель, д-р Паоло Провенцано, д-р Бренда Огле, д-р Патрисия Кили, д-р Джозеф Szulczewski, д-р Джозеф Szulczewski, д-р Сюзанна Эта работа была поддержана финансированием от Полупроводниковой исследовательской корпорации, Института исследований Моргриджа и грантов NIH R01CA199996, R01CA181385 и U54CA2190 K.W.E.

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
CT-FIREUniverity of Wisconsin-MadisonN/Aopen source software available from https://eliceirilab.org/software/ctfire/
CurveAlignUniversity of Wisconsin-MadisonN/Aopen source software available from https://eliceirilab.org/software/curvealign/

Ссылки

  1. Nadiarnykh, O., et al. Second harmonic generation imaging microscopy studies of osteogenesis imperfecta. Journal of Biomedical Optics. 12 (5), 051805 (2007).
  2. Kouris, N. A., et al. A nondenatured, noncrosslinked collagen matrix to deliver stem cells to the heart. Regenerative Medicine. 6 (5), 569-582 (2011).
  3. LeBert, D. C., et al. Matrix metalloproteinase 9 modulates collagen matrices and wound repair. Development. 142 (12), 2136-2146 (2015).
  4. Provenzano, P. P., et al. Collagen reorganization at the tumor-stromal interface facilitates local invasion. BMC Medicine. 4 (1), 38 (2006).
  5. Provenzano, P. P., et al. Collagen density promotes mammary tumor initiation and progression. BMC Medicine. 6 (1), 1 (2008).
  6. Conklin, M. W., et al. Aligned collagen is a prognostic signature for survival in human breast carcinoma. The American Journal of Pathology. 178 (3), 1221-1232 (2011).
  7. Alkmin, S., et al. Migration dynamics of ovarian epithelial cells on micro-fabricated image-based models of normal and malignant stroma. Acta Biomaterialia. 100, 92-104 (2019).
  8. Campbell, K. R., Campagnola, P. J. Assessing local stromal alterations in human ovarian cancer subtypes via second harmonic generation microscopy and analysis. Journal of Biomedical Optics. 22 (11), 116008 (2017).
  9. Best, S. L., et al. Collagen organization of renal cell carcinoma differs between low and high grade tumors. BMC Cancer. 19 (1), 490 (2019).
  10. Drifka, C. R., et al. Periductal stromal collagen topology of pancreatic ductal adenocarcinoma differs from that of normal and chronic pancreatitis. Modern Pathology. 28 (11), 1470-1480 (2015).
  11. Campagnola, P. J., et al. Three-dimensional high-resolution second-harmonic generation imaging of endogenous structural proteins in biological tissues. Biophysical Journal. 82 (1), 493-508 (2002).
  12. Arun Gopinathan, P., et al. Study of collagen birefringence in different grades of oral squamous cell carcinoma using picrosirius red and polarized light microscopy. Scientifica. 2015, 1-7 (2015).
  13. Keikhosravi, A., et al. Quantification of collagen organization in histopathology samples using liquid crystal based polarization microscopy. Biomedical Optics Express. 8 (9), 4243-4256 (2017).
  14. Quan, B. D., Sone, E. D. Cryo-TEM analysis of collagen fibrillar structure. Methods in Enzymology. 532, 189-205 (2013).
  15. Boudaoud, A., et al. FibrilTool, an ImageJ plug-in to quantify fibrillar structures in raw microscopy images. Nature Protocols. 9 (2), 457-463 (2014).
  16. Rezakhaniha, R., et al. Experimental investigation of collagen waviness and orientation in the arterial adventitia using confocal laser scanning microscopy. Biomechanics and Modeling in Mechanobiology. 11 (3-4), 461-473 (2012).
  17. Kartasalo, K., et al. CytoSpectre: a tool for spectral analysis of oriented structures on cellular and subcellular levels. BMC Bioinformatics. 16 (1), 1 (2015).
  18. Bredfeldt, J. S., et al. Computational segmentation of collagen fibers from second-harmonic generation images of breast cancer. Journal of Biomedical Optics. 19 (1), 016007 (2014).
  19. Bredfeldt, J. S., et al. Automated quantification of aligned collagen for human breast carcinoma prognosis. Journal of Pathology Informatics. 5 (1), 28 (2014).
  20. Liu, Y., Keikhosravi, A., Mehta, G. S., Drifka, C. R., Eliceiri, K. W. Methods for quantifying fibrillar collagen alignment. Methods in Molecular Biology. 1627, 429-451 (2017).
  21. Liu, Y., et al. Fibrillar collagen quantification with curvelet transform based computational methods. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 8, 198 (2020).
  22. Conklin, M. W., et al. Collagen alignment as a predictor of recurrence after ductal carcinoma in situ. Cancer Epidemiology and Prevention Biomarkers. 27 (2), 138-145 (2018).
  23. Jallow, F., et al. Dynamic interactions between the extracellular matrix and estrogen activity in progression of ER+ breast cancer. Oncogene. 38 (43), 6913-6925 (2019).
  24. Smirnova, T., et al. Serpin E2 promotes breast cancer metastasis by remodeling the tumor matrix and polarizing tumor associated macrophages. Oncotarget. 7 (50), 82289 (2016).
  25. Fanous, M., Keikhosravi, A., Kajdacsy-Balla, A., Eliceiri, K. W., Popescu, G. Quantitative phase imaging of stromal prognostic markers in pancreatic ductal adenocarcinoma. Biomedical Optics Express. 11 (3), 1354-1364 (2020).
  26. Jiménez-Torres, J. A., Virumbrales-Muñoz, M., Sung, K. E., Lee, M. H., Abel, E. J., Beebe, D. J. Patient-specific organotypic blood vessels as an in vitro model for anti-angiogenic drug response testing in renal cell carcinoma. EBioMedicine. 42, 408-419 (2019).
  27. Govindaraju, P., Todd, L., Shetye, S., Monslow, J., Puré, E. CD44-dependent inflammation, fibrogenesis, and collagenolysis regulates extracellular matrix remodeling and tensile strength during cutaneous wound healing. Matrix Biology. 75, 314-330 (2019).
  28. Henn, D., et al. Cryopreserved human skin allografts promote angiogenesis and dermal regeneration in a murine model. International Wound Journal. 17 (4), 925-936 (2020).
  29. Rico-Jimenez, J., et al. Non-invasive monitoring of pharmacodynamics during the skin wound healing process using multimodal optical microscopy. BMJ Open Diabetes Research and Care. 8 (1), 000974 (2020).
  30. Israel, J. S., et al. Quantification of collagen organization after nerve repair. Plastic and Reconstructive Surgery Global Open. 5 (12), (2017).
  31. Rentchler, E. C., Gant, K. L., Drapkin, R., Patankar, M., Campagnola, P. J. Imaging collagen alterations in STICs and high grade ovarian cancers in the fallopian tubes by second harmonic generation microscopy. Cancers. 11 (11), 1805 (2019).
  32. Hu, C., et al. Imaging collagen properties in the uterosacral ligaments of women with pelvic organ prolapse using spatial light interference microscopy (SLIM). Frontiers in Physics. 7, 72 (2019).
  33. Guirado, E., et al. Disrupted protein expression and altered proteolytic events in hypophosphatemic dentin can be rescued by dentin matrix protein 1. Frontiers in Physiology. 11, 82 (2020).
  34. Kiss, N., et al. Quantitative analysis on ex vivo nonlinear microscopy images of basal cell carcinoma samples in comparison to healthy skin. Pathology & Oncology Research. 25 (3), 1015-1021 (2019).
  35. Lewis, D. M., et al. Collagen fiber architecture regulates hypoxic sarcoma cell migration. ACS Biomaterials Science & Engineering. 4 (2), 400-409 (2018).
  36. Moura, C. C., Bourdakos, K. N., Tare, R. S., Oreffo, R. O., Mahajan, S. Live-imaging of Bioengineered Cartilage Tissue using Multimodal Non-linear Molecular Imaging. Scientific Reports. 9 (1), 1-9 (2019).
  37. Murtada, S. I., et al. Paradoxical aortic stiffening and subsequent cardiac dysfunction in Hutchinson-Gilford progeria syndrome. Journal of The Royal Society Interface. 17 (166), 0066 (2020).
  38. Nichol, R. H., Catlett, T. S., Onesto, M. M., Hollender, D., Gómez, T. M. Environmental elasticity regulates cell-type specific RHOA signaling and neuritogenesis of human neurons. Stem Cell Reports. 13 (6), 1006-1021 (2019).
  39. Pointer, K. B., et al. Association of collagen architecture with glioblastoma patient survival. Journal of Neurosurgery. 126 (6), 1812-1821 (2016).
  40. Razavi, M. S., Leonard-Duke, J., Hardie, B., Dixon, J. B., Gleason, R. L. Axial stretch regulates rat tail collecting lymphatic vessel contractions. Scientific Reports. 10 (1), 1-11 (2020).
  41. Xue, Y., et al. Valve leaflet-inspired elastomeric scaffolds with tunable and anisotropic mechanical properties. Polymers for Advanced Technologies. 31 (1), 94-106 (2020).
  42. Zhou, Z. H., et al. Reorganized collagen in the tumor microenvironment of gastric cancer and its association with prognosis. Journal of Cancer. 8 (8), 1466 (2017).
  43. Zinn, A., et al. The small GTPase RhoG regulates microtubule-mediated focal adhesion disassembly. Scientific Reports. 9 (1), 1-15 (2019).
  44. Zwaans, B. M., et al. Radiation cystitis modeling: A comparative study of bladder fibrosis radio-sensitivity in C57BL/6, C3H, and BALB/c mice. Physiological Reports. 8 (4), (2020).
  45. Devine, E. E., Liu, Y., Keikhosravi, A., Eliceiri, K. W., Jiang, J. J. Quantitative second harmonic generation imaging of leporine, canine, and porcine vocal fold collagen. The Laryngoscope. 129 (11), 2549-2556 (2019).
  46. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  47. Zeitoune, A. A., et al. Epithelial ovarian cancer diagnosis of second-harmonic generation images: A semiautomatic collagen fibers quantification protocol. Cancer Informatics. 16, (2017).
  48. Wershof, E., et al. Matrix feedback enables diverse higher-order patterning of the extracellular matrix. PLoS Computational Biology. 15 (10), 1007251 (2019).
  49. Mostaço-Guidolin, L. B., et al. Fractal dimension and directional analysis of elastic and collagen fiber arrangement in unsectioned arterial tissues affected by atherosclerosis and aging. Journal of Applied Physiology. 126 (3), 638-646 (2019).
  50. Thain, D., Tannenbaum, T., Livny, M. Distributed computing in practice: the Condor experience. Concurrency and Computation: Practice and Experience. 17 (2-4), 323-356 (2005).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

165

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены