곡선 변환 기반 도구를 사용하여 피브릴라 콜라겐 조직을 정량화

요약

여기서는 정상 및 병이 있는 조직의 세포외 매트릭스에서 세브릴라 콜라겐 조직을 정량화하기 위한 커브릿 변환 기반 오픈 소스 MATLAB 소프트웨어 도구를 사용하는 프로토콜을 제시합니다. 이 도구는 콜라겐 섬유 또는 다른 유형의 라인 과 같은 구조를 가진 이미지에 적용 할 수 있습니다.

초록

피브릴라 콜라겐은 눈에 띄는 세포 외 매트릭스 (ECM) 구성 요소이며, 그들의 토폴로지 변화는 유방, 난소, 신장 및 췌장암을 포함한 광범위한 질병의 진행과 관련이 있는 것으로 나타났습니다. 자유롭게 사용할 수 있는 섬유 정량화 소프트웨어 도구는 주로 섬유 정렬 또는 방향계산에 중점을 두고 있으며, 수동 단계의 요구 사항, 시끄러운 배경에서 섬유 에지 감지의 부정확성 또는 국소화 된 기능 특성화의 부족과 같은 제한 사항이 적용됩니다. 이 프로토콜에 설명된 콜라겐 섬유 수량 도구는 커브릿 변환(CT)에 의해 활성화된 최적의 다중 스케일 이미지 표현을 사용하는 것이 특징입니다. 이러한 알고리즘 접근 방식을 통해 피브릴라 콜라겐 이미지에서 노이즈를 제거하고 섬유 가장자리가 향상되어 다른 도구에서 얻은 간접 픽셀 또는 창 별 정보를 사용하는 대신 섬유에서 직접 위치 및 방향 정보를 제공할 수 있습니다. 이 CT 기반 프레임워크에는 글로벌, 관심 영역(ROI) 또는 개별 섬유 기준으로 섬유 조직을 정량화할 수 있는 "CT-FIRE" 및 "CurveAlign"이라는 두 개의 별도 패키지가 포함되어 있습니다. 이 정량화 프레임워크는 10년 이상 개발되었으며 이제 포괄적인 사용자 중심의 콜라겐 정량화 플랫폼으로 발전했습니다. 이 플랫폼을 사용하면 길이, 각도, 너비 및 직선과 같은 개별 섬유 특성과 밀도 및 정렬과 같은 벌크 측정을 포함하여 최대 30개의 섬유 기능을 측정할 수 있습니다. 또한 사용자는 수동으로 또는 자동으로 분할된 경계를 기준으로 광섬유 각도를 측정할 수 있습니다. 또한 이 플랫폼은 ROI 분석, 자동 경계 생성 및 후처리를 위한 모듈을 포함한 몇 가지 추가 모듈을 제공합니다. 이 플랫폼을 사용하면 프로그래밍 또는 이미지 처리에 대한 사전 경험이 필요하지 않으며 수백 또는 수천 개의 이미지를 포함한 대규모 데이터 집합을 처리할 수 있으므로 생물학적 또는 생체 의학 응용 을 위한 콜라겐 섬유 조직의 효율적인 정량화를 가능하게 합니다.

서문

피브릴라 콜라겐은 눈에 띄는 구조ECM 구성 요소입니다. 이들의 조직 변화는 조직 기능에 영향을 미치고 골발생^{불완전성 1,}심장 기능 장애^2,상처 치유^3에서 유방^4,5,6,난소^7,8,신장^9,췌장암^10을포함한 다양한 유형의 암에 이르는 많은 질병의 진행과 연관될 가능성이 있다. 많은 확립된 이미징 양식은 제2 고조파 생성 현미경^{검사법(11),}밝은 필드 또는 형광 현미경 또는 편광 광 현미경 검사법과 함께 피브릴라 콜라겐을 시각화하는 데 사용할 수 있으며, 액정 계 편광 현미경 검사법(LC-PolScope) 13, 전자 현미경^검사법14. 피브릴라 콜라겐 조직의 중요성이 명확해지고 이러한 방법의 사용이 증가함에 따라 콜라겐 섬유 분석 접근 방식의 개선필요성도 커지고 있습니다.

피브릴라 콜라겐의 자동화된 측정을 위한 계산 방법을 개발하기 위한 많은 노력이 있었습니다. 자유롭게 사용할 수 있는 소프트웨어 도구는 주로 이미지^{타일(17)에}대한 제1유도체 또는 구조 텐서 또는 포리에 변환 기반 스펙트럼 분석을 채택하여 섬유 정렬 또는 방향의 계산에 초점을 맞추고 있다. 이러한 모든 도구는 수동 단계의 요구 사항, 시끄러운 배경에서 섬유 모서리 감지의 부정확성 또는 지역화 된 기능 특성화의 부족과 같은 제한사항이 적용됩니다.

자유롭게 사용할 수 있는 다른 오픈 소스 무료 소프트웨어 도구와 비교하여 이 프로토콜에 설명된 메서드는 최적의 다중 규모의 방향성 이미지 표현 방법인 CT를 사용하여 피브릴라 콜라겐 이미지에서 노이즈를 제거하고 섬유 가장자리를 향상시키거나 추적합니다. 위치 및 방향에 대한 정보는 간접 픽셀 또는 창 별 정보를 사용하여 섬유 조직의 메트릭을 추론하는 것이 아니라 섬유에서 직접 제공될 수 있습니다. 이 CT 기반^{프레임워크(18,19,20,21)는} 주로 두 개의 분리된 것을 통해 글로벌, ROI 또는 섬유 기초에 섬유 조직을 정량화할 수 있지만, "CT-FIRE"^{18,21 및}"CurveAlign"^{19,21이라는}이름의 패키지가 있습니다. 소프트웨어 구현과 관련하여 CT-FIRE에서 여러 스케일의 CT 계수를 사용하여 가장자리를 향상시키고 노이즈를 줄이는 이미지를 재구성할 수 있습니다. 그런 다음, 개별 섬유 추출 알고리즘이 CT 재구성 된 이미지에 적용되어 대표 중심 점을 찾고, 중앙 점에서 섬유 분기를 확장하고, 섬유 가지를 연결하여 섬유 네트워크를 형성하기 위한 섬유를 추적합니다. CurveAlign에서 사용자 지정 규모의 CT 계수를 사용하여 곡선의 방향과 위치를 추출하고 그룹화하여 해당 위치에서 섬유 방향을 추정하는 로컬 섬유 방향을 추적할 수 있습니다. 이러한 결과 정량화 프레임워크는 10년 이상 개발되었으며 기능, 사용자 인터페이스 및 모듈성 과 같은 여러 측면에서 크게 발전해 왔습니다. 예를 들어, 이 도구는 로컬 섬유 방향을 시각화할 수 있으며 길이, 각도, 너비 및 직선성과 같은 개별 섬유 특성과 밀도 및 정렬과 같은 벌크 측정을 포함하여 최대 30개의 섬유 기능을 측정할 수 있습니다. 또한, 사용자는 수동으로 또는 자동으로 분할된 경계에 비해 섬유각을 측정할 수 있으며, 이는 예를 들어^{유방암(22)과} 췌장암^{연구(10)에서}이미지 기반 바이오마커 개발에 중요한 역할을 한다. 이 플랫폼은 ROI 분석, 자동 경계 생성 및 후처리를 위한 기능을 포함한 여러 기능 모듈을 제공합니다. ROI 모듈은 다양한 형태의 ROI에 알리고 해당 ROI 분석을 수행하는 데 사용할 수 있습니다. 응용 사례로서, 자동 경계 생성 모듈은 제2 고조파 생성(SHG) 이미지를 가진 헤마톡시린 및 에오신(H&E) 밝은 필드 영상을 등록하고 등록된 H&E 심상으로부터 종양 경계의 이미지 마스크를 생성하는 데 사용될 수 있다. 후처리 모듈은 가능한 통계 분석을 위해 개별 이미지에서 출력 데이터 파일을 처리하고 통합하는 데 도움이 될 수 있습니다.

이 정량화 플랫폼은 프로그래밍 또는 이미지 처리에 대한 사전 경험이 필요하지 않으며 수백 또는 수천 개의 이미지를 포함한 대규모 데이터 집합을 처리할 수 있으므로 생물학적 또는 생체 의학 응용 프로그램을 위한 콜라겐 조직의 효율적인 정량화를 가능하게 합니다. 그것은 널리 전 세계 많은 연구자에 의해 다른 연구 분야에서 사용 되었습니다., 자신을 포함 하 여. CT-FIRE 및 CurveAlign^{18,19,20,21에}4 개의 주요 간행물이 있으며, 그 중 처음 세 개는 272 번 인용되었습니다 (Google 학자에 따르면 2020-05-04 현재). 이 플랫폼 (CT-FIRE 또는 CurveAlign)을 인용 한 출판물의 검토는 약 35 개의 출판물이 우리 그룹과 협력하고 다른 그룹 (~ 75)이 다른 그룹에 의해 작성된 분석을 위해 직접 사용하는 약 110 개의 저널 논문이 있음을 나타냅니다. 예를 들어, 이 플랫폼은 유방암^22,23,24,췌장암^10,25,신장암^9,26,상처치유^{3,27,28,29,30,}난소암^8,31,7,자궁 대장대인^32,저혈당 상종^33,기저세포암(34) 저산소육종(35) , 연골조직^36,심장기능장애^37개,뉴런^38,교모세포종^39,림프수축^40,섬유성 카펠드^41,위암^42,미세투벌레^43,및 광섬유증^44. 도 1은 SHG 이미지로부터 유방암^19의 종양 관련 콜라겐 시그니처를 찾기 위해 CurveAlign의 암 이미징 응용을 입증한다. 그림 2는 이 플랫폼의 일반적인 회로도 워크플로우를 설명합니다. 이러한 도구는 기술적으로^18,19,21을 검토하고 CurveAlign과의 정렬 분석을 위한 정규^{프로토콜(20)도} 사용할 수 있지만 모든 필수 기능을 보여주는 시각적 프로토콜도 유용할 수 있습니다. 여기에 제시된 바와 같이 시각화된 프로토콜은 이 플랫폼을 사용하는 학습 프로세스를 용이하게 할 뿐만 아니라 사용자가 가질 수 있는 우려 사항과 질문을 보다 효율적으로 해결할 수 있습니다.

프로토콜

참고: 이 프로토콜은 콜라겐 정량화를 위해 CT-FIRE 및 CurveAlign의 사용을 설명합니다. 이 두 도구는 상호 보완적이지만 다른 주요 목표를 가지고 있으며 어느 정도 함께 연결됩니다. CT-FIRE는 CurveAlign 인터페이스에서 시작하여 고급 후처리 및 ROI 분석을 제외한 대부분의 작업을 수행할 수 있습니다. CT-FIRE의 전체 작동을 위해 별도로 시작해야합니다.

1. 이미지 수집 및 이미지 요구 사항

참고: 이 도구는 이를 수집하는 데 사용되는 이미징 양식에 관계없이 MATLAB에서 읽을 수 있는 라인 모양 구조로 모든 이미지 파일을 처리할 수 있습니다.

1. 기본 실행 매개 변수는 이 형식을 기반으로 하는 것처럼 이미지 유형으로 8비트 그레이스케일을 사용합니다.
   참고: SHG 이미징은 널리 사용되는 라벨프리 및 고해상도 피브릴라 콜라겐 이미징 방법입니다. 유방암 연구^19의 SHG 이미지는 데모를 목적으로 여기에서 사용될 것입니다.

2. 소프트웨어 설치 및 시스템 요구 사항

참고: 독립 실행형 버전과 소스 코드 버전을 모두 자유롭게 사용할 수 있습니다. 소스 코드 버전에는 신호 처리, 이미지 처리, 통계 분석 및 병렬 컴퓨팅의 도구 상자를 포함한 전체 MATLAB 설치가 필요합니다. 소스 코드 버전을 실행하려면 타사 원본의 일부를 포함하여 필요한 모든 폴더를 MATLAB 경로에 추가해야 합니다. 독립 실행형 응용 프로그램 (APP)의 사용은 지정된 버전의 자유롭게 사용할 수있는 MATLAB 컴파일러 런타임 (MCR)의 설치가 필요한 대부분의 사용자에게 권장됩니다. APP를 설치하고 실행하는 절차는 아래에 설명되어 있습니다.

1. CT-FIRE 버전 3.0(CTF3.0) 및 커브정렬 버전 5.0(CA5.0) APP 패키지를 각각 https://eliceirilab.org/software/ctfire/ 및 https://eliceirilab.org/software/curvealign/ 다운로드합니다.
   참고: 각 패키지에는 독립실행형 APP, 수동 및 테스트 이미지가 포함됩니다.
2. 위의 웹 사이트의 자세한 요구 사항 및 설치 지침을 따라 MATLAB MCR 2018b를 설치하십시오.
3. APP를 시작합니다.
   1. Windows 64비트 시스템의 경우 APP 아이콘을 두 번 클릭하여 실행합니다.
   2. Mac 시스템의 경우 다음 단계를 따라 실행합니다: APP(ctrl-click)를 마우스 오른쪽 버튼으로 클릭하십시오| 패키지 콘텐츠 | 표시 콘텐츠 | 맥OS | 앱런처 (마우스 오른쪽 버튼 클릭 및 열기 선택).
      참고: 기타 세부 정보는 2.1에 나열된 소프트웨어 웹 사이트에서 확인할 수 있습니다.

3. CT-FIRE를 가진 개별 섬유 추출

참고: CT-FIRE는 CT를 사용하여 이미지를 디노이즈하고 섬유 가장자리를 향상한 다음 섬유 추출 알고리즘을 사용하여 개별 섬유를 추적합니다. 길이, 각도, 너비 및 직선성은 개별 섬유에 대해 계산됩니다.

1. 단일 이미지 또는 여러 이미지에서 CT-FIRE
   1. 2.3에 설명된 대로 APP를 실행합니다.
   2. 기본 그래픽 사용자 인터페이스(GUI, 그림 3A)에서 열린 파일 단추를 클릭한 다음 프롬프트 창에서 하나 이상의 이미지/또는 이미지 스택을 선택합니다. 운영 체제가 대화 상자에서 여러 이미지를 선택하는 데 적합한 기술을 사용합니다(예: Windows에서 여러 파일을 선택하는 동안 CTRL을 보류).
      참고: 두 개 이상의 이미지 파일을 선택한 경우 모든 이미지는 분석에 대해 동일한 실행 중인 매개 변수를 사용해야 합니다. 모든 이미지가 동일하거나 유사한 조건에서 획득되는지 확인합니다.
   3. 여러 이미지 분석을 위해 오른쪽 상단 모서리에 있는 병렬 확인란을 확인하여 병렬 컴퓨팅 옵션을 선택합니다.
   4. 이미지 스택의 경우 파일 목록 상자 아래에 슬라이스 슬라이더를 이동하여 분석할 슬라이스를 선택합니다.
   5. 실행 중인 속성을 설정합니다. 일부 이미지의 초기 분석에 기본 매개 변수를 사용합니다. 기본 매개 변수를 사용하는 경우 3.1.6 단계로 건너뜁니다. 다른 매개 변수를 설정하려면 매개 변수 패널의 업데이트 단추를 클릭합니다. 설명서를 따라 매개 변수를 올바르게 조정합니다.
      참고: 가장 자주 조정된 매개변수는 배경임계값(thresh_im2)과핵 검색 반지름(s_xlinkbox)을 포함한다. 배경 노이즈 수준이 높은 경우 thresh_im2 더 큰 값으로 설정합니다. s_xlinkbox 섬유의 평균 반경과 연관되어 얇은 섬유를 검출하기 위해 더 작은 값을 설정합니다.
   6. 실행 버튼을 클릭합니다.
      참고: 진행률 정보는 정보 창과 명령 창 모두에 표시됩니다. 분석이 완료되면 출력 테이블이표시됩니다(그림 3B).
   7. 출력 테이블의 모든 항목을 클릭하여 길이, 너비, 각도 및 직선성을 포함하는 이미지의 섬유측정(도 3C 및 도 3F)의히스토그램을 확인합니다.
      참고: 원본 이미지에 겹쳐진 섬유 이미지도표시됩니다(그림 3E).
   8. 오버레이 이미지 ".tiff" 파일, ".csv" 파일 및 ".mat" 파일을 포함하여 출력 파일에 대해 이미지 폴더 아래에 ctFIREout이라는 하위 폴더를 확인합니다.
2. CT-FIRE 관심 지역(ROI) 분석
   1. ROI 관리자를 사용한 ROI 어노피
      1. 주 GUI(그림 3A)의 열기 파일버튼을 클릭하여 하나 이상의 이미지를 로드합니다.
      2. 파일 목록에 추가할 이미지를 선택합니다.
      3. ROI 옵션 패널의 드롭다운 메뉴에서 ROI 관리자를 선택합니다.
      4. RUN 버튼을 클릭하여 ROI 관리자 모듈(그림3A)을시작합니다.
      5. ROI 관리자GUI(그림 4A)에서 ROI 메뉴(d)를 그리는아래 드롭다운 메뉴를 클릭하여 ROI를 하나씩 그립니다.
         참고: ROI 셰이프는 직사각형, 프리핸드, 타원, 다각형 또는 지정된 사각형일 수 있습니다. 화면의 지침에 따라 ROI 어노기를 그리고, 저장하고, 종료합니다.
      6. ROI를 그리는 방법을 선택한 후 원본 이미지에 나타나는 노란색 사각형을 원하는 위치로 드래그한 다음 저장 ROI(s) 버튼을 클릭하거나 키 s를 눌러 ROI 목록에 이 ROI를 추가합니다. 이 ROI의 이름이 자동으로 지정됩니다.
      7. 이전 ROI를 새 위치로 드래그하여 새 ROI를 그리거나 3.2.1.6으로 저장하거나 3.2.1.5-3.2.1.6단계를 반복하여 새로운 ROI를 그립니다.
      8. ROI 셰이프 드롭다운 메뉴에서 x를 누르거나 새 ROI를 선택하여 ROI 어노기를 종료합니다.
      9. 확인란을 선택하여 모든 레이블과 레이블을 표시하여 목록에 정의된 모든 ROI와 원본 이미지에 해당 이름을 표시합니다.
      10. ROI 목록에서 ROI를 선택하여 ROI 이름 바꾸기, ROI 삭제, ROI 텍스트 저장, ROI 텍스트 저장, ROI마스크 저장, 마스크로드 ROI, ROI결합 등 기본 ROI 작업을 수행합니다.
      11. 원본 이미지 폴더 아래에 ROI_management 명명된 하위 폴더에서 ".mat" 파일로 저장된 ROI 관리자의 출력 파일을 확인합니다.
      12. 열린 파일 목록에서 다른 이미지에 알리려면 3.2.1.2-3.2.11 단계를 반복합니다.
      13. 음표가 끝나면 ROI 관리자 GUI를 닫고 주 GUI의 리셋 버튼을 클릭하여 기본 GUI를 재설정합니다.
   2. ROI 관리자의 단일 이미지에 대한 ROI 분석
      1. 전체 이미지 CT-FIRE 분석이 수행되고 결과가 기본 디렉터리에 저장되면 ROI 목록에서 하나 이상의 ROI를 클릭한 다음 ctFIRE ROI 분석기 버튼을 클릭하여 ROI 후 분석 모듈을 시작합니다.
         참고: 결과는 \\[이미지 폴더]\CTF_ROI\개별\ROI_post_analysis\에 있는 하위 폴더에 자동으로 저장됩니다.
      2. 팝업 창에서 선택된 ROI(그림4B)내에 섬유를 표시하려면 섬유 검사 버튼을 클릭합니다.
      3. 각 ROI(그림 4C)의히스토그램을 표시하려면 플롯 통계를 클릭합니다. 해당 출력 수치가 표시됩니다.
      4. 전체 이미지 CT-FIRE 분석이 수행되지 않은 경우 ROI 목록에서 하나 이상의 ROI를 클릭하고 ROI 의 CtFIRE 적용 버튼을 클릭하여 선택한 ROI에 CT-FIRE 분석을 직접 적용합니다.
      5. 프롬프트 창의 지침을 따라 분석을 실행합니다.
         참고: CT-FIRE를 실행하기 위한 매개 변수는 주 GUI를 통과하며 사용자는 필요에 따라 3.1.5 단계에서 설명된 대로 실행 중인 매개 변수를 업데이트할 수 있습니다. 분석이 완료되면 섬유 측정값의 요약 통계가 출력 테이블에 표시됩니다. 결과는 \\[이미지 폴더]\ CTF_ROI\개별\ROI_analysis\에있는 하위 폴더에 자동으로 저장됩니다.
   3. ROI 분석기를 사용하여 여러 이미지에 대한 ROI 분석
      1. 3.2.1의 단계를 수행하여 이미지를 분석할 ROI에 추가합니다.
      2. 열기 파일 단추를 클릭하여 하나 이상의 이미지를 엽니다.
      3. 전체 이미지 분석 결과를 사용할 수 있는 경우 ROI 게시물 분석을 실행하려면 Run Options 패널의 드롭다운 메뉴를 클릭하고 CTF 이후 ROI 분석기옵션을 선택합니다.
      4. RUN 버튼을 클릭하여 로드된 모든 이미지에 대해 ROI 분석을 실행합니다.
      5. GUI 의 하단과 명령 창에 메시지 창에 표시되는 진행률 정보를 확인합니다.
      6. 분석이 완료되면 출력 테이블에 표시된 각 ROI에 대한 요약 통계를 확인합니다.
         참고: 자세한 출력 파일은 \\ [이미지 폴더]\\CTF_ROI\batch\ROI_post_analysis\에있는 하위 폴더에 자동으로 저장됩니다.
      7. 전체 이미지 분석 결과를 사용할 수 없는 경우 직접 분석을 실행하려면 단계 3.2.3.1-3.2.3.6단계를 따르려면 3.2.3.3 단계에서 CTF ROI 분석옵션을 선택합니다. 3.2.3.4 단계에서 RUN 버튼을 클릭하기 전에 3.1.5 단계에 설명된 대로 실행 중인 매개 변수를 업데이트합니다. RUN 버튼을 클릭한 후 프롬프트 대화 창에서 모든 셰이프의 직사각형 ROI 마스크와 ROI 마스크 중에서 선택합니다.
         참고: 모든 부음 된 ROI가 직사각형인 경우 사용자는 "직사각형 ROI"를 선택할 수 있습니다. 3.2.3.6 단계에서 ROI 분석 결과는 \\[이미지 폴더]\\CTF_ROI\Batch\ROI_analysis\에있는 하위 폴더에 저장됩니다.
3. CT-FIRE를 탑재한 후처리
   참고: 3.1에 설명된 정기적인 CT-FIRE 분석 후 사용자는 추가 사후 처리를 수행할 수 있습니다. 3.3.1에 기재된 정기적인 후처리는 몇 가지 기본 출력 피규어 특성을 업데이트할 수 있는 반면, 3.3.2에 기재된 고급 후처리는 개별 섬유와 그 특성을 시각화하고, 4가지 섬유 특성 중 복잡한 임계값을 수행하고, 선택한 섬유의 요약 통계를 생성하고, 선택된 색상 맵을 사용하여 선택한 섬유를 시각화할 수 있다.
   1. CT-FIRE를 갖춘 정기적인 후처리
      1. CT-FIRE 앱을 실행하거나 다른 작업 후 리셋 버튼을 클릭하여 CT-FIRE 메인GUI(그림 3A)를초기화합니다.
      2. 기본 GUI 상단의 .mat 확인란을 선택합니다.
      3. 오픈 파일 버튼을 클릭하여 ctFIREout 하위 폴더에서 CT-FIRE 출력 .mat 파일을 선택합니다.
         참고: 여러 파일을 선택하면 배치 확인란이 자동으로 선택됩니다. 해당 이미지의 파일 이름이 상자 목록에 표시됩니다.
      4. 출력 그림 제어판의 옵션을 업데이트합니다.
      5. 출력 옵션에기본 옵션을 유지하여 모든 출력 파일이 3.3.1.4로 설정된 새 매개 변수 집합에 따라 업데이트되는지 확인합니다.
      6. 처리 후 버튼을 클릭합니다. 명령 창에서 메인 GUI 하단의 메시지 창에서 진행률 정보를 확인합니다.
      7. 분석이 완료되면 출력 테이블의 모든 항목을 클릭하여 길이, 너비, 각도 및 직선성을 포함한 이미지의 섬유 측정을 확인합니다.
         참고: 새 출력 파일은 ctFIREout 하위 폴더의 이전 파일을 덮어씁니다.
   2. CT-FIRE의 고급 사후 처리
      1. CT-FIRE 앱을 실행하거나 다른 작업 후 리셋 버튼을 클릭하여 CT-FIRE 메인GUI(그림 3A)를초기화합니다.
      2. 메인GUI(그림 3A)의상단에 있는 OUT.adv 확인란을 확인합니다.
      3. "분석 모듈"(그림5A)이라는고급 후처리GUI를 실행하려면 사후 처리 버튼을 클릭합니다.
      4. 파일 선택 버튼을 클릭하여 이미지를 선택합니다.
      5. 시각화 섬유 버튼을 클릭하여 탭 그림 원본 섬유의 레이블을 기반으로 섬유 번호를 입력합니다.
         참고: 선택한 섬유의 측정값은 출력 테이블(그림5B)에표시되며 해당 섬유는 측정 섬유(그림 5C)라는탭 그림에 표시된 원본 이미지에 오버레이됩니다.
      6. 임계값 작업으로 이동하려면 확인/업데이트 버튼을 클릭합니다.
      7. 임계값 설정을 사용하도록 설정하려면 임계값 상자를 선택합니다.
      8. 드롭다운 메뉴에서 네 가지 임계값 옵션 중 하나를 선택합니다.
      9. 하나 이상의 섬유 속성에 대한 임계값 패널에 원하는 임계값을 입력합니다.
      10. 위의 임계값 조건을 적용하려면 임계값 지금 버튼을 클릭합니다.
      11. 그림 5E에표시된 대로 사용자 지정된 색상 맵을 사용하여 원래 이미지에 오버레이된 선택한 섬유를 볼 수 있는 메트릭 시각화로 끝나는 이름의 프롬프트 그림을 확인합니다.
      12. 3.3.2.9-3.3.2.11 단계를 반복하여 바람직한 임계값을 설정합니다.
      13. 선택한 섬유 정보를 저장하려면 섬유 저장 버튼을 클릭합니다.
          참고: 선택한 해당 섬유는 임계값 후라는탭 그림에 표시됩니다.
      14. 통계 생성 버튼을 클릭한 다음 팝업 창의 확인 버튼을 클릭하여 요약 통계를 생성합니다.
          참고: 출력테이블(그림 5D)은선택한 섬유의 평균 값을 표시합니다. 선택한 섬유의 다른 통계는 이 GUI 하단의 상태 창에 위치가 표시되는 엑셀 파일에 저장됩니다.
      15. 출력 파일에 선택한 개별 광섬유 정보를 포함하려면 확인 버튼을 클릭하기 전에 원시 데이터 상자에 대한 생성 시트를 확인합니다.
      16. 여러 이미지의 결과를 결합하려면 3.3.2.4 단계에서 배치 모드 상자 또는 스택 모드를 선택하고 분석할 여러 이미지 또는 스택을 선택합니다. 3.3.2.5-3.3.2.6단계를 건너뛰세요. 3.3.2.8-3.3.2.9 단계에서 임계값 조건을 설정하지만 버튼 임계값과 저장 섬유가 비활성화됨에 따라 3.3.2.10-3.3.2.13 단계를 건너뜁니다. 마지막으로, 3.3.2.14 단계의 지침을 따라 선택된 섬유의 요약 통계 및 개별 섬유 특성을 생성한다.

4. 커브를 가진 섬유 분석

참고: CurveAlign은 처음에 사용자 정의 경계와 관련하여 섬유의 각도를 자동으로 측정하도록 개발되었습니다. CurveAlign의 현재 버전은 CT-FIRE에서 추출한 개별 섬유 정보를 로드하거나 커브릿의 로컬 방향을 직접 사용하여 상대적 각도 측정 외에도 밀도 및 정렬 기반 피처의 대량 평가에 사용할 수 있습니다. CurveAlign은 CT-FIRE가 섬유 추적 방법으로 채택될 때 밀도 및 정렬뿐만 아니라 개별 섬유 특성을 주로 포함하는 전역 또는 로컬 기능과 관련된 최대 30개의 기능을 계산합니다.

1. 커브릿을 갖춘 섬유 분석
   1. 2.3에 설명된 대로 APP를 실행합니다.
   2. 재설정 버튼을 클릭하여 다른 작업이 수행된 경우 APP를 초기 상태로 재설정합니다.
   3. 기본GUI(그림 6A)에서 섬유 분석 방법 옵션을 확인하여 CT가 선택되었는지 확인합니다(기본 옵션).
      참고: 이 모드에서CT는 이미지에서 수행되며 각 커브렛의 방향은 해당 위치에서 섬유의 방향을 나타냅니다.
   4. 경계 메서드 드롭다운 메뉴를 클릭하고 경계 없음, CSV 경계 및 TIFF 경계 옵션의 경계 처리 모드를 다음 드롭다운 메뉴 옵션에서 선택합니다.
      참고: 경계가 필요하지 않은 경우 이 단계를 건너뜁니다. 경계에 대하여 섬유 각도를 계산하는 방법에 대해서는 4.3을 참조하십시오.
   5. 주GUI(그림 6A)의 이미지 받기 버튼을 클릭한 다음 프롬프트 창에서 하나 이상의 이미지/또는 이미지 스택을 선택합니다. 운영 체제에 적합한 기술을 사용하여 대화 상자에서 여러 이미지를 선택합니다(예: Windows에서 여러 파일을 선택하는 동안 CTRL을 보유).
      참고: 두 개 이상의 이미지 파일을 선택한 경우 모든 이미지는 분석을 위해 동일한 실행 중인 매개 변수를 사용해야 합니다. 모든 이미지가 동일하거나 유사한 조건에서 획득되는지 확인합니다.
   6. 이미지 스택의 경우 파일 목록 상자 아래에 슬라이스 슬라이더를 이동하여 분석할 슬라이스를 선택합니다.
   7. 계속하기 위해 coefs의 분수를 입력합니다. 이 값은 섬유 분석에 사용될 CT의 가장 큰 계수의 분획입니다.
      참고: 이미지가 섬유 강도 나 대비의 큰 변화가있는 경우,이 모드는 이미지에서 가장 밝은 섬유를 감지하기 때문에 섬유 분석에 대한 대조와 관심 영역을 음부. 또한 이미지 크기가 클수록 이 분획에 대해 더 작은 값을 설정합니다.
   8. 출력 옵션 및 기타 매개 변수를 기본값으로 고급 옵션에 보관합니다. 출력 파일은 다른 향후 작업에 필요할 수 있습니다.
   9. 메인GUI(그림 6A)의하단에 있는 실행 버튼을 클릭합니다.
      참고: 진행률 정보는 하단의 녹색으로 강조 표시된 메시지 창에 표시됩니다. 프로세스가 완료되면 각 이미지에 대한 일부 요약 통계가 출력테이블(그림 6B)에표시되고 모든 출력 파일은 원본 이미지의 디렉터리에서 CA_Out 라는 하위 폴더에 자동으로 저장됩니다.
   10. 출력테이블(도 6B)의모든 항목을 클릭하여 섬유 각의 히스토그램(도6E)또는 나침반 플롯(도6F)을확인합니다.
       참고: 정렬 또는 각도의 오버레이이미지(도 6C)및 히트맵(도6D)도표시됩니다.
   11. 리셋 버튼을 클릭하여 다른 작업을 실행하거나 기본 GUI를 닫아 APP를 종료합니다.
2. CT-FIRE를 가진 개별 섬유 분석
   참고: 절차는 4.1.3 단계에서 CT-FIRE 관련 섬유 분석 모드를선택하고, 적용 할 수 없으며 CT-FIRE 모드에서 비활성화된 경우 4.1.7 단계를 건너 뛰는 것을 제외하고는 섹션 4.1에 설명된 절차와 동일합니다. 구체적으로, 4.1.3 단계에서, 다음 세 개의 CT-FIRE 기반 개별 섬유 분석 방법 중 하나를 선택하십시오.
   1. 섬유 중심점과 섬유 각을 사용하여 섬유를 나타내는 CT-FIRE 섬유를 선택합니다.
      참고: 이 옵션은 섬유 의 길이에 따라 섬유 방향의 변화를 고려하지 않습니다.
   2. CT-FIRE 엔드포인트를 선택하여 섬유의 두 끝점과 해당 섬유 각도를 사용하여 섬유를 나타냅니다.
      참고: 4.2.1과 비교하여 이 옵션은 두 개의 위치를 사용하여 섬유가 아닌 섬유를 나타냅니다(섬유의 중심점).
   3. 섬유 세그먼트를 사용하여 섬유세그먼트를 사용하여 섬유를 나타내는 CT-FIRE 세그먼트를 선택합니다.
      참고: 각 세그먼트는 동일한 길이(CT-FIRE에서 기본적으로 5픽셀로 설정됨)와 방향 및 위치가 있어 섬유의 전체 길이에 따라 방향의 변화를 반영합니다. 이 옵션은 가장 시간이 많이 소요되지만 곡선 섬유의 로컬 방향의 변화를 추적하는 세 가지 CT-FIRE 기반 광섬유 분석 방법 중 가장 좋은 선택이 될 것입니다.
3. 경계가 있는 상대 정렬 분석
   참고: 섹션 4.2 및 4.3에 설명된 경계 조건이 없는 일반 해석과 비교하여 경계 조건과의 상대 정렬 분석은 다음이 필요합니다.
   1. 4.1.3 단계에서 티프 경계 조건을 선택합니다.
      참고: 사용자는 각 이미지 또는 각 스택에 대해 해당 경계 파일이 필요합니다. 화면 지침에 따라 CSV(쉼표 구분값 형식 기반, x-y 좌표) 경계 파일 또는 Tiff 경계 파일에 수동으로 추가로 추가로 알테기합니다. CurveAlign에서 생성된 경계 파일은 설명서에 설명된 파일 디렉터리 및 파일 이름 지정 규칙에 따라 자동으로 저장됩니다. H&E 밝은 필드 및 SHG 이미지가 제공되면 섹션 4.4에 설명된 자동 경계 생성 모듈을 사용하여 경계 파일을 생성합니다.
   2. 기본 매개 변수 패널에서 가장 가까운 경계에서 거리를 입력하여 이 거리 범위 내의 섬유만 평가합니다.
   3. 출력 옵션 패널에서 경계 연결 상자 Bdry Assoc을 선택하여 섬유, 섬유 세그먼트 또는 커브렛과 연결된 경계의 점을 시각화합니다.
4. 자동 경계 생성
   1. 2.3에 설명된 대로 APP를 실행합니다.
   2. 재설정 버튼을 클릭하여 다른 작업이 이미 수행된 경우 APP를 초기 상태로 재설정합니다.
   3. BD 생성 버튼을 클릭하여 자동 경계 생성 모듈을 시작합니다.
   4. 화면 의 지침/단서를 따라 H&E 밝은 필드 및 SHG 이미지 쌍을 기반으로 하나 이상의 이미지에 대한 경계 파일을 만듭니다.
   5. 모듈 창을 닫거나 기본GUI(그림 6A)의 리셋 버튼을 클릭하여 이 모듈을 종료합니다.
5. 곡선관심분석 영역
   1. ROI 관리자를 사용한 ROI 어노피
      1. 하나 이상의 이미지를 로드하려면 주GUI(그림 6A)의 이미지 얻기 버튼을 클릭합니다.
      2. 파일 목록에 추가할 이미지를 선택합니다.
      3. ROI 관리자를 클릭하여 ROI 관리자 모듈(그림7A)을시작합니다.
      4. 3.2.1.1섹션에서 3.2.1.5-3.2.1.13 단계를 따르십시오.
   2. ROI 관리자의 단일 이미지에 대한 ROI 분석
      1. 전체 이미지 CurveAlign 분석이 수행되고 결과가 기본 디렉터리에 저장되는 경우 ROI 목록에서 하나 이상의 ROI를 클릭한 다음 CA ROI 분석기 버튼을 클릭하여 ROI 후 분석을 실행합니다.
         참고: 분석이 완료되면 요약 통계가 출력 테이블(도7C)과각도 분포를 나타내는 히스토그램 그림(그림7D)에표시됩니다.
      2. 주어진 ROI(도7B)와섬유 각의 히스토그램으로 섬유를 시각화하기 위해 출력 테이블의 모든 항목을 클릭합니다.
      3. \\[이미지 폴더]\ CA_ROI\개별\ROI_post_analysis\에있는 하위 폴더에 저장된 출력 파일을 확인합니다.
      4. 전체 이미지 CA 분석이 수행되지 않은 경우 ROI 목록에서 하나 이상의 ROI를 클릭하고 ROI 버튼의 CA 적용 을 클릭하여 선택한 ROI에 CA 분석을 직접 적용합니다. 프롬프트 창의 지침을 따라 분석을 실행합니다.
         참고: CA 분석을 실행하기 위한 매개 변수는 주 GUI를 통해 전달됩니다. 필요에 따라 4.1.7 단계에서 설명된 실행 매개 변수를 업데이트합니다. 분석이 완료되면 섬유 측정값의 요약 통계 결과가 출력 테이블에 표시됩니다. 결과는 \\[이미지 폴더]\CA_ROI\개별\ROI_analysis\에 있는 하위 폴더에 자동으로 저장됩니다.
   3. ROI 분석기를 사용하여 여러 이미지에 대한 ROI 분석
      1. 4.5.1의 단계를 수행하여 이미지를 분석할 ROI에 추가합니다.
      2. 이미지 이미지 받기 버튼을 클릭하여 하나 이상의 이미지를 엽니다.
      3. 전체 이미지 분석 결과를 사용할 수 있는 경우 ROI 사후 분석을 실행하려면 ROI 분석 버튼을 클릭하고 ROI 후처리옵션을 선택합니다.
      4. GUI 의 하단과 명령 창에 메시지 창에 표시되는 진행률 정보를 확인합니다.
      5. 분석이 완료되면 출력 테이블에 표시된 각 ROI에 대한 요약 통계를 확인합니다.
         참고: 자세한 출력 파일은 \\ [이미지 폴더]\\CA_ROI\batch\ROI_post_analysis\에있는 하위 폴더에 자동으로 저장됩니다.
      6. 전체 이미지 분석 결과를 사용할 수 없는 경우 CT-모드로 직접 분석을 실행하려면 다음 변경 사항을 제외하고 4.5.3.1-4.5.3단계를 따르십시오: 모든 형상의 ROI가 있는 마스크의 자른 직사각형 ROI 또는 CA에서 옵션 CA를 선택하여 단계 4.5.3.3을 수정하십시오. 모든 부가 된 ROI가 직사각형 모양인 경우 직사각형 ROI 옵션을 선택합니다. 4.5.3.2 단계를 수행한 후 4.1.7에 설명된 대로 실행 중인 매개 변수를 업데이트합니다.
         참고: ROI 분석 결과는 \\ [이미지 폴더]\\CA_ROI\일괄 처리\ROI_analysis\에 있는 하위 폴더에 저장됩니다.
6. 커브정렬 의 후처리
   1. 섹션 2.3에 설명된 대로 APP를 시작합니다.
   2. 다른 작업이 이미 수행된 경우 재설정 버튼을 클릭하여 APP를 초기 상태로 재설정합니다.
   3. 처리 후 버튼을 클릭하여 후처리 모듈을 시작합니다.
   4. 화면의 지침/단서를 따라 다른 이미지의 출력 피처 또는 값을 결합합니다.
   5. 모듈 창을 닫거나 기본GUI(그림 6A)의 리셋 버튼을 클릭하여 이 모듈을 종료합니다.

5. 예상 실행 시간

1. 적당한 섬유 밀도가 있는 1024픽셀 x 1024 픽셀 크기의 이미지를 처리하기 위한 예상 실행 시간을 기다립니다. 실제 계산 시간은 일반적으로 파일의 크기, 분석 모드, 배포할 기능, 중앙 처리 장치(CPU) 유형 및 사용 가능한 랜덤 액세스 메모리(또는 RAM)의 양을 포함한 여러 요인에 따라 달라집니다. CT-FIRE 개별 섬유 추출에는 몇 분이 걸립니다. 경계가 없는 커브정렬 CT 모드는 몇 초 정도 걸립니다. CurveAlign 경계가 없는 CT-FIRE 섬유 또는 섬유 끝 모드는 수십 초가 걸립니다. 경계가 없는 커브정렬 CT-FIRE 파이버 모드는 수백 초가 걸립니다. 경계가 있는 CurveAlign 해석은 경계의 복잡성에 따라 수십 초에서 몇 분 정도 걸립니다.

결과

이러한 방법은 수많은 연구에서 성공적으로 적용되었습니다. 몇몇 전형적인 응용 프로그램은 다음을 포함합니다: 1) Conklin 외.²² 종양 관련 콜라겐 서명을 계산하기 위하여 CurveAlign를 이용하고, 콜라겐 섬유가 더 빈번하게 그(DCIS) 병변에 있는 덕트 암에 있는 덕트 둘레에 수직으로 정렬되었다는 것을 것을을 발견했습니다; 2) Drifka^{외. 10} 은 커브얼에서 CT-FIRE 모드?...

토론

이 프로토콜은 피브릴라 콜라겐 정량화를 위해 CT-FIRE 및 CurveAlign의 사용을 설명하고 콜라겐 섬유 또는 CT-FIRE 또는 CurveAlign에 의해 분석에 적합한 다른 라인 과 같은 또는 섬유와 같은 길쭉한 구조를 가진 모든 이미지에 적용 될 수 있습니다. 예를 들어 엘라스틴 또는 탄성 섬유는 이 플랫폼에서 유사한 방식으로 처리될 수 있습니다. 우리는 계산 생성 합성 섬유^(21)에두 도구를 모?...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
CT-FIRE	Univerity of Wisconsin-Madison	N/A	open source software available from https://eliceirilab.org/software/ctfire/
CurveAlign	University of Wisconsin-Madison	N/A	open source software available from https://eliceirilab.org/software/curvealign/