Erstellung von Vogel-Vorderhirn-Chimären zur Beurteilung der Gesichtsentwicklung

Zusammenfassung

Dieser Artikel beschreibt eine Gewebetransplantationstechnik, die entwickelt wurde, um die Signal- und Musterbildungseigenschaften des basalen Vorderhirns während der kraniofazialen Entwicklung zu testen.

Zusammenfassung

Der Vogelembryo wird seit mehr als einem Jahrhundert als Modellsystem verwendet und hat zu einem grundlegenden Verständnis der Entwicklung von Wirbeltieren geführt. Eine der Stärken dieses Modellsystems besteht darin, dass die Wirkung und Interaktion zwischen Geweben direkt in chimären Embryonen beurteilt werden kann. Wir haben bereits gezeigt, dass Signale aus dem Vorderhirn zur Morphogenese des Gesichts beitragen, indem sie die Form der Expressionsdomäne von Sonic hedgehog (SHH) in der frontonasalen ektodermalen Zone (FEZ) regulieren. In diesem Artikel wird die Methode zur Erzeugung der Vorderhirnchimären beschrieben und die Ergebnisse dieser Experimente veranschaulicht.

Einleitung

Ein Großteil der aktuellen Forschung in der Entwicklungsbiologie konzentriert sich auf die Rolle der Gene bei der Formung von Embryonen. Es gibt gute Werkzeuge, um Entwicklungsmechanismen aus genetischer Sicht zu untersuchen. Embryonen werden jedoch als Reaktion auf Gewebeinteraktionen zusammengesetzt und durchlaufen eine Morphogenese. Das Vogelsystem ist ein klassisches Instrument, um die Vielfalt der Gewebeinteraktionen zu beurteilen, die die Entwicklung regulieren, und zwar aus folgenden Gründen: Die Embryologie ist gut verstanden, die Embryonen sind leicht zugänglich, die Werkzeuge zur Analyse der Vogelsysteme sind gut entwickelt und die Embryonen sind kostengünstig.

Das Transplantationssystem von Vögeln wird seit fast einem Jahrhundert häufig zur Rückverfolgung von Abstammungslinien und zur Beurteilung von Gewebeinteraktionen während der Entwicklung eingesetzt 1,2,3,4. Dieses System wurde verwendet, um ein Signalzentrum, die frontonasale ektodermale Zone (FEZ), zu untersuchen, die die Morphogenese des Oberkiefers reguliert⁵, und es wurde ein Video veröffentlicht, das diese Technik zuvor beschrieben^{hat 6}. Neben Wachtel-Küken wurden auch andere Arten verwendet, um Chimären für die Analyse von Gewebeinteraktionen zu erzeugen. Zum Beispiel wurde die Maus-FEZ von^Wildtyp-7- und mutierten Mäusen⁸ transplantiert, und andere haben ein Enten-, Wachtel- und Kükensystem verwendet, um die Rolle der Neuralleiste bei der Strukturierung des Gesichtsskeletts^{zu untersuchen 9,10,11,12}.

In dieser Arbeit wurde die Rolle des Vorderhirns bei der Regulation des Genexpressionsmusters in der FEZ durch die reziproke Transplantation des ventralen Vorderhirns zwischen Wachtel-, Enten- und Kükenembryonen untersucht, da ein Signal aus dem Vorderhirn benötigt wird, um die Expression von Sonic hedgehog in der FEZ zu induzieren. Vorderhirntransplantationen sind kein Einzelfall auf diesem Gebiet. Diese Transplantate wurden verwendet, um die Entwicklung der Motilität in Wachtel- und Entenembryonen^{zu beurteilen 13}, obwohl in diesen Experimenten auch Gewebe transplantiert wurden, die zu nicht-neuronalen Derivaten beitrugen. In anderen Arbeiten wurden Hörkreise bei Vögeln durch Vorderhirntransplantation untersucht¹⁴, aber diese Transplantate enthielten mutmaßliche Neuralleistenzellen, die zur Gesichtsform^{beitragen 9,10} und an der Regulierung der SHH-Expression im FEZ^{beteiligt sind 15}. Daher wurde ein System entwickelt, bei dem nur das ventrale Vorderhirn von einer Vogelart auf eine andere transplantiert wird, bevor das Neuralrohr verschlossen wird, um die Rolle des Gehirns bei der Gesichtsform^{zu beurteilen 16} (Abbildung 1A,B). Bei dieser Methode kam es zu keiner Neuralleistenkontamination des Transplantats. In diesem Artikel wird die Methode veranschaulicht, die erwarteten Ergebnisse beschrieben und die Herausforderungen diskutiert.

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Protokoll

Die Weiße Pekin-Ente (Anas platyrhynchos), das Weiße Leghornhuhn (Gallus gallus) und die Japanische Wachtel (Cortunix coturnix japonica) werden bei 37 °C in einer befeuchteten Kammer inkubiert, bis sie bei HH7/8¹⁷ aufeinander abgestimmt sind.

1. Aufbereitung des Spendergewebes

HINWEIS: Die Vorbereitung von Reagenzien und Werkzeugen und das Öffnen von Eiern für experimentelle Manipulationen wurde beschrieben⁶.

1. Bereiten Sie DMEM-Medien mit neutralem Rot, einer Glastransferpipette und geschärften Wolframnadeln vor.
2. Legen Sie die Embryonen frei (wie in⁶ gezeigt).
3. Entnahme von Gewebetransplantaten aus der linken Seite des basalen Vorderhirns von Embryonen im Stadium 7/8. Verwenden Sie gebogene, geschärfte Wolframnadeln⁶ , um vorsichtig ein Stück des Vorderhirns mit einer Länge von ~0,3 mm und einer Breite von 0,2 mm einzuschneiden, und achten Sie darauf, dass Sie das darunter liegende Endoderm nicht einschließen, indem Sie die Nadel unter das Vorderhirn schieben, so dass die Nadel parallel zur Achse des Neuralrohrs ist.
4. Entnahme des Transplantats mit der Glastransferpipette aus dem Spenderembryo.
5. Übertragen Sie das Transplantat für 2 Minuten in DMEM, das neutrales Rot (0,01 % in PBS, 23 °C) enthält, um es zu färben, und legen Sie dann das gefärbte Transplantat in DMEM, das kein neutrales Rot enthält, bis es für die Transplantation bereit ist.

2. Den Host vorbereiten

1. Befruchtete Eier des weißen Leghornhuhns (Gallus gallus) bei 37 °C in einer befeuchteten Kammer bis HH7/8 ¹⁷ bebrüten.
2. Legen Sie die Embryonen frei (wie in⁶ gezeigt).
3. Bereiten Sie die Transplantatstelle mit geschärften Wolframnadeln vor, indem Sie sie vorsichtig abschneiden und dann ein 0,3 mm x 0,2 mm großes Stück basales Vorderhirn von der linken Seite entfernen, um das Transplantat aufzunehmen, wie es bei der Isolierung des Spendergewebes der Fall war.
4. Achten Sie darauf, eine übermäßige Zerstörung des darunter liegenden Endoderms zu vermeiden, die offensichtlich wird, wenn Dotterkörner durch jeden entstandenen Riss austreten. Dies erfordert Übung und nicht alle Versuche werden erfolgreich sein.
5. Nach dem Transfer auf den Wirt⁶ ist das Transplantat so zu positionieren, dass es das exstirpierte basale Vorderhirn des Wirts ersetzt.
6. Legen Sie das Klebeband fest über das Loch und bringen Sie den Embryo für die entsprechende Zeit zur Analyse in den 37 °C heißen Inkubator zurück.

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Ergebnisse

Beurteilung von Chimärismus und Transplantatkontamination
Um die Chimären beurteilen zu können, sollte das Ausmaß des Chimärismus und die Kontamination des Transplantats mit anderen Zelltypen untersucht werden. Die Erzeugung von Chimären durch die Transplantation von Wachtelgewebe in Kükenembryonen ermöglicht diese Art der Analyse. Mit Hilfe des QCPN-Antikörpers können Wachtelzellen sichtbar gemacht und vom Wirtsgewebe unterschieden werden (Abbildung 1 C...

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Diskussion

Die beschriebene Methode erlaubt es, die Gewebeinteraktionen zwischen dem basalen Vorderhirn und dem angrenzenden Ektoderm zu untersuchen. Dieser Ansatz unterscheidet sich von bisherigen Vorderhirntransplantationsmethoden dadurch, dass das Spendergewebe auf das ventrale Vorderhirn beschränkt war. Dadurch wird die Transplantation der Neuralleistenzellen eliminiert, von denen gezeigt wurde, dass sie an der Musterung der Gesichtsmorphologie beteiligt sind ^9,10. Dah...

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Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
1x PBS	TEK	TEKZR114
35x10 mm Petri dish	Falcon	1008
DMEM	Thermofisher	11965084
Needle holder	Fine Science Tools	26016-12
Neutral Red	Sigma	553-24-2
No. 5 Dumont forceps	Fine Science Tools	11252-20
Pasteur Pipets	Thermofisher	13-678-6B
QCPN antibody	Developmental Studies Hybridoma bank, Iowa University, Iowa, USA
Scissors	Fine Science Tools	14058-11
Tungsten Needle	Fine Science Tools	26000