얼굴 발달을 평가하기 위해 조류 전뇌 키메라 만들기

요약

이 기사에서는 두개안면 발달 중 기저 전뇌의 신호 전달 및 패턴 특성을 테스트하도록 설계된 조직 이식 기술에 대해 설명합니다.

초록

조류 배아는 100년 이상 모델 시스템으로 사용되어 왔으며 척추동물 발달에 대한 근본적인 이해로 이어졌습니다. 이 모델 시스템의 강점 중 하나는 키메라 배아에서 조직의 효과와 상호 작용을 직접 평가할 수 있다는 것입니다. 우리는 이전에 전뇌의 신호가 전두엽 외배엽 영역(FEZ)에서 소닉 고슴도치(SHH)의 발현 도메인 모양을 조절하여 안면 형태 형성에 기여한다는 것을 보여주었습니다. 이 기사에서는 전뇌 키메라를 생성하는 방법을 설명하고 이러한 실험 결과를 설명합니다.

서문

발달 생물학에 대한 많은 현대 연구는 배아를 형성하는 유전자의 역할에 초점을 맞추고 있습니다. 유전적 관점에서 발달 메커니즘을 조사할 수 있는 좋은 도구가 있습니다. 그러나 배아는 조립되어 조직 상호 작용에 반응하여 형태 형성을 겪습니다. 조류 시스템은 다음과 같은 이유로 발달을 조절하는 다양한 조직 상호 작용을 평가하는 데 사용되는 고전적인 도구입니다 : 발생학은 잘 이해되고, 배아는 쉽게 접근 할 수 있으며, 조류 시스템 분석 도구는 잘 발달되어 있으며, 배아는 저렴합니다.

조류 이식 시스템은 거의 한 세기 동안 혈통 추적 및 발달 중 조직 상호 작용을 평가하는 데 널리 사용되었습니다 1,2,3,4. 이 시스템은 위턱의 형태 형성을 조절하는 신호 센터인 전두엽 외배엽 영역(Frontonasal Ectodermal Zone, FEZ)을 조사하는 데 사용^{되었으며, 이전에} 6. 메추라기 병아리 외에도 다른 종들도 조직 상호 작용 분석을 위해 키메라를 생산하는 데 사용되었습니다. 예를 들어, 마우스 FEZ는 야생형⁷ 및 돌연변이 마우스⁸로부터 이식되었고, 다른 사람들은 오리, 메추라기 및 병아리 시스템을 사용하여 안면 골격 9,10,11,12을 패턴화하는 데 신경 능선의 역할을 평가했습니다.

본 연구에서는 FEZ에서 소닉 고슴도치 발현을 유도하기 위해서는 전뇌의 신호가 필요하기 때문에 복부 전뇌를 메추라기, 오리, 병아리 배아에 상호 이식하여 FEZ에서 유전자 발현 패턴을 조절하는 전뇌의 역할을 평가하였다. 전뇌 이식은 이 분야에서만 볼 수 있는 것이 아닙니다. 이 이식은 메추라기와 오리 배아의 운동성 발달을 평가하는 데 사용되었지만¹³, 이 실험에서는 비신경 유도체에 기여한 조직도 이식되었다. 다른 연구에서, 조류의 청각 회로는 전뇌 이식(forebrain transplantation)에 의해 평가되었지만, 이러한 이식은 얼굴 모양(^9,10)에 기여하고^FEZ15에서 SHH 발현 조절^에 관여하는 추정 신경 능선 세포를 포함했다. 따라서, 신경관을 폐쇄하기 전에 한 종의 새에서 다른 종으로 복부 전뇌만을 이식하는 시스템이 얼굴 모양에서 뇌의 역할을 평가하기 위해 고안되었습니다(그림 1A, B). 이 방법은 이식편의 신경 능선 오염이 없었습니다. 이 기사에서는 방법을 설명하고 예상 결과를 설명하며 직면한 과제에 대해 설명합니다.

프로토콜

흰 북경 오리 (Anas platyrhynchos), 흰 레그혼 닭 (Gallus gallus) 및 일본 메추라기 (Cortunix coturnix japonica)는 HH7 / 8에서 단계 일치 할 때까지 가습 된 챔버에서 37 ° C에서 배양됩니다¹⁷.

1. 기증자 조직 준비

참고: 시약 및 도구의 준비와 실험 조작을 위해 계란을 여는 방법이 설명되었습니다⁶.

1. 중성 적색, 유리 전사 피펫 및 날카롭게 연마된 텅스텐 바늘로 DMEM 배지를 준비합니다.
2. 배아를 노출시킵니다(⁶ 참조).
3. 7/8기 배아의 기저 전뇌 왼쪽에서 조직 이식편을 채취합니다. 구부러진 뾰족한 텅스텐 바늘⁶ 을 사용하여 길이 ~ 0.3mm, 너비 0.2mm 크기의 전뇌 조각을 부드럽게 절개하고 바늘을 전뇌 아래로 밀어 밑에있는 내배엽을 포함하지 않도록하여 바늘이 신경관의 축과 평행이되도록합니다.
4. 유리 전사 피펫을 사용하여 기증자 배아에서 이식편을 채취합니다.
5. 이식편을 Neutral Red(PBS 중 0.01%, 23°C)가 포함된 DMEM에 2분 동안 옮겨 염색한 후 염색된 이식편을 생착 준비가 될 때까지 Neutral Red가 포함되지 않은 DMEM에 넣습니다.

2. 호스트 준비

1. 흰 레그혼 닭(Gallus gallus)의 수정란을 37°C의 가습실에서 HH7/8까지 배양한다 ¹⁷.
2. 배아를 노출시킵니다(⁶ 참조).
3. 뾰족한 텅스텐 바늘을 사용하여 부드럽게 절단하여 이식편 부위를 준비한 다음 기증자 조직을 분리하기 위해 이식편을 수용하기 위해 왼쪽에서 0.3mm x 0.2mm 기저 전뇌 조각을 제거합니다.
4. 밑에 있는 내배엽이 과도하게 파괴되지 않도록 주의해야 하며, 이는 난황 과립이 찢어진 부분을 통해 누출되기 시작할 때 분명합니다. 이것은 연습이 필요하며 모든 시도가 성공하는 것은 아닙니다.
5. 숙주⁽⁶)로 옮긴 후, 숙주의 절제된 기저 전뇌를 대체하기 위해 이식편을 위치시킨다.
6. 구멍 위에 테이프를 단단히 붙이고 분석을 위해 적절한 시간 동안 배아를 37°C 인큐베이터로 되돌립니다.

결과

키메라와 이식 오염의 평가
키메라를 평가하기 위해서는 키메라의 정도와 다른 세포 유형에 의한 이식편의 오염 정도를 다루어야 합니다. 메추라기 조직을 병아리 배아에 이식하여 키메라를 만들면 이러한 유형의 분석이 가능합니다. QCPN 항체를 사용하여 메추라기 세포를 시각화하고 숙주 조직과 구별할 수 있습니다(그림 1, C, D). 이 경우, 복부 ?...

토론

설명 된 방법은 기저 전뇌와 인접한 외배엽 사이의 조직 상호 작용을 검사 할 수 있습니다. 이 접근법은 기증자 조직이 복부 전뇌로 제한되었기 때문에 이전의 전뇌 이식 방법과 다릅니다. 이것은 얼굴 형태 ^9,10을 패턴화하는 데 참여하는 것으로 밝혀진 신경 능선 세포의 이식을 제거합니다. 따라서 이식편을 기저 전뇌로 제한하는 것은 계획된 실험 결?...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
1x PBS	TEK	TEKZR114
35x10 mm Petri dish	Falcon	1008
DMEM	Thermofisher	11965084
Needle holder	Fine Science Tools	26016-12
Neutral Red	Sigma	553-24-2
No. 5 Dumont forceps	Fine Science Tools	11252-20
Pasteur Pipets	Thermofisher	13-678-6B
QCPN antibody	Developmental Studies Hybridoma bank, Iowa University, Iowa, USA
Scissors	Fine Science Tools	14058-11
Tungsten Needle	Fine Science Tools	26000