Création de chimères du cerveau antérieur aviaire pour évaluer le développement facial

Résumé

Cet article décrit une technique de transplantation de tissus conçue pour tester les propriétés de signalisation et de structuration du cerveau antérieur basal au cours du développement craniofacial.

Résumé

L’embryon aviaire a été utilisé comme système modèle pendant plus d’un siècle et a conduit à une compréhension fondamentale du développement des vertébrés. L’une des forces de ce système modèle est que l’effet et l’interaction entre les tissus peuvent être directement évalués dans les embryons chimériques. Nous avons déjà montré que les signaux du cerveau antérieur contribuent à la morphogenèse faciale en régulant la forme du domaine d’expression du hérisson sonique (SHH) dans la zone ectodermique frontonasale (FEZ). Dans cet article, la méthode de génération des chimères du cerveau antérieur et de fournir des illustrations des résultats de ces expériences est décrite.

Introduction

Une grande partie de la recherche contemporaine en biologie du développement se concentre sur le rôle des gènes dans la formation des embryons. Il existe de bons outils pour examiner les mécanismes de développement d’un point de vue génétique. Cependant, les embryons sont assemblés et subissent une morphogenèse en réponse aux interactions tissulaires. Le système aviaire est un outil classique utilisé pour évaluer la variété des interactions tissulaires qui régulent le développement pour les raisons suivantes: l’embryologie est bien comprise, les embryons sont facilement accessibles, les outils d’analyse des systèmes aviaires sont bien développés et les embryons sont peu coûteux.

Le système de transplantation aviaire a été largement utilisé pour le traçage de la lignée et pour évaluer les interactions tissulaires au cours du développement depuis près d’un siècle 1,2,3,4. Ce système a été utilisé pour étudier un centre de signalisation, la zone ectodermique frontonasale (FEZ), qui régule la morphogenèse de la mâchoire supérieure⁵, et une vidéo a été publiée décrivant cette technique précédemment⁶. En plus de la caille-poussin, d’autres espèces ont également été utilisées pour produire des chimères pour l’analyse des interactions tissulaires. Par exemple, la souris FEZ a été transplantée à partir de souris sauvages de type⁷ et mutantes⁸, et d’autres ont utilisé un système de canard, de caille et de poussin pour évaluer le rôle de la crête neurale dans la structuration du squelette facial 9,10,11,12.

Dans ce travail, le rôle du cerveau antérieur dans la régulation du modèle d’expression génique dans la ZFE en transplantant réciproquement le cerveau antérieur ventral parmi les embryons de caille, de canard et de poussin a été évalué, car un signal du cerveau antérieur est nécessaire pour induire l’expression du hérisson Sonic dans la ZFE. Les greffes de cerveau antérieur ne sont pas uniques dans le domaine. Ces greffes ont été utilisées pour évaluer le développement de la motilité chez les embryons de cailles et de canards¹³, bien que dans ces expériences, des tissus contribuant à des dérivés non neuronaux aient également été transplantés. Dans d’autres travaux, les circuits auditifs chez les oiseaux ont été évalués par transplantation du cerveau antérieur¹⁴, mais ces greffes contenaient des cellules de crête neurale présumées, qui contribuent à la forme du visage ^9,10 et participent à la régulation de l’expression de la SHH dans la FEZ ¹⁵. Par conséquent, un système permettant de transplanter uniquement le cerveau antérieur ventral d’une espèce d’oiseau à une autre avant la fermeture du tube neural a été conçu pour évaluer le rôle du cerveau dans la forme faciale¹⁶ (Figure 1A, B). Cette méthode était dépourvue de contamination de la crête neurale du greffon. Dans cet article, la méthode est illustrée et les résultats attendus sont décrits, et les défis rencontrés sont discutés.

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Protocole

Le canard blanc de Pékin (Anas platyrhynchos), le poulet Livourne blanc (Gallus gallus) et la caille japonaise (Cortunix coturnix japonica) sont incubés à 37 °C dans une chambre humidifiée jusqu’à ce qu’ils atteignent le stade correspondant à HH7/8¹⁷.

1. Préparation du tissu donneur

NOTE: La préparation des réactifs et des outils et la façon d’ouvrir les œufs pour la manipulation expérimentale ont été décrites⁶.

1. Préparez les supports DMEM avec du rouge neutre, une pipette de transfert en verre et des aiguilles en tungstène affûtées.
2. Exposer les embryons (comme indiqué au^{point 6}).
3. Prélever des greffes de tissus du côté gauche du cerveau antérieur basal des embryons de stade 7/8. Utilisez des aiguilles de tungstène aiguisées^{incurvées 6} pour inciser doucement un morceau du cerveau antérieur mesurant ~0,3 mm de longueur sur 0,2 mm de largeur, en veillant à ne pas inclure l’endoderme sous-jacent en glissant l’aiguille sous le cerveau antérieur de sorte que l’aiguille soit parallèle à l’axe du tube neural.
4. À l’aide de la pipette de transfert en verre, prélever le greffon sur l’embryon du donneur.
5. Transférer le greffon dans du DMEM contenant du rouge neutre (0,01% dans PBS, 23 ° C) pendant 2 minutes pour le colorer, puis placer le greffon coloré dans le DMEM qui ne contient pas de rouge neutre jusqu’à ce qu’il soit prêt pour la greffe.

2. Préparation de l’hôte

1. Incuber les œufs fécondés du poulet blanc Livourne (Gallus gallus) à 37 °C dans une chambre humidifiée jusqu’à HH7/8 ¹⁷.
2. Exposer les embryons (comme indiqué au^{point 6}).
3. À l’aide d’aiguilles de tungstène aiguisées, préparer le site du greffon en coupant doucement, puis en retirant un morceau de cerveau antérieur basal de 0,3 mm sur 0,2 mm du côté gauche pour accueillir le greffon comme cela a été fait pour isoler le tissu du donneur.
4. Prenez soin d’éviter une perturbation excessive de l’endoderme sous-jacent, qui sera évidente lorsque les granules vitellins commenceront à couler à travers toute déchirure qui est faite. Cela demande de la pratique et toutes les tentatives ne seront pas couronnées de succès.
5. Après le transfert à l’hôte⁶, positionner le greffon pour remplacer le cerveau antérieur basal extirpé de l’hôte.
6. Placer le ruban adhésif hermétiquement sur le trou et remettre l’embryon dans l’incubateur à 37 °C pendant la durée appropriée pour l’analyse.

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Résultats

Évaluation du chimérisme et de la contamination par les transplantations
Afin d’évaluer les chimères, l’étendue du chimérisme et la contamination du greffon par d’autres types de cellules doivent être abordées. La création de chimères par transplantation de tissus de caille dans des embryons de poussins permet ce type d’analyse. En utilisant l’anticorps QCPN, les cellules de caille peuvent être visualisées et distinguées des tissus hôtes (Figure 1 ...

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Discussion

La méthode décrite permet d’examiner les interactions tissulaires entre le cerveau antérieur basal et l’ectoderme adjacent. Cette approche diffère des méthodes précédentes de transplantation du cerveau antérieur, car le tissu du donneur était limité au cerveau antérieur ventral. Cela élimine la transplantation des cellules de la crête neurale, qui ont été montrées pour participer à la structuration de la morphologie faciale ^9,10. Par conséqu...

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matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
1x PBS	TEK	TEKZR114
35x10 mm Petri dish	Falcon	1008
DMEM	Thermofisher	11965084
Needle holder	Fine Science Tools	26016-12
Neutral Red	Sigma	553-24-2
No. 5 Dumont forceps	Fine Science Tools	11252-20
Pasteur Pipets	Thermofisher	13-678-6B
QCPN antibody	Developmental Studies Hybridoma bank, Iowa University, Iowa, USA
Scissors	Fine Science Tools	14058-11
Tungsten Needle	Fine Science Tools	26000