Analyse der neutralen Lipidsynthese in Saccharomyces cerevisiae durch metabolische Markierung und Dünnschichtchromatographie

Zusammenfassung

Hier wird ein Protokoll zur metabolischen Markierung von Hefe mit ¹⁴C-Essigsäure vorgestellt, das mit dünnschichtiger Chromatographie zur Abtrennung neutraler Lipide gekoppelt ist.

Zusammenfassung

Neutrale Lipide (NLs) sind eine Klasse von hydrophoben, ladungslosen Biomolekülen, die eine Schlüsselrolle bei der Energie- und Lipidhomöostase spielen. NLs werden de novo aus Acetyl-CoA synthetisiert und kommen in Eukaryoten vor allem in Form von Triglyceriden (TGs) und Sterolestern (SEs) vor. Die Enzyme, die für die Synthese von NLs verantwortlich sind, sind von Saccharomyces cerevisiae (Hefe) für den Menschen hoch konserviert, was Hefe zu einem nützlichen Modellorganismus macht, um die Funktion und Regulation von NL-Stoffwechselenzymen zu analysieren. Während viel darüber bekannt ist, wie Acetyl-CoA in eine Vielzahl von NL-Spezies umgewandelt wird, werden Mechanismen zur Regulierung von NL-Stoffwechselenzymen und wie Fehlregulation zu zellulären Pathologien beitragen kann, immer noch entdeckt. Zahlreiche Methoden zur Isolierung und Charakterisierung von NL-Arten wurden in jahrzehntelanger Forschung entwickelt und eingesetzt; Ein quantitatives und einfaches Protokoll für die umfassende Charakterisierung der wichtigsten NL-Arten wurde jedoch nicht diskutiert. Hier wird eine einfache und anpassungsfähige Methode zur Quantifizierung der De-novo-Synthese wichtiger NL-Arten in Hefe vorgestellt. Wir wenden ¹⁴C-Essigsäure-Stoffwechselmarkierungen in Verbindung mit Dünnschichtchromatographie an, um eine Vielzahl physiologisch wichtiger NLs zu trennen und zu quantifizieren. Darüber hinaus kann diese Methode leicht angewendet werden, um in vivo Reaktionsraten von NL-Enzymen oder den Abbau von NL-Spezies im Laufe der Zeit zu untersuchen.

Einleitung

Acetyl-CoA ist der grundlegende Baustein verschiedener Biomoleküle, einschließlich neutraler Lipide (NLs), die als vielseitige biomolekulare Währung für den Aufbau von Membranen, die Erzeugung von ATP und die Regulierung der Zellsignalisierung dienen^1,2. Die Verfügbarkeit von NLs, die in einen dieser jeweiligen Pfade geschoben werden können, wird teilweise durch ihre Speicherung reguliert. Lipidtröpfchen (LDs), zytoplasmatische Organellen, die aus hydrophoben Kernen von Triglyceriden (TGs) und Sterolestern (SEs) bestehen, sind die Hauptspeicherkompartimente der meisten zellulären NLs. Als solche sequestrieren und regulieren LDs NLs, die abgebaut und anschließend für biochemische und metabolische Prozesse genutzt werden können^3,4. Es ist bekannt, dass die Fehlregulation von NL- und LD-assoziierten Proteinen mit dem Auftreten von Pathologien wie Lipodystrophie und metabolischen Syndromen korreliert^5,6. Aus diesem So konzentriert sich die aktuelle LD-Forschung intensiv darauf, wie die NL-Synthese räumlich, zeitlich und über verschiedene Gewebe mehrzelliger Organismen hinweg reguliert wird. Aufgrund der allgegenwärtigen zellulären Rolle für NLs sind viele Enzyme, die für die Synthese und Regulation von NLs verantwortlich sind, in allen Eukaryoten^{erhalten 7}. Tatsächlich speichern sogar einige Prokaryoten NLs in LDs⁸. Daher waren genetisch traktierbare Modellorganismen wie Saccharomyces cerevisiae (Knospenhefe) für die Untersuchung der NL-Synthese und -Regulation nützlich.

Die Trennung und Quantifizierung von NLs aus Zellextrakten kann auf vielfältige Weise erreicht werden, einschließlich Gaschromatographie-Massenspektrometrie (GC-MS), Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (HPLC) und Ultra-Performance-Flüssigkeitschromatographie-Massenspektrometrie (UPLC-MS)^9,10,11. Die vielleicht einfachste Methode zur Trennung von NLs ist die Dünnschichtchromatographie (TLC), die eine anschließende densitometrische Quantifizierung aus einer Standardkurve^12,13ermöglicht. Obwohl TLC nur eine kurskörnige Trennung von NLs bietet, bleibt es eine leistungsstarke Technik, da es kostengünstig ist und die schnelle Trennung von NLs von mehreren Proben gleichzeitig ermöglicht. Zwei der größten Herausforderungen bei der Untersuchung von NLs mittels TLC sind: 1) das breite Spektrum der zellulären Häufigkeiten von NL-Spezies und ihren Zwischenprodukten und 2) das Spektrum der Hydrophilie / Hydrophobie von Lipidzwischenprodukten innerhalb der NL-Synthesewege. Folglich ist die Quantifizierung von NL-Arten über TLC typischerweise auf die am häufigsten vorkommenden Arten beschränkt; Die Einführung einer 14-C-Essigsäure-Radiomarkierung kann jedoch den Nachweis von Zwischenprodukten mit geringer Abundanz innerhalb von NL-Signalwegen erheblich verbessern. Essigsäure wird durch die Acetyl-CoA-Synthetase ACS2¹⁴schnell in Acetyl-CoA umgewandelt, wodurch ¹⁴C-Essigsäure ein geeignetes Radiomarkierungssubstrat in Hefe¹⁵ist. Zusätzlich kann die Trennung sowohl von hydrophoben NLs als auch von hydrophilen Zwischenprodukten von NLs durch TLC durch den Einsatz mehrerer Lösungsmittelsysteme erreicht werden¹⁶. Hier wird ein Verfahren zur Trennung von NLs mittels ¹⁴C-Essigsäure-Stoffwechselmarkierung in Hefe vorgestellt. Lipide, die während der Pulszeit markiert werden, werden anschließend durch ein gut etabliertes Totallipidisolationsprotokoll¹⁷isoliert, gefolgt von der Trennung der NL-Spezies durch TLC. Die Entwicklung von TLC-Platten sowohl durch Autoradiographie zur Visualisierung markierter Lipide als auch durch ein chemisches Spray zur Visualisierung von Gesamtlipiden ermöglicht mehrere Quantifizierungsmethoden. Einzelne Lipidbänder können auch leicht mit einer Rasierklinge aus der TLC-Platte extrahiert werden, und die Szintillationszählung kann verwendet werden, um die Menge an radioaktiv markiertem Material innerhalb des Bandes zu quantifizieren.

Protokoll

1. Wachstum und Markierung von Hefezellen mit ¹⁴C-Essigsäure

1. Impfen Sie eine Hefekultur, indem Sie eine Kolonie von einem Teller pflücken und in 20 ml synthetisches komplettes (SC) Medium mit 2% Dextrose dosieren (siehe Ergänzungsdatei für die Rezeptur von SC-Medien). Bei 30 °C über Nacht mit Schütteln bei 200 U/min inkubieren.
   HINWEIS: Wachstumszustand, Probenvolumen und Behandlung unterscheiden sich je nach den lipiden von Interesse. Vor der Durchführung vollständiger Experimente sollten optimale Wachstumsbedingungen und Kulturvolumina empirisch bestimmt werden. Dieses Protokoll diskutiert die Radiomarkierung von Hefekulturen, die in eine stationäre Phase gezüchtet wurden, eine Wachstumsphase, in der sich das Wachstum von Biomembran und Zellen verlangsamt, und die NL-Synthese ist sehr aktiv.
2. Messen Sie den OD₆₀₀ der Nachtkultur mit einem Spektralphotometer und verdünnen Sie die Hefezellkultur auf einen endgültigen OD₆₀₀ von 0,2 in 50 ml frischem SC-Medium mit 2% Dextrose. Züchten Sie die Zellen für 24 h oder bis sie die stationäre Phase erreicht haben (die üblicherweise durch eine flache Auskleidung der Zellverdopplung OD_600-Messung definiert wird).
3. Bevor Sie die Zellen sammeln, machen Sie den Abschreckpuffer (siehe Ergänzungsdatei für Details). Machen Sie zwei 20-ml-Aliquoten Abschreckpuffer für jede Probe (d. h. 40 ml Abschreckpuffer für jede Probe) und teilen Sie sie gleichmäßig in zwei konische 50-ml-Röhrchen auf). Lagern Sie die Quenching Buffer Aliquots bei -80 °C für den zukünftigen Gebrauch.
4. Sobald die Kulturen die gewünschte OD- oder Wachstumsphase erreicht haben, sammeln Sie die Zellen durch Zentrifugieren bei 4.100 x g für 10 min. Während sich die Proben in der Zentrifuge befinden, werden Radiomarkierungsmedien vorbereitet, indem Sie^[1-14C] Essigsäure-Natriumsalz zu dextrosefreien SC-Medien in einer Endkonzentration von 10 μCi / ml hinzufügen.
   ACHTUNG: Bei der Arbeit mit radioaktiven Stoffen sollte immer eine angemessene persönliche Schutzausrüstung (PSA) getragen werden. Befolgen Sie immer die lokalen Richtlinien für die ordnungsgemäße Lagerung, Verwendung und Entsorgung radioaktiver Stoffe.
   HINWEIS: Sowohl die Konzentration von ¹⁴C-Essigsäure in den Markierungsmedien als auch die Radiomarkierungszeit sollten entsprechend dem/den interessierenden Metaboliten angepasst werden. Hier wird eine 20-minütige Radiomarkierungsimpulsinkubation verwendet, die ausreicht, um NL-Arten mit einem Abundanzbereich zu kennzeichnen.
5. Entfernen Sie den Überstand aus den pelletierten Zellen und waschen Sie das Zellpellet einmal mit 20 ml dextrosefreiem SC-Medium, indem Sie das Pellet mit einer Pipette resusperieren. Sammeln Sie die Zellen wieder durch Zentrifugieren bei 4.100 x g für 5 min.
6. Resuspendieren Sie die Zellen in 1 ml dextrosefreies SC-Medium und übertragen Sie die Zellen in ein markiertes 2-ml-Mikrozentrifugenröhrchen. Sammeln Sie die Zellen wieder durch Zentrifugieren bei 4.100 x g für 2 min.
7. Resuspendieren Sie die Zellen erneut in 500 μL dextrosefreien SC-Medien. Kühlen Sie eine Zentrifuge vor, die für konische Rohre mit 50 ml auf -10 °C oder auf die niedrigste Temperatureinstellung ausgestattet ist.
8. Beginnen Sie die Radiomarkierungsphase, indem Sie schnell 500 μL Radiomarkierungsmedien zu jeder 500 μL Zellsuspension hinzufügen (endgültige ¹⁴C-Essigsäurekonzentration = 5 μCi/ml). Inkubieren Sie die Röhrchen in einem rotierenden Inkubator bei 30 °C für 20 min. 2 min vor Ende der Etikettierzeit, geben Sie für jede Probe einen 20 mL Aliquotenabschreckpuffer aus dem -80 °C Gefrierschrank in einen Eimer Eis
9. Sobald die Radiomarkierungsperiode beendet ist, verwenden Sie eine Pipette, um die gesamte 1-ml-Probe in 20 ml Kaltabschreckpuffer zu tauchen. Wirbeln Sie die konischen Röhrchen für 5-10 s vor, um sicherzustellen, dass die Probe gründlich mit dem Abschreckpuffer gemischt wurde. Inkubieren Sie die Proben im Abschreckpuffer für 2 min auf Eis.
10. Sammeln Sie das Zellpellet durch Spinnen in einer Zentrifuge bei 5.000 x g für 3 min eingestellt auf -10 °C oder auf die niedrigste Temperatureinstellung. Während sich die Probenröhrchen drehen, wird ein weiterer Satz Abschreckpuffer-Aliquot aus dem Gefrierfach -80 °C in einen mit Eis gefüllten Eimer (d. h. ein 20-ml-Röhrchen Abschreckpuffer pro Probe) übertragen.
11. Entfernen Sie den Abschreckpufferüberstand aus den Zellpellets und ersetzen Sie ihn durch einen frischen, kalten Abschreckpuffer von 20 ml. Wirbeln Sie die Proben aus und schütteln Sie sie, bis das Pellet vom Boden des konischen Rohrs gelöst und vollständig im Abschreckpuffer resuspendiert wurde. Zentrifugieren Sie die Proben erneut bei 5.000 x g für 3 min bei -10 °C, um die Zellen zu sammeln.
12. Sobald die Zellen pelletiert sind, entfernen Sie gründlich alle Abschreckpuffer aus den Proben, indem Sie den Überstand abgießen und den Überschuss mit einer Pipette entfernen. Rohre zur Weiterverarbeitung bei -80 °C lagern.

2. Isolierung der Gesamtlipide aus Hefe

HINWEIS: Das folgende Protokoll zur Lipidisolierung basiert auf einer etablierten und häufig verwendeten Methode, die die meisten neutralen Lipidarten effizient extrahiert^17,18.
VORSICHT: Wenn Sie organische Lösungsmittel verwenden, tragen Sie immer geeignete PSA und arbeiten Sie, wenn möglich, in einem Abzug. Vermeiden Sie während der Lipidextraktion die Verwendung von Kunststoffen, die mit organischen Lösungsmitteln nicht kompatibel sind. Polypropylentuben sind für das folgende Protokoll geeignet.

1. Wiegen Sie für jede Probe 0,3 g säuregewaschene Glasperlen und lagern Sie sie in 2 mL Mikrozentrifugenröhrchen auf Eis. Entfernen Sie die Zellpellets aus dem -80 °C Gefrierschrank und halten Sie sie auf Eis. 350 μL Methanol und 700 μL Chloroform zu jeder Probe geben, resuspendieren und in Mikrozentrifugenröhrchen mit vorgewogenen Glasperlen geben.
2. Lyse Zellen durch Rühren von Röhrchen auf einem Wirbel 3x für 1 min, mit 30 s Inkubationen auf Eis zwischen den Agitationen. Alternativ können Zellen mit einem Mini-Perlenschläger für drei 1-minütige Zyklen lysiert werden. Speichern Sie 25-30 μL ganzzelliges Lysat in einem separaten Röhrchen für die Szintillationszählung.
   HINWEIS: Das gespeicherte Lysat wird verwendet, um die relative Menge an Radioisotop zu bestimmen, die von jeder Probe während der Pulsperiode aufgenommen wird, was die Menge jeder auf die TLC-Platte geladenen Probe beeinflusst. Dies wird in Schritt 3.2 weiter erläutert.
3. Gießen Sie den gesamten Inhalt des 2-ml-Mikrozentrifugenröhrchens in ein 15-ml-Glaszentrifugenröhrchen [Röhrchen A]. Waschen Sie die 2 mL Mikrozentrifugenröhrchen durch Zugabe von 1 ml Methanol und Wirbel für 10-15 s. Die 1-ml-Methanolwäsche wird in Rohr A gegeben und 2 ml Chloroform in Rohr A gegeben, gefolgt von 400 μL Wasser für ein endgültiges Probenvolumen von 4,45 ml.
4. Wirbelproben für 1 min, gefolgt von einer 5 min Zentrifugation bei 1.000 x g. Nach der Zentrifugation sollten die wässrige (obere) und organische (untere) Phase visuell klar getrennt werden, wobei Zelltrümmer an der Grenzfläche liegen.
5. Sammeln Sie mit einer Pasteur-Pipette aus Glas die organische Phase von Rohr A und wechseln Sie zu einem neuen 15-ml-Glaszentrifugenrohr (Rohr B). 1 ml 1M KCl in Röhre B geben. Zu Rohr A werden 1 ml Methanol und 2 ml Chloroform sowie 200 μL MiliQ-Wasser hinzugefügt. Wiederholen Sie die Wirbel- und Zentrifugationsschritte auf Rohr A.
6. Sammeln Sie erneut die organische Phase von Röhre A und geben Sie sie in Röhre B. Entsorgen Sie Rohr A in einem geeigneten Behälter. Wirbelrohr B für 1 min gefolgt von einer 5 min Zentrifugation bei 1.000 x g.
7. Entfernen Sie die obere wässrige Schicht aus Rohr B und entsorgen Sie sie. Fügen Sie 1 ml frisches 1 M KCl zurück in rohr B und wiederholen Sie den Vortexing/Zentrifugationsschritt. Sobald die Schichten getrennt sind, sammeln Sie vorsichtig die gesamte untere organische Schicht in einer markierten 4-ml-Glasfläschchen.
   HINWEIS: In diesem Schritt können Lipidextrakte bei -80 °C gelagert oder das Protokoll für die TLC-Trennung von Lipiden fortgesetzt werden.

3. Trennung und Quantifizierung von radioisotopenmarkierten NLs durch Dünnschichtchromatographie

1. Wenn Lipidextrakte bei -80 °C platziert wurden, langsam auf Raumtemperatur bringen, indem Sie auf Eis und anschließend auf einer Tischplatte inkubieren. Lösungsmittel aus Lipidextrakten durch Vakuumtrocknung oder unter Verwendung eines sanften Inertgasstroms (z. B. Argon oder Stickstoff) vollständig verdampfen. In der Zwischenzeit einen Backofen auf 145 °C vorheizen, um die TLC-Platte zu erhitzen.
2. Bevor Proben auf die TLC-Platte geladen werden können, bestimmen Sie die relativen Mengen an Radiomarkierung, die von den Zellen aufgenommen werden. 10 μL des gesamten Zelllysats aus Schritt 2.2 in eine 6 mL Glasszintillationsfläschchen pipetten, 6 ml Szintillationsflüssigkeit hinzufügen und Fläschchen in ein Rack legen. Verwenden Sie einen Szintillationszähler, um den cpm oder dpm jeder Probe mit der Option count single rack zu messen, die auf eine Zählzeit von 1 minute eingestellt ist. Messen Sie jedes ganze Zelllysat in doppelter Ausfertigung, um einen Durchschnitt für jede Probe zu erhalten. Passen Sie die Lademenge entsprechend einem Wildtyp oder einer Referenzprobe an
   HINWEIS: Die Menge jeder Probe, die auf die TLC-Platte geladen werden soll, kann mit der folgenden Gleichung bestimmt werden: (durchschnittliche Probenanzahl)/(durchschnittliche Referenzanzahl) x gewünschtes Ladevolumen. Wenn beispielsweise 20 μL der Referenzprobe auf die TLC-Platte geladen werden sollen und eine durchschnittliche Anzahl von 1.000 aufwies, dann werden in einer experimentellen Probe mit einer durchschnittlichen Anzahl von 2.000 10 μL auf die TLC-Platte geladen.
3. Rekonstituieren Sie die Probenlipide in 40-50 μL von 1:1 (v/v%) Chloroform:Methanol durch Wirbeln für 5 min. Bereiten Sie 101 ml des mobilen Phasenlösungsmittels in einem Glasmesszylinder vor (siehe Abschnitt Repräsentative Ergebnisse für ein Beispiel für eine Trennung der wichtigsten NL-Spezies durch ein 50:40:10:1 (v/v/v/v%) Hexan:Petrolether:Diethylether:Essigsäurelösungsmittel).
4. Gießen Sie das Lösungsmittel in eine TLC-Glaskammer, die ein 20 x 20 TLC-Sättigungspad und einen eng anliegenden Deckel enthält. Bereiten Sie eine kanalierte 20 x 20 Kieselgel 60 G Platte vor, indem Sie vorsichtig eine Linie 1,5 cm über dem Boden der Platte mit einem Bleistift markieren. Die Linie bezeichnet den Ursprung und wo die Lipide geladen werden. Beschriften Sie unterhalb der Linie vorsichtig die Probe, die in jeder Spur geladen wird. Sobald die TLC-Platte vorbereitet wurde, inkubieren Sie die Platte in einem 145 °C-Ofen für mindestens 30 Minuten, um die Platte vorzuwärmen und überschüssige Feuchtigkeit zu entfernen.
5. Sobald die Platte ausreichend erhitzt wurde und das TLC-Sättigungspad mit Lösungsmittel gesättigt ist, entfernen Sie die TLC-Platte aus dem Ofen und fahren Sie sofort mit dem Laden der TLC-Platte fort. Das Beladen der Platte während des Warms sorgt für eine schnelle Lösungsmittelverdampfung. Laden Sie für jede Lipidart von Interesse 5-20 μg eines gereinigten Lipidstandards auf eine Spur der TLC-Platte, um die Trennung und den erwarteten Migrationsabstand zu verfolgen. Mit einer Pipette können Sie 5 μL Der Probe auf den Ursprung jeder Spur stellen, die sich 1,5 cm über dem Boden der TLC-Platte befindet. Wiederholtes Laden von 5 μL-Spots, bis 20-40 μL Probe in jede Spur geladen wurden.
   HINWEIS: 5-20 μg unmarkierte gereinigte Lipide können jeder Probenspur als Tracer zugesetzt werden, die nach TLC-Trennung von Lipiden gefärbt und visualisiert werden können. Das Vorhandensein eines gefärbten Standards ermöglicht eine einfache Verfolgung und Exzision von radioaktiv markierten Lipidbändern für die anschließende Szintillationszählung. Welche gereinigten Standards auf die Platte geladen werden, wird von der interessierenden NL-Spezies bestimmt. Im Abschnitt Repräsentatives Ergebnis finden Sie Beispiele für die Trennung von Ölsäure (FFA), 1,2 Dioleoylglycerin (DG), Triolein (TG), Cholesterin (Chol), Cholesteryl-Linoleat (SE) und Squalen in Bahnen neben den Probenbahnen.
6. Sobald die Standard- und die Experimentellen proben geladen wurden, legen Sie die Platte in die Entwicklungskammer und warten Sie, bis das Lösungsmittel die Oberseite der Platte erreicht hat (40-60 min). Sobald die Platte vollständig entwickelt ist, entfernen Sie sie aus der Kammer und lassen Sie sie 20 Minuten im Abzug trocknen.
7. Nachdem die Platte getrocknet ist, bedecken Sie sie mit Kunststofffolie und legen Sie sie in eine Entwicklungskassette mit einem Autoradiographie-Bildschirm. Lassen Sie die Platte mit dem Bildschirm für 24-48 h entwickeln.

4. Visualisierung und Quantifizierung von TLC-getrennten Lipiden

1. Entfernen Sie den Bildschirm von der Entwicklungskassette und legen Sie ihn in einen Phosphor-Imager. Wählen Sie die Option Phosphor Imaging und entwickeln Sie bei 800-1000 V.
   HINWEIS: Die Phosphorbildgebung bietet eine qualitative Ansicht der radioaktiv markierten Lipide auf der TLC-Platte. Die Quantifizierung radioaktiv markierter Lipide erfolgt jedoch am besten durch Szintillationszählung, die anschließend beschrieben wird.
2. 100 ml p-Anisaldehyd-Reagenz mischen (siehe Ergänzungsdatei)und in einer Glassprühflasche abfüllen. Besprühen Sie die TLC-Platte mit p-Anisaldehyd-Reagenz, bis die Kieselsäure gesättigt ist. Backen Sie den Teller in einem 145 °C Ofen für 5 min, oder bis Bänder erschienen sind.
3. Um einzelne Lipidspezies mit Hilfe der Radiolabel-Szintillationszählung zu quantifizieren, verwenden Sie eine Rasierklinge, um das Kieselgel von der Glas-TLC-Platte abzukratzen. Übertragen Sie jedes Kieselgelband, das einer einzelnen radioaktiv markierten Lipidspezies entspricht, in eine Glasszintillationsfläschchen und fügen Sie 6 ml Szintillationsflüssigkeit hinzu. Wirbeln Sie kräftig, bis das Kieselsäureband auf kleine Stücke reduziert wurde.
   1. Alternativ können Lipide aus dem Kieselgelband mit dem Lipidextraktionsprotokoll in Abschnitt 3 extrahiert werden. Wenn Lipide aus dem Kieselgel extrahiert werden, verdampfen Sie das Lösungsmittel vollständig wie in Schritt 3.1 und fügen Sie den getrockneten Lipiden 6 mL Szintillationsflüssigkeit hinzu. Legen Sie das Rack mit den Szintillationsfläschchen in einen Szintillationszähler. Wählen Sie die Option Einzelrack zählen und passen Sie die Zählzeit auf 2 Minuten pro Durchstechflasche an. Die Ergebnisse des Szintillationszählers werden gedruckt und können als Balkendiagramm visualisiert werden.

Ergebnisse

In diesem Protokoll haben wir gezeigt, dass die Markierung, Detektion und Quantifizierung von NL-Spezies durch ¹⁴C-Essigsäure-Stoffwechselmarkierung erreicht werden kann. Wichtige NL-Spezies können in einem Lösungsmittelsystem von 50:40:10:1 (v/v/v/v%) Hexan:Petrolether:Diethylether:Essigsäure(Abbildung 1A,B)getrennt werden. Die Phosphorbildgebung ermöglicht die Visualisierung von markierten freien Fettsäuren (FFA), Triacylglycerin (TG), Diacylglycerin (DG),...

Diskussion

Hier wird ein vielseitiges Radiolabeling-Protokoll zur quantitativen Überwachung der Synthese von NL-Arten in Hefe vorgestellt. Dieses Protokoll ist sehr modular aufgebaut, so dass das Verfahren innerhalb von 3-6 Tagen abgeschlossen werden kann. Darüber hinaus gibt es eine Fülle von Literatur über die Verwendung von TLC zur Trennung von Lipidspezies und Metaboliten, die es dem Benutzer ermöglichen sollte, mehrere Lipidspezies von Interesse mit einem einfachen Wechsel der TLC-Lösungsmittelsysteme nachzuweisen

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
[1-C14] Acetic acid sodium salt specific activity: 45-60mCi	PerkinElmer	NEC084H001MC
18:1 1,2 dioleoyl-sn-glycerol	Avanti	800811O
200 proof absolute ethanol	Sigma	459836
Acid washed glass beads 425-600um	Sigma	G8772
Amber bulbs for Pastuer pipettes	Fisher	03-448-24
Ammonium Sulfate >99%	Sigma	A4418
Beckman LS6500 scintillation counter	PerkinElmer	A481000
Chloroform (HPLC grade)	Fisher	C607SK
Cholesterol >99%	Sigma	C8667
Cholesteryl-linoleate >98%	Sigma	C0289
Concentrated sulfuric acid	Sigma	339741
Corning 50mL conical tubes, polypropylene with centristar cap	Sigma	CLS430829
Dextrose, anhydrous grade	Sigma	D9434
Diethyl ether anhydrous grade	Sigma	296082
Drying oven	Fisher	11-475-155
EcoLume scintillation liquid	VWR	IC88247001
Eppendorf 5424R centrifuge	Fisher	05-401-205
GE Storage phosphor screen	Sigma	GE28-9564-75
GE Typhoon FLA9500 imager
Glacial acetic acid, ACS grade	Sigma	695092
Glass 6mL scintillation vials	Sigma	M1901
Glass centrifuge tube caps	Fisher	14-595-36A
Glass centrifuge tubes	Fisher	14-595-35A
Glass Pasteur pipette	Fisher	13-678-20C
Hexane, anhydrous grade	Sigma	296090
L-Adenine >99%	Sigma	A8626
L-Alanine >98%	Sigma	A7627
L-Arginine >99%	Sigma	A1270000
L-Asparagine >98%	Sigma	A0884
L-Aspartate >98%	Sigma	A9256
L-Cysteine >97%	Sigma	W326305
L-Glutamic acid monosodium salt monohydrate >98%	Sigma	49621
L-Glutamine >99%	Sigma	G3126
L-Glycine >99%	Sigma	G8898
L-Histidine >99%	Sigma	H8000
L-Isoleucine >98%	Sigma	I2752
L-Leucine >98%	Sigma	L8000
L-Lysine >98%	Sigma	L5501
L-Methionine, HPLC grade	Sigma	M9625
L-Phenylalanine, reagent grade	Sigma	P2126
L-Proline >99%	Sigma	P0380
L-Serine >99%	Sigma	S4500
L-Theronine, reagent grade	Sigma	T8625
L-Tryptophan >98%	Sigma	T0254
L-Tyrosine >98%	Sigma	T3754
L-Uracil >99%	Sigma	U0750
L-Valine >98%	Sigma	V0500
Methanol, ACS grade	Fisher	A412
Oleic acid >99%	Sigma	O1008
p-anisaldehyde	Sigma	A88107
Petroleum ether, ACS grade	Sigma	184519
Phosphatidylcholine, dipalmitoyl >99%	Sigma	P1652
Pipettes	Eppendorf	2231000713
Potassium chloride, ACS grade	Sigma	P3911
Sodium Hydroxide pellets, certified ACS	Fisher	S318-100
Squalene >98%	Sigma	S3626
Succinic Acid crystalline/certified	Fisher	110-15-6
TLC saturation pad	Sigma	Z265225
TLC silica gel 60G glass channeled plate	Fisher	NC9825743	No fluorescent indicators
Transparency plastic film	Apollo	829903
Tricine	Sigma	T0377
Triolein >99%	Sigma	T7140
Vortex mixer	Fisher	02-215-414
Whatman exposure cassette	Sigma	WHA29175523
Yeast nitrogen base without ammonium sulfate and amino acids	Sigma	Y1251