Анализ синтеза нейтральных липидов в Saccharomyces cerevisiae методом метаболической маркировки и тонкослойной хроматографии

Резюме

Здесь представлен протокол метаболической маркировки дрожжей ¹⁴С-уксусной кислотой, которая сочетается с тонкослойной хроматографией для разделения нейтральных липидов.

Аннотация

Нейтральные липиды (DL) представляют собой класс гидрофобных, незарядующих биомолекул, которые играют ключевую роль в энергетическом и липидном гомеостазе. DL синтезируются de novo из ацетил-КоА и в основном присутствуют у эукариот в виде триглицеридов (ТГ) и стерол-эфиров (ЭС). Ферменты, ответственные за синтез DL, высоко сохраняются от Saccharomyces cerevisiae (дрожжей) до человека, что делает дрожжи полезным модельным организмом для препарирования функции и регуляции ферментов метаболизма NL. Хотя многое известно о том, как ацетил-КоА превращается в разнообразный набор видов NL, механизмы регулирования ферментов метаболизма NL и как неправильная регуляция может способствовать клеточным патологиям, все еще обнаруживаются. Многочисленные методы выделения и характеристики видов NL были разработаны и использованы в течение десятилетий исследований; однако количественный и простой протокол для всеобъемлющей характеристики основных видов НЛ не обсуждался. Здесь представлен простой и адаптируемый метод количественной оценки de novo синтеза основных видов NL в дрожжах. Мы применяем метаболическую маркировку ¹⁴С-уксусной кислоты в сочетании с тонкослойной хроматографией для разделения и количественной оценки разнообразного диапазона физиологически важных DL. Кроме того, этот метод может быть легко применен для изучения скорости реакции in vivo ферментов NL или деградации видов NL с течением времени.

Введение

Ацетил-КоА является фундаментальным строительным блоком различных биомолекул, включая нейтральные липиды (DL), которые служат универсальной биомолекулярной валютой для построения мембран, генерации АТФ и регулирования клеточной сигнализации^1,2. Доступность НГ для шунтации в любой из этих соответствующих путей частично регулируется их хранением. Липидные капли (ЛД), цитоплазматические органеллы, состоящие из гидрофобных ядер триглицеридов (ТГ) и эфиров стеролов (ЭС), являются основными хранилищами большинства клеточных НГ. Таким образом, ЛД изолируют и регулируют DL, которые могут быть деградированы и впоследствии использованы для биохимических и метаболических процессов^3,4. Известно, что неправильная регуляция NL и LD-ассоциированных белков коррелирует с возникновением патологий, включая липодистрофию и метаболические синдромы^5,6. Из-за этого текущие исследования LD интенсивно сосредоточены на том, как синтез NL регулируется пространственно, временно и через различные ткани многоклеточных организмов. Из-за вездесущих клеточных ролей для DL многие ферменты, ответственные за синтез и регуляцию DL, сохраняются во всех эукариотах^7. Действительно, даже некоторые прокариоты хранят DL в ЛД^8. Поэтому генетически податливые модельные организмы, такие как Saccharomyces cerevisiae (почковые дрожжи), были полезны для изучения синтеза и регуляции NL.

Отделение и количественная оценка DL от клеточных экстрактов могут быть выполнены множеством способов, включая газовую хроматографию-масс-спектрометрию (GC-MS), высокоэффективную жидкостную хроматографию (ВЭЖХ) и сверхэффективную жидкостную хроматографию-масс-спектрометрию (UPLC-MS)^9,10,11. Возможно, самым простым методом разделения DL является тонкослойная хроматография (TLC), которая позволяет проводить последующую денситометрическую количественную оценку из стандартной кривой^12,13. Хотя TLC обеспечивает только последовательное разделение DL, он остается мощным методом, поскольку он недорог и позволяет быстро отделить DL от нескольких образцов одновременно. Двумя наиболее значительными проблемами, стоящими перед изучением НЯ с помощью TLC, являются: 1) широкий диапазон клеточных обилий видов NL и их промежуточных продуктов и 2) диапазон гидрофильности/гидрофобности липидных промежуточных продуктов в путях синтеза NL. Следовательно, количественная оценка видов NL с помощью TLC обычно ограничивается наиболее распространенными видами; однако введение радиомарки ¹⁴С-уксусной кислоты может значительно улучшить обнаружение промежуточных продуктов с низкой плотностью в путях NL. Уксусная кислота быстро превращается в ацетил-КоА с помощью ацетил-КоА-синтетазы ACS2^14,что делает ¹⁴С-уксусную кислоту подходящим субстратом для радиомаркировки в дрожжах^15. Кроме того, разделение как гидрофобных НЯ, так и гидрофильных промежуточных продуктов ЛЛ может быть достигнуто С помощью TLC путем использования нескольких систем растворителей^16. Здесь представлен метод разделения НГ с использованием метаболической маркировки ¹⁴С-уксусной кислоты в дрожжах. Липиды, меченные в течение импульсного периода, впоследствии выделяются хорошо заядлым протоколом¹⁷полной выделения липидов с последующим разделением видов NL по TLC. Разработка пластин TLC с помощью как авторедиографии для визуализации меченых липидов, так и химического спрея для визуализации общего количества липидов позволяет использовать несколько методов количественной оценки. Отдельные липидные полосы также могут быть легко извлечены из пластины TLC с помощью лезвия бритвы, а сцинтилляционный подсчет может быть использован для количественной оценки количества радиомаркированного материала в полосе.

протокол

1. Рост и маркировка дрожжевых клеток ¹⁴С-уксусной кислотой

1. Инокулируют культуру дрожжей, выбирая колонию из тарелки и распределяя ее в 20 мл синтетических полных (SC) сред, содержащих 2% декстрозы (см. Дополнительный файл для рецепта SC среды). Инкубировать при 30 °C на ночь с встряхиванием при 200 об/мин.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Состояние роста, объем образца и обработка будут отличаться в зависимости от интересующих липидов. Перед проведением полноценных экспериментов необходимо эмпирически определить оптимальные условия роста и объемы культуры. В этом протоколе обсуждается радиомаркировка дрожжевых культур, выращенных до стационарной фазы, фазы роста, когда биомембранный и клеточный рост замедляется, а синтез NL очень активен.
2. Измерьте OD₆₀₀ ночной культуры с помощью спектрофотометра и разбавьте культуру дрожжевых клеток до конечного OD₆₀₀ 0,2 в 50 мл свежих сред SC, содержащих 2% декстрозы. Выращивайте клетки в течение 24 ч или до тех пор, пока они не достигнут стационарной фазы (которая обычно определяется плоской оболочкой измерения удвоения ячейки OD_600).
3. Перед сбором ячеек составьте буфер закалки (подробнее см. в разделе Дополнительный файл). Сделайте две аликвоты 20 мл закалочного буфера для каждого образца (т.е. буфер закалки 40 мл для каждого образца) и разделите равномерно на две конические пробирки по 50 мл). Храните аликвоты закалки буфера при -80 °C для будущего использования.
4. Как только культуры достигнут желаемой ОД или фазы роста, соберите клетки путем центрифугирования при 4 100 х г в течение 10 мин. Пока образцы находятся в центрифуге, готовят радиомаркирующую муляжную жиму путем добавления^[1-14С] натриевой соли уксусной кислоты в свободные от декстрозы среды SC при конечной концентрации 10 мкКи/мл.
   ВНИМАНИЕ: При работе с радиоактивными материалами следует носить надлежащие средства индивидуальной защиты (СИЗ) все время. Всегда следуйте местным рекомендациям по надлежащему хранению, использованию и захоронению радиоактивных материалов.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Как концентрация ¹⁴С-уксусной кислоты в маркировочной среде, так и время инкубации радиомаркировки должны быть скорректированы в соответствии с метаболитом (метаболитами), представляющим интерес. Здесь используется 20-минутная импульсная инкубация радиомаркировки, что достаточно для маркировки видов NL с диапазоном численности.
5. Удалите супернатант из гранулированных клеток и промыть гранулу ячейки один раз 20 мл среды SC без декстрозы путем повторного использования гранулы с пипеткой. Соберите клетки снова путем центрифугирования при 4 100 х г в течение 5 мин.
6. Повторно суспендировать клетки в 1 мл среды SC без декстрозы и перенести клетки в меченую микроцентрифужную трубку 2 мл. Соберите клетки снова путем центрифугирования при 4 100 х г в течение 2 мин.
7. Повторное суспендировать клетки еще раз в 500 мкл среды SC без декстрозы. Предварительно охладите центрифугу, рассчитанную на конические трубки по 50 мл до -10 °C или при минимальной температуре.
8. Начните период радиомаркировки с быстрого добавления 500 мкл радиомаркировки к каждому 500 мкл клеточной суспензии (конечная концентрация ¹⁴С-уксусной кислоты = 5 мкКи/мл). Инкубировать трубки во вращающемся инкубаторе при 30 °C в течение 20 мин. 2 мин до окончания периода маркировки, перенести одну аликвоту закалочного буфера объемом 20 мл на каждый образец из морозильной камеры -80 °C в ведро льда
9. Как только период радиомаркировки закончится, используйте пипетку, чтобы погрузить весь образец объемом 1 мл в 20 мл буфера холодного закалки. Вихрьте конические трубки в течение 5-10 с, чтобы убедиться, что образец был тщательно перемешан с буфером закалки. Инкубировать образцы в закалке буфера в течение 2 мин на льду.
10. Соберите гранулу ячейки, вращая в центрифуге при 5000 х г в течение 3 мин, установленных на -10 °C или при самых низких температурных настройках. Пока пробоотборники вращаются, перенесите другой набор закалочной буферной аликвоты из морозильной камеры -80 °C в ведро, заполненное льдом (т.е. одну 20 мл пробирку закалочного буфера на образец).
11. Удалите супернатант закалочного буфера из гранул ячейки и замените его 20 мл свежим, холодным, закалочным буфером. Вихрь и встряхивайте образцы до тех пор, пока гранула не будет смещена со дна конической трубки и полностью повторно суспендирована в закалочном буфере. Центрифугирование образцов снова при 5000 х г в течение 3 мин при -10 °C для сбора клеток.
12. После того, как клетки гранулированы, тщательно удалите весь закалочный буфер из образцов, выливая супернатант и удаляя излишки пипеткой. Храните тубы при -80 °C для дальнейшей обработки.

2. Выделение общих липидов из дрожжей

ПРИМЕЧАНИЕ: Следующий протокол выделения липидов основан на хорошо заявленный и часто используемый метод, который эффективно извлекает большинство нейтральных липидных видов^17,18.
ВНИМАНИЕ: При использовании органического растворителя всегда носите соответствующие СИЗ и работайте внутри вытяжки, когда это возможно. Во время экстракции липидов избегайте использования пластмасс, несовместимых с органическими растворителями. Полипропиленовые трубки подходят для следующего протокола.

1. Взвесьте 0,3 г вымытых кислотой стеклянных шариков для каждого образца и храните их в микроцентрифужных пробирках по 2 мл на льду. Извлеките гранулы клеток из морозильной камеры при -80 °C и держите их на льду. Добавляйте 350 мкл метанола и 700 мкл хлороформа в каждый образец, повторно суспендировать и переносить в микроцентрифужные трубки, содержащие предварительно взвешенные стеклянные шарики.
2. Разжижают клетки путем перемешивания трубок на вихре 3x в течение 1 мин, с 30 с инкубациями на льду между перемешиваниями. Альтернативно, клетки могут быть лизированы с использованием мини-бисера-избивателя в течение трех 1-минутных циклов. Сохраните 25-30 мкл лизалица целых клеток в отдельной пробирке для сцинтилляции.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Сохраненный лисат будет использоваться для определения относительного количества радиоизотопа, захваченного каждым образцом в течение импульсного периода, что будет влиять на количество каждого образца, загруженного на пластину TLC. Этот вопрос рассматривается далее на этапе 3.2.
3. Перелейте все содержимое трубки микроцентрифуги объемом 2 мл в стеклянную центрифужную трубку объемом 15 мл [трубка А]. Промыть трубки микроцентрифуги 2 мл, добавив 1 мл метанола и вихрь в течение 10-15 с. Переложите промывку метанола объемом 1 мл в пробирку А и добавьте 2 мл хлороформа в пробирку А, а затем 400 мкл воды для окончательного объема образца 4,45 мл.
4. Вихревые образцы в течение 1 мин с последующим 5-минутным центрифугированием при 1000 х г. После центрифугирования водные (верхняя) и органическая (нижняя) фазы должны быть четко визуально разделены клеточным мусором, лежащим на границе раздела.
5. Используя стеклянную пипетку Пастера, соберите органическую фазу из трубки А и перейдите к новой стеклянной центрифужной трубке емкостью 15 мл (трубка В). Добавьте 1 мл 1 мл KCl в трубку B. В пробирку А добавляют 1 мл метанола и 2 мл хлороформа, а также 200 мкл воды MiliQ. Повторите этапы вихрей и центрифугирования на трубке А.
6. Еще раз соберите органическую фазу из трубки А и добавьте ее в трубку Б. Утилизируйте трубку А в соответствующем контейнере. Вихревая трубка B в течение 1 мин с последующей 5-минутной центрифугированием при 1000 х г.
7. Снимите верхний водный слой с трубки В и утилизируйте. Добавьте 1 мл свежего 1 M KCl обратно в трубку B и повторите этап вихря/центрифугирования. После того, как слои разделены, тщательно соберите весь нижний органический слой в помеченный стеклянный флакон объемом 4 мл.
   ПРИМЕЧАНИЕ: На этом этапе липидные экстракты могут храниться при -80 °C, или протокол может быть продолжен для разделения липидов TLC.

3. Разделение и количественная оценка радиоизотопных меченых НГ с помощью тонкослойной хроматографии

1. Если липидные экстракты помещали при -80 °C, медленно доводят до комнатной температуры путем инкубации на льду и впоследствии на столешнице. Полностью испарить растворитель из липидных экстрактов вакуумной сушкой или с помощью мягкого потока инертного газа (например, аргона или азота). Между тем, предварительно нагрейте духовку до 145 °C для нагрева пластины TLC.
2. Прежде чем образцы могут быть загружены на пластину TLC, определите относительное количество радиомеблоки, захваченных клетками. Пипетка 10 мкл всего клеточного лисата со ступени 2.2 в стеклянный сцинтилляционный флакон 6 мл, добавляют 6 мл сцинтилляционной жидкости и помещают флаконы в стойку. Используйте сцинтилляционный счетчик для измерения cpm или dpm каждого образца с помощью параметра count single rack, установленного на время подсчета 1 мин. Измерьте каждый целостный листат клетки в двух экземплярах, чтобы получить среднее значение для каждого образца. Настройка величины загрузки в соответствии с диким типом или эталонным образцом
   ПРИМЕЧАНИЕ: Количество каждого образца для загрузки на пластину TLC может быть определено с использованием следующего уравнения: (среднее количество выборок)/(среднее количество ссылок) x желаемый объем загрузки. Например, если 20 мкл эталонного образца должно быть загружено на пластину TLC и имеет среднее количество 1000, то экспериментальный образец со средним количеством 2000 будет иметь 10 мкл, загруженный на пластину TLC.
3. Восстановить образец липидов в 40-50 мкл 1:1 (v/v%) хлороформ:метанол путем вихря в течение 5 мин. Приготовьте 101 мл растворителя подвижной фазы в стеклянном градуированном цилиндре (см. раздел «Репрезентативные результаты» для примера разделения основных видов NL на 50:40:10:1 (v/v/v/v%) Гексан:Нефтяной эфир:Диэтиловый эфир:Растворитель уксусной кислоты).
4. Налейте растворитель в стеклянную камеру TLC, содержащую прокладку для насыщения 20 x 20 TLC и плотно прилегающую крышку. Подготовьте канальный кремнезем 20 x 20 силикагеля 60 г, аккуратно обозначив карандашом линию на 1,5 см выше нижней части пластины. Линия обозначает происхождение и место, куда будут загружаться липиды. Ниже линии аккуратно обозначьте образец, который будет загружен в каждую полосу. После того, как пластина TLC будет предварительно подготовка, инкубировать пластину в духовке с температурой 145 °C в течение не менее 30 минут, чтобы предварительно нагреть пластину и удалить лишнюю влагу.
5. После того, как пластина будет достаточно нагрета, а прокладка для насыщения TLC насытится растворителем, снимите пластину TLC из печи и немедленно приступайте к загрузке пластины TLC. Загрузка пластины в тепле обеспечивает быстрое испарение растворителя. Для каждого интересуемого вида липидов загрузите 5-20 мкг очищенного липидного стандарта на полосу пластины TLC для отслеживания разделения и ожидаемого расстояния миграции. Используя пипетку, нанесите 5 мкл образца на начало каждой полосы, расположенной на 1,5 см выше нижней части пластины TLC. Повторная загрузка пятен по 5 мкл до тех пор, пока в каждую полосу не будет загружено 20-40 мкл образца.
   ПРИМЕЧАНИЕ: 5-20 мкг немаркированных очищенных липидов могут быть добавлены к каждой полосе образца в качестве индикаторов, которые могут быть окрашены и визуализированы после разделения липидов TLC. Наличие окрашенного стандарта позволяет легко отслеживать и иссекать радиомаркированные липидные полосы для последующего сцинтилляционного подсчета. Какие очищенные стандарты загружаются на пластину, будет определяться интересующих NL видами. В разделе «Репрезентативный результат» приведены примеры разделения олеиновой кислоты (FFA), 1,2 диолеоилглицерина (DG), триолеина (TG), холестерина (Chol), холестерина (Chol), холестерина-линолеата (SE) и сквалена в полосах, прилегающих к полосам отбора проб.
6. После загрузки стандартного и экспериментального образцов поместите пластину в развивающуюся камеру и подождите, пока растворитель не достигнет верхней части пластины (40-60 мин). Как только пластина будет полностью разработана, извлеките ее из камеры и дайте ей высохнуть в вытяжном вытяжке в течение 20 минут.
7. После того, как пластина высохнет, накройте ее полиэтиленовой пленкой и поместите в развивающуюся кассету с экраном для авторерадиографии. Дайте пластине развиваться вместе с экраном в течение 24-48 ч.

4. Визуализация и количественная оценка разделенных TLC липидов

1. Снимите экран с развивающейся кассеты и поместите внутрь люминофорного изобразителя. Выберите опцию Phosphor Imaging и развивайте при 800-1000 В.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Люминофорная визуализация дает качественный вид радиомаркированных липидов на пластине TLC. Однако количественная оценка радиомаркированных липидов лучше всего осуществляется сцинтилляционным подсчетом, который описывается ниже.
2. Смешайте 100 мл реагента п-анизальдегида (см. Дополнительный файл)и положите в стеклянный баллончик. Опрыскивайте пластину TLC реагентом p-анисальдегида до тех пор, пока кремнезем не насытится. Выпекайте тарелку в духовке при 145 °C в течение 5 минут или до появления полос.
3. Для количественной оценки отдельных видов липидов с помощью сцинтилляции радиомарки, используйте лезвие бритвы, чтобы соскоблить силикагель со стеклянной пластины TLC. Перенесите каждую полосу силикагеля, соответствующую одному радиомаркированному липидному виду, в стеклянный сцинтилляционный флакон и добавьте 6 мл сцинтилляционной жидкости. Энергично вихряйте до тех пор, пока кремнеземная полоса не будет уменьшена до мелких кусочков.
   1. Альтернативно, липиды могут быть извлечены из силикагелевой полосы с использованием протокола экстракции липидов в разделе 3. Если липиды экстрагируются из силикагеля, испарите растворитель полностью, как на этапе 3.1, и добавьте 6 мл сцинтилляционной жидкости к высушенным липидам. Поместите стойку со сцинтилляционными флаконами в сцинтилляционный счетчик. Выберите опцию «Подсчитывать одну стойку» и отрегулируйте время подсчета до 2 минут на флакон. Результаты сцинтилляции счетчика будут напечатаны и могут быть визуализированы в виде гистограммы.

Результаты

В этом протоколе мы продемонстрировали, что маркировка, обнаружение и количественная оценка видов NL могут быть выполнены путем метаболической маркировки ¹⁴С-уксусной кислоты. Основные виды NL могут быть разделены в системе растворителей 50:40:10:1 (v/v/v/v%) Гексан:Нефтяной эфир:Диэтиловы...

Обсуждение

Здесь представлен универсальный протокол радиомаркировки для количественного мониторинга синтеза видов NL в дрожжах. Этот протокол очень модульный, что позволяет закончить процедуру в течение 3-6 дней. Кроме того, существует множество литературы по использованию TLC для разделения липи?...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
[1-C14] Acetic acid sodium salt specific activity: 45-60mCi	PerkinElmer	NEC084H001MC
18:1 1,2 dioleoyl-sn-glycerol	Avanti	800811O
200 proof absolute ethanol	Sigma	459836
Acid washed glass beads 425-600um	Sigma	G8772
Amber bulbs for Pastuer pipettes	Fisher	03-448-24
Ammonium Sulfate >99%	Sigma	A4418
Beckman LS6500 scintillation counter	PerkinElmer	A481000
Chloroform (HPLC grade)	Fisher	C607SK
Cholesterol >99%	Sigma	C8667
Cholesteryl-linoleate >98%	Sigma	C0289
Concentrated sulfuric acid	Sigma	339741
Corning 50mL conical tubes, polypropylene with centristar cap	Sigma	CLS430829
Dextrose, anhydrous grade	Sigma	D9434
Diethyl ether anhydrous grade	Sigma	296082
Drying oven	Fisher	11-475-155
EcoLume scintillation liquid	VWR	IC88247001
Eppendorf 5424R centrifuge	Fisher	05-401-205
GE Storage phosphor screen	Sigma	GE28-9564-75
GE Typhoon FLA9500 imager
Glacial acetic acid, ACS grade	Sigma	695092
Glass 6mL scintillation vials	Sigma	M1901
Glass centrifuge tube caps	Fisher	14-595-36A
Glass centrifuge tubes	Fisher	14-595-35A
Glass Pasteur pipette	Fisher	13-678-20C
Hexane, anhydrous grade	Sigma	296090
L-Adenine >99%	Sigma	A8626
L-Alanine >98%	Sigma	A7627
L-Arginine >99%	Sigma	A1270000
L-Asparagine >98%	Sigma	A0884
L-Aspartate >98%	Sigma	A9256
L-Cysteine >97%	Sigma	W326305
L-Glutamic acid monosodium salt monohydrate >98%	Sigma	49621
L-Glutamine >99%	Sigma	G3126
L-Glycine >99%	Sigma	G8898
L-Histidine >99%	Sigma	H8000
L-Isoleucine >98%	Sigma	I2752
L-Leucine >98%	Sigma	L8000
L-Lysine >98%	Sigma	L5501
L-Methionine, HPLC grade	Sigma	M9625
L-Phenylalanine, reagent grade	Sigma	P2126
L-Proline >99%	Sigma	P0380
L-Serine >99%	Sigma	S4500
L-Theronine, reagent grade	Sigma	T8625
L-Tryptophan >98%	Sigma	T0254
L-Tyrosine >98%	Sigma	T3754
L-Uracil >99%	Sigma	U0750
L-Valine >98%	Sigma	V0500
Methanol, ACS grade	Fisher	A412
Oleic acid >99%	Sigma	O1008
p-anisaldehyde	Sigma	A88107
Petroleum ether, ACS grade	Sigma	184519
Phosphatidylcholine, dipalmitoyl >99%	Sigma	P1652
Pipettes	Eppendorf	2231000713
Potassium chloride, ACS grade	Sigma	P3911
Sodium Hydroxide pellets, certified ACS	Fisher	S318-100
Squalene >98%	Sigma	S3626
Succinic Acid crystalline/certified	Fisher	110-15-6
TLC saturation pad	Sigma	Z265225
TLC silica gel 60G glass channeled plate	Fisher	NC9825743	No fluorescent indicators
Transparency plastic film	Apollo	829903
Tricine	Sigma	T0377
Triolein >99%	Sigma	T7140
Vortex mixer	Fisher	02-215-414
Whatman exposure cassette	Sigma	WHA29175523
Yeast nitrogen base without ammonium sulfate and amino acids	Sigma	Y1251