Análise da Síntese Lipídica Neutra em Saccharomyces cerevisiae por Rotulagem Metabólica e Cromatografia de Camada Fina

Resumo

Aqui, é apresentado um protocolo para a rotulagem metabólica da levedura com ^{ácido acético de 14}C, que é acoplado à cromatografia de camada fina para a separação de lipídios neutros.

Resumo

Lipídios neutros (NLs) são uma classe de biomoléculas hidrofóbicas e sem carga que desempenham papéis-chave na energia e homeostase lipídica. Os NLs são sintetizados de novo a partir de acetil-CoA e estão principalmente presentes em eucariotes na forma de triglicérides (TGs) e esterol-ésteres (SEs). As enzimas responsáveis pela síntese de NLs são altamente conservadas de Saccharomyces cerevisiae (levedura) para humanos, tornando a levedura um organismo modelo útil para dissecar a função e regulação das enzimas do metabolismo NL. Embora se saiba muito sobre como o acetil-CoA é convertido em um conjunto diversificado de espécies NL, mecanismos para regular enzimas do metabolismo NL, e como a regulação errada pode contribuir para patologias celulares, ainda estão sendo descobertos. Inúmeros métodos de isolamento e caracterização de espécies de NL foram desenvolvidos e utilizados ao longo de décadas de pesquisa; no entanto, um protocolo quantitativo e simples para a caracterização abrangente das principais espécies de NL não foi discutido. Aqui, é apresentado um método simples e adaptável para quantificar a síntese de nova das principais espécies de LN na levedura. Aplicamos ¹⁴rotulagem metabólica de ácido acético C juntamente com cromatografia de camada fina para separar e quantificar uma gama diversificada de NLs fisiologicamente importantes. Além disso, este método pode ser facilmente aplicado para estudar taxas de reação in vivo de enzimas NL ou degradação de espécies NL ao longo do tempo.

Introdução

Acetil-CoA é o bloco fundamental de construção de diversas biomoléculas, incluindo lipídios neutros (NLs), que servem como uma moeda biomolecular versátil para a construção de membranas, geração de ATP e regulação da sinalização celular^1,2. A disponibilidade de NLs a serem desviados para qualquer uma dessas respectivas vias é, em parte, regulada pelo seu armazenamento. Gotículas lipídicas (LDs), organelas citoplasmáticas compostas de núcleos hidrofóbicos de triglicérides (TGs) e esterol-ésteres (SEs), são os principais compartimentos de armazenamento da maioria dos NLs celulares. Sendo assim, os LDs sequeram e regulam as NLs, que podem ser degradadas e posteriormente utilizadas para processos bioquímicos e metabólicos^3,4. Sabe-se que a má regulação das proteínas associadas à NL e LD está correlacionada com o surgimento de patologias, incluindo lipodistrofia e síndromes metabólicas^5,6. Por causa disso, a pesquisa atual de LD está intensamente focada em como a síntese de NL é regulada espacialmente, temporalmente e através de tecidos distintos de organismos multicelulares. Devido aos papéis celulares onipresentes para as NLs, muitas enzimas responsáveis pela síntese e regulação das NLs são conservadas ao longo dos eucariotes⁷. De fato, até alguns procariotes armazenam NLs em LDs⁸. Portanto, organismos modelos geneticamente tratáveis, como saccharomyces cerevisiae (levedura brotante) têm sido úteis para o estudo da síntese e regulação da NL.

A separação e quantificação dos NLs dos extratos celulares pode ser realizada de uma infinidade de formas, incluindo espectrometria de massa cromatografia gasosa (GC-MS), cromatografia líquida de alto desempenho (HPLC) e espectrometria de massa líquida de ultra-desempenho (UPLC-MS)^9,10,11. Talvez o método mais simples para separar NLs seja através da cromatografia de camada fina (TLC), que permite quantificação densitométrica subsequente a partir de uma curva padrão^12,13. Embora o TLC forneça apenas uma separação de NLs em termos de curso, ela continua sendo uma técnica poderosa porque é barata, e permite a rápida separação de NLs de várias amostras simultaneamente. Dois dos desafios mais consideráveis enfrentados pelo estudo dos NLs via TLC são: 1) a ampla gama de abundâncias celulares de espécies NL e seus intermediários, e 2) a faixa de hidrofilicidade/hidrofobiidade de intermediários lipídicos dentro das vias de síntese da NL. Consequentemente, a quantificação das espécies de NL via TLC é tipicamente restrita às espécies mais abundantes; no entanto, a introdução de um rádio de ácido ¹⁴C-acético pode aumentar significativamente a detecção de intermediários de baixa abundância dentro de vias NL. O ácido acético é rapidamente convertido em acetil-CoA pelo acetil-CoA synthetase ACS2¹⁴, que faz do ácido ^{acético 14}C um substrato de radiolabeling adequado na levedura¹⁵. Além disso, a separação tanto de NLs hidrofóbicos quanto de intermediários hidrofílicos de NLs pode ser alcançada pela TLC através do uso de múltiplos sistemas de solventes¹⁶. Aqui, é apresentado um método para a separação de NLs usando rotulagem metabólica de ácido acético ^{de 14}C na levedura. Os lipídios rotulados durante o período de pulso são posteriormente isolados por um protocolo de isolamento lipíduo total bem estabelecido^17,seguido pela separação de espécies NL por TLC. O desenvolvimento de placas TLC tanto pela autoradiografia para visualizar lipídios rotulados, quanto um spray químico para visualizar lipídios totais, permite múltiplos métodos de quantificação. Bandas lipídicas individuais também podem ser facilmente extraídas da placa TLC usando uma lâmina de barbear, e a contagem de cintilação pode ser usada para quantificar a quantidade de material radiolabeled dentro da banda.

Protocolo

1. Crescimento e rotulagem de células de levedura com ^{ácido acético de 14}C

1. Inocular uma cultura de levedura, escolhendo uma colônia de um prato e distribuindo-a em 20 mL de mídia sintética completa (SC) contendo 2% de dextrose (ver Arquivo Suplementar para a receita de mídia SC). Incubar a 30 °C durante a noite com agitação a 200 rpm.
   NOTA: Condição de crescimento, volume amostral e tratamento diferem com base nos lipídios de interesse. Antes de realizar experimentos completos, as condições de crescimento ideais e os volumes de cultura devem ser empiricamente determinados. Este protocolo discute a rotulagem radiolabel de culturas de leveduras cultivadas em fase estacionária, uma fase de crescimento quando o crescimento da biomeia e células diminui, e a síntese de NL é muito ativa.
2. Meça o OD₆₀₀ da cultura durante a noite usando um espectrofotômetro e dilua a cultura celular de levedura para um OD₆₀₀ final de 0,2 em 50 mL de mídia SC fresca contendo 2% de dextrose. Cresça as células por 24 h, ou até que elas tenham atingido a fase estacionária (que é comumente definida por um revestimento plano da célula duplicando a medição de₆₀₀ OD).
3. Antes de coletar as células, faça o buffer de saciar (consulte Arquivo Suplementar para obter detalhes). Faça duas alíquotas de 20 mL de tampão de saciamento para cada amostra (ou seja, 40 mL que sacie tampão para cada amostra) e divida uniformemente em dois tubos cônicos de 50 mL). Armazene as alíquotas de tampão a -80 °C para uso futuro.
4. Uma vez que as culturas tenham atingido a fase de OD ou crescimento desejada, colete as células por centrifugação a 4.100 x g por 10 min. Enquanto as amostras estão na centrífuga, prepare a mídia de radiolabeling adicionando^[1-14C] sal de sódio ácido acético à mídia SC livre de dextrose em uma concentração final de 10 μCi/mL.
   ATENÇÃO: Os equipamentos de proteção individual adequados (EPI) devem ser usados o tempo todo quando se trabalha com materiais radioativos. Siga sempre as diretrizes locais para o armazenamento, uso e descarte adequados de materiais radioativos.
   NOTA: Tanto a concentração de ácido acético C de ¹⁴C na mídia de rotulagem quanto o tempo de incubação de radiolabeling devem ser ajustados de acordo com o metabólito de interesse. Aqui, é utilizada uma incubação de pulso de radiolabeling de 20 min, o que é suficiente para rotular espécies NL com uma variedade de abundância.
5. Remova o supernatante das células pelleted, e lave a pelota celular uma vez com 20 mL de mídia SC livre de dextrose, reutilizando a pelota com uma pipeta. Colete as células novamente por centrifugação a 4.100 x g por 5 min.
6. Resuspend as células em 1 mL de mídia SC livre de dextrose, e transfira as células para um tubo de microcentrifuge rotulado de 2 mL. Colete as células novamente por centrifugação a 4.100 x g por 2 min.
7. Resuspende as células mais uma vez em 500 μL de mídia SC livre de dextrose. Pré-esfrie uma centrífuga equipada para tubos cônicos de 50 mL a -10 °C ou na configuração de temperatura mais baixa.
8. Inicie o período de radiolabelação adicionando rapidamente 500 μL de mídia de radiolabeling a cada 500 μL de suspensão celular (concentração final de ácido acético de ¹⁴C = 5 μCi/mL). Incubar os tubos em uma incubadora rotativa a 30 °C por 20 min. 2 min. 2 min antes do final do período de rotulagem, transfira uma alíquota de 20 mL de tampão para cada amostra do congelador -80 °C para um balde de gelo
9. Uma vez terminado o período de rotulagem por radiolabelação, use uma pipeta para mergulhar toda a amostra de 1 mL em 20 mL de tampão de saciamento frio. Vórtice dos tubos cônicos para 5-10 s para garantir que a amostra tenha sido completamente misturada com o tampão de saciamento. Incubar as amostras em tampão de saciamento por 2 minutos no gelo.
10. Colete a pelota celular girando em uma centrífuga a 5.000 x g por 3 min definido para -10 °C ou no ajuste de temperatura mais baixa. Enquanto os tubos de amostra estão girando, transfira outro conjunto de aliquot tampão saciado do congelador de -80 °C para um balde cheio de gelo (ou seja, um tubo de 20 mL de tampão de saciamento por amostra).
11. Remova o supernatante tampão saciante das pelotas celulares e substitua-o por um tampão fresco, frio e saciante de 20 mL. Vórtice e agitar as amostras até que a pelota tenha sido desalojada do fundo do tubo cônico e resuspended totalmente em tampão de saciamento. Centrifugar as amostras novamente a 5.000 x g por 3 min a -10 °C para coletar as células.
12. Uma vez que as células sejam pelotas, remova completamente todo o tampão saciado das amostras derramando o sobrenatário e removendo o excesso com uma pipeta. Armazene os tubos a -80 °C para posterior processamento.

2. Isolamento de lipídios totais de levedura

NOTA: O seguinte protocolo para isolamento lipídudo baseia-se em um método bem estabelecido e frequentemente utilizado que extrai eficientemente a maioria das espécies lipídicas neutras^17,18.
ATENÇÃO: Ao usar solvente orgânico, use sempre EPI apropriado e trabalhe dentro de um capô de fumaça quando possível. Durante a extração lipídica, evite o uso de plásticos incompatíveis com solventes orgânicos. Os tubos de polipropileno são adequados para o seguinte protocolo.

1. Pesar 0,3 g de contas de vidro lavadas com ácido para cada amostra e armazená-las em tubos de microcentrifuus de 2 mL no gelo. Retire as pelotas de célula do congelador -80 °C e mantenha-as no gelo. Adicione 350 μL de metanol e 700 μL de clorofórmio a cada amostra, resuspend e transfira para tubos de microcentrifuuge contendo contas de vidro pré-pesadas.
2. Células de lise agitando tubos em um vórtice 3x por 1 min, com incubações de 30 s no gelo entre agitações. Alternativamente, as células podem ser lysed usando um mini batedor de contas para três ciclos de 1 min. Economize 25-30 μL de lise celular inteira em um tubo separado para contagem de cintilação.
   NOTA: O lysate salvo será usado para determinar a quantidade relativa de radioisótopos captado por cada amostra durante o período de pulso, o que influenciará a quantidade de cada amostra carregada na placa TLC. Isso é discutido ainda mais na etapa 3.2.
3. Despeje todo o conteúdo do tubo de microcentrifuuge de 2 mL em um tubo de centrífuga de vidro de 15 mL [Tubo A]. Lave os tubos de microcentrifuuge de 2 mL adicionando 1 mL de metanol e vórtice para 10-15 s. Transfira a lavagem de metanol de 1 mL para o tubo A e adicione 2 mL de clorofórmio ao tubo A seguido por 400 μL de água para um volume amostral final de 4,45 mL.
4. Amostras de vórtice por 1 min seguido de uma centrifugação de 5 min a 1.000 x g. Após a centrifugação, as fases aquosas (superiores) e orgânicas (inferiores) devem ser claramente separadas visualmente com detritos celulares deitados na interface.
5. Usando uma pipeta pasteur de vidro, colete a fase orgânica do tubo A e mova-se para um novo tubo de centrífuga de vidro de 15 mL (Tubo B). Adicione 1 mL de 1M KCl ao tubo B. Ao tubo A, adicione 1 mL de metanol e 2 mL de clorofórmio, e 200 μL de água MiliQ. Repita os passos de vórtice e centrifugação no tubo A.
6. Mais uma vez colete a fase orgânica do tubo A e adicione-a ao tubo B. Descarte o tubo A em um recipiente apropriado. Tubo de vórtice B por 1 min seguido por uma centrifugação de 5 min a 1.000 x g.
7. Remova a camada aquosa superior do tubo B e descarte. Adicione 1 mL de 1 M KCl fresco de volta ao tubo B e repita a etapa de vórtice/centrifugação. Uma vez que as camadas sejam separadas, colete cuidadosamente toda a camada orgânica inferior em um frasco de vidro de 4 mL rotulado.
   NOTA: Nesta etapa, extratos lipíduos podem ser armazenados a -80 °C, ou o protocolo pode ser continuado para a separação tlc de lipídios.

3. Separação e quantificação de NLs rotulados por radioisótopos por cromatografia de camada fina

1. Se extratos lipídes foram colocados a -80 °C, lentamente trazem à temperatura ambiente incubando no gelo e, posteriormente, em um topo de bancada. Evaporar completamente o solvente dos extratos lipídicos por secagem a vácuo ou usando um fluxo suave de gás inerte (por exemplo, argônio ou nitrogênio). Enquanto isso, pré-aqueça um forno a 145 °C para aquecer a placa TLC.
2. Antes que as amostras possam ser carregadas na placa TLC, determine quantidades relativas de radiolabel captado pelas células. Pipeta 10 μL de toda a célula lysate a partir da etapa 2.2 em um frasco de cintilação de vidro de 6 mL, adicione 6 mL de fluido de cintilação e coloque frascos em um rack. Use um contador de cintilação para medir o cpm ou dpm de cada amostra usando a opção de rack único de contagem definida para um tempo de contagem de 1 minuto. Meça cada célula inteira em duplicata para obter uma média para cada amostra. Ajuste a quantidade de carregamento de acordo com um tipo selvagem ou amostra de referência
   NOTA: A quantidade de cada amostra para carregar na placa TLC pode ser determinada usando a seguinte equação: (contagem média de amostras)/(contagem média de referência) x volume de carregamento desejado. Por exemplo, se 20 μL da amostra de referência deve ser carregado na placa TLC, e tiver uma contagem média de 1.000, então uma amostra experimental com uma contagem média de 2.000 terá 10 μL carregados na placa TLC.
3. Reconstitua os lipídios amostrais em 40-50 μL de 1:1 (v/v%) clorofórmio:metanol por vórtice por 5 min. Prepare 101 mL do solvente de fase móvel em um cilindro graduado em vidro (consulte a seção Resultados Representativos para um exemplo de separação de espécies NL principais por um solvente de ácido acético 50:40:10:1 (v/v/v/v%) Hexano:Éter de petróleo:Éter de diethyl: solvente de ácido acético).
4. Despeje o solvente em uma câmara TLC de vidro contendo uma almofada de saturação TLC de 20 x 20 e uma tampa apertada. Prepare uma placa canalizada de 20 x 20 gel de sílica 60 G marcando suavemente uma linha 1,5 cm acima da parte inferior da placa usando um lápis. A linha designa a origem e onde os lipídios serão carregados. Abaixo da linha, rotule suavemente a amostra que será carregada em cada pista. Uma vez que a placa TLC tenha sido preparada, incubar a placa em um forno de 145 °C por pelo menos 30 minutos para pré-aquecer a placa e remover qualquer excesso de umidade.
5. Uma vez que a placa tenha sido suficientemente aquecida, e a almofada de saturação TLC esteja saturada com solvente, remova a placa TLC do forno e prossiga imediatamente para carregar a placa TLC. Carregar a placa enquanto estiver quente garante a evaporação rápida do solvente. Para cada espécie lipídica de interesse, carregue 5-20 μg de um padrão lipídeco purificado em uma pista da placa TLC para rastrear a separação e a distância de migração esperada. Utilizando uma pipeta, local 5μL de amostra sobre a origem de cada pista localizada 1,5 cm acima do fundo da placa TLC. O carregamento repetido de 5 pontos μL até 20-40 μL de amostra foi carregado em cada pista.
   NOTA: 5-20 μg de lipídios purificados não rotulados podem ser adicionados a cada faixa de amostra como rastreadores que podem ser manchados e visualizados após a separação tlc de lipídios. A presença de um padrão manchado permite fácil rastreamento e excisão de bandas lipídicas radiolabeled para contagem subsequente de cintilação. Quais padrões purificados são carregados na placa será determinado pela espécie nl de interesse. Consulte a seção Resultado Representativo, por exemplo, da separação do ácido oleico (FFA), 1,2 dioleoyl-gliceol (DG), trioleina (TG), colesterol (Chol), cholesteryl-linoleato (SE) e escaeno em pistas adjacentes às faixas de amostra.
6. Uma vez que as amostras padrão e experimental tenham sido carregadas, coloque a placa na câmara em desenvolvimento e espere até que o solvente chegue ao topo da placa (40-60 min). Uma vez que a placa esteja totalmente desenvolvida, remova-a da câmara e deixe-a secar no capô da fumaça por 20 minutos.
7. Depois que a placa estiver seca, cubra-a com filme plástico e coloque-a em um em desenvolvimento com uma tela autordiografia. Deixe que a placa se desenvolva com a tela por 24-48 h.

4. Visualização e quantificação de lipídios separados tlc

1. Remova a tela do em desenvolvimento e coloque dentro de um imager de fósforo. Selecione a opção Phosphor Imaging e desenvolva em 800-1000 V.
   NOTA: A imagem do fósforo dá uma visão qualitativa dos lipídios radiolabelados na placa TLC. No entanto, a quantificação de lipídios radiolabeled é melhor realizada pela contagem de cintilação, que é descrita posteriormente.
2. Misture 100 mL de reagente p-anisaldeído (ver Arquivo Suplementar) e deposite em uma garrafa de spray de vidro. Pulverize a placa TLC com reagente p-anisaldeído até que a sílica esteja saturada. Asse a placa em forno de 145 °C por 5 minutos ou até que as bandas tenham aparecido.
3. Para quantificar espécies lipídicas individuais usando a contagem de cintilação radiolabel, use uma lâmina de barbear para raspar o gel de sílica da placa TLC de vidro. Transfira cada banda de gel de sílica correspondente a uma única espécie lipídica radiolabelada para um frasco de cintilação de vidro e adicione fluido de cintilação de 6 mL. Vórtice vigorosamente até que a banda de sílica tenha sido reduzida a pequenos pedaços.
   1. Alternativamente, os lipídios podem ser extraídos da banda de gel de sílica usando o protocolo de extração lipídica na seção 3. Se os lipídios forem extraídos do gel de sílica, evaporar o solvente inteiramente como na etapa 3.1, e adicionar 6 mL de fluido de cintilação aos lipídios secos. Coloque o rack contendo frascos de cintilação em um balcão de cintilação. Selecione a opção Contagem de rack único e ajuste o tempo de contagem para 2 minutos por frasco. Os resultados do contador de cintilação serão impressos e podem ser visualizados como um gráfico de barras.

Resultados

Neste protocolo, demonstramos que a rotulagem, detecção e quantificação de espécies NL podem ser realizadas por rotulagem metabólica ^{de ácido acético C de 14}C. As principais espécies de NL podem ser separadas em um sistema solvente de 50:40:10:1 (v/v/v/v%) Hexano:Éter de petróleo:Éter de diethyl:Ácido acético (Figura 1A, B). A imagem do fósforo permite a visualização de ácido graxo livre rotulado (FFA), triacylglycerol (TG), diacylglycerol (DG), ...

Discussão

Aqui, é apresentado um versátil protocolo de radiolabeling para monitorar quantitativamente a síntese de espécies de NL na levedura. Este protocolo é muito modular, o que permite que o procedimento seja concluído dentro de 3-6 dias. Além disso, existe uma riqueza de literatura sobre o uso de TLC para separar espécies lipídicas e metabólitos, o que deve permitir ao usuário detectar várias espécies lipídicas de interesse com uma simples mudança dos sistemas de solventes TLC^16,

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
[1-C14] Acetic acid sodium salt specific activity: 45-60mCi	PerkinElmer	NEC084H001MC
18:1 1,2 dioleoyl-sn-glycerol	Avanti	800811O
200 proof absolute ethanol	Sigma	459836
Acid washed glass beads 425-600um	Sigma	G8772
Amber bulbs for Pastuer pipettes	Fisher	03-448-24
Ammonium Sulfate >99%	Sigma	A4418
Beckman LS6500 scintillation counter	PerkinElmer	A481000
Chloroform (HPLC grade)	Fisher	C607SK
Cholesterol >99%	Sigma	C8667
Cholesteryl-linoleate >98%	Sigma	C0289
Concentrated sulfuric acid	Sigma	339741
Corning 50mL conical tubes, polypropylene with centristar cap	Sigma	CLS430829
Dextrose, anhydrous grade	Sigma	D9434
Diethyl ether anhydrous grade	Sigma	296082
Drying oven	Fisher	11-475-155
EcoLume scintillation liquid	VWR	IC88247001
Eppendorf 5424R centrifuge	Fisher	05-401-205
GE Storage phosphor screen	Sigma	GE28-9564-75
GE Typhoon FLA9500 imager
Glacial acetic acid, ACS grade	Sigma	695092
Glass 6mL scintillation vials	Sigma	M1901
Glass centrifuge tube caps	Fisher	14-595-36A
Glass centrifuge tubes	Fisher	14-595-35A
Glass Pasteur pipette	Fisher	13-678-20C
Hexane, anhydrous grade	Sigma	296090
L-Adenine >99%	Sigma	A8626
L-Alanine >98%	Sigma	A7627
L-Arginine >99%	Sigma	A1270000
L-Asparagine >98%	Sigma	A0884
L-Aspartate >98%	Sigma	A9256
L-Cysteine >97%	Sigma	W326305
L-Glutamic acid monosodium salt monohydrate >98%	Sigma	49621
L-Glutamine >99%	Sigma	G3126
L-Glycine >99%	Sigma	G8898
L-Histidine >99%	Sigma	H8000
L-Isoleucine >98%	Sigma	I2752
L-Leucine >98%	Sigma	L8000
L-Lysine >98%	Sigma	L5501
L-Methionine, HPLC grade	Sigma	M9625
L-Phenylalanine, reagent grade	Sigma	P2126
L-Proline >99%	Sigma	P0380
L-Serine >99%	Sigma	S4500
L-Theronine, reagent grade	Sigma	T8625
L-Tryptophan >98%	Sigma	T0254
L-Tyrosine >98%	Sigma	T3754
L-Uracil >99%	Sigma	U0750
L-Valine >98%	Sigma	V0500
Methanol, ACS grade	Fisher	A412
Oleic acid >99%	Sigma	O1008
p-anisaldehyde	Sigma	A88107
Petroleum ether, ACS grade	Sigma	184519
Phosphatidylcholine, dipalmitoyl >99%	Sigma	P1652
Pipettes	Eppendorf	2231000713
Potassium chloride, ACS grade	Sigma	P3911
Sodium Hydroxide pellets, certified ACS	Fisher	S318-100
Squalene >98%	Sigma	S3626
Succinic Acid crystalline/certified	Fisher	110-15-6
TLC saturation pad	Sigma	Z265225
TLC silica gel 60G glass channeled plate	Fisher	NC9825743	No fluorescent indicators
Transparency plastic film	Apollo	829903
Tricine	Sigma	T0377
Triolein >99%	Sigma	T7140
Vortex mixer	Fisher	02-215-414
Whatman exposure cassette	Sigma	WHA29175523
Yeast nitrogen base without ammonium sulfate and amino acids	Sigma	Y1251