Un abonnement à JoVE est nécessaire pour voir ce contenu. Connectez-vous ou commencez votre essai gratuit.
Ici, un protocole est présenté pour le profilage métabolique de la levure avec de l’acide 14C-acétique, qui est couplé à la chromatographie sur couche mince pour la séparation des lipides neutres.
Les lipides neutres (LNI) sont une classe de biomolécules hydrophobes et sans charge qui jouent un rôle clé dans l’homéostasie énergétique et lipidique. Les NL sont synthétisés de novo à partir de l’acétyl-CoA et sont principalement présents chez les eucaryotes sous forme de triglycérides (TG) et d’esters de stérols (SE). Les enzymes responsables de la synthèse des LNL sont hautement conservées de Saccharomyces cerevisiae (levure) à l’homme, faisant de la levure un organisme modèle utile pour disséquer la fonction et la régulation des enzymes du métabolisme NL. Bien que l’on sache beaucoup de choses sur la façon dont l’acétyl-CoA est converti en un ensemble diversifié d’espèces NL, des mécanismes de régulation des enzymes du métabolisme NL et comment une mauvaise régulation peut contribuer aux pathologies cellulaires sont encore en cours de découverte. De nombreuses méthodes d’isolement et de caractérisation des espèces de Terre-Neuve-et-Labrador ont été mises au point et utilisées au cours de décennies de recherche; toutefois, il n’a pas été question d’un protocole quantitatif et simple pour la caractérisation complète des principales espèces de Terre-Neuve-et-Labrador. Ici, une méthode simple et adaptable pour quantifier la synthèse de novo des principales espèces nl dans la levure est présentée. Nous appliquons 14marques métaboliques de l’acide C-acétique couplées à la chromatographie sur couche mince pour séparer et quantifier une gamme variée de NL physiologiquement importantes. De plus, cette méthode peut être facilement appliquée pour étudier les taux de réaction in vivo des enzymes NL ou la dégradation des espèces NL au fil du temps.
L’acétyl-CoA est l’élément constitutif fondamental de diverses biomolécules, y compris les lipides neutres (LNL), qui servent de monnaie biomoléculaire polyvalente pour la construction de membranes, la génération d’ATP et la régulation de la signalisation cellulaire1,2. La disponibilité des LNL à être déviés dans l’une de ces voies respectives est, en partie, réglementée par leur stockage. Les gouttelettes lipidiques (LD), organites cytoplasmiques composés de noyaux hydrophobes de triglycérides (TG) et d’esters de stérols (SE), sont les principaux compartiments de stockage de la plupart des LL cellulaires. En ....
1. Croissance et étiquetage des cellules de levure avec de l’acide 14C-acétique
Dans ce protocole, nous avons démontré que le labeling, la détection et la quantification des espèces NL peuvent être réalisés par 14étiquetage métabolique de l’acide C-acétique. Les principales espèces nl peuvent être séparées dans un système de solvant de 50:40:10:1 (v/v/v/v%) Hexane:Éther de pétrole:Éther diéthylique:Acide acétique (Figure 1A, B). L’imagerie au phosphore permet de visualiser l’acide gras libre marqué (FFA), le triacyl.......
Ici, un protocole de radiomarquage polyvalent pour surveiller quantitativement la synthèse des espèces NL dans la levure est présenté. Ce protocole est très modulaire, ce qui permet de terminer la procédure dans les 3-6 jours. De plus, il existe une abondante littérature sur l’utilisation de la TLC pour séparer les espèces lipidiques et les métabolites, ce qui devrait permettre à l’utilisateur de détecter plusieurs espèces lipidiques d’intérêt avec un simple changement des systèmes de solvants TLC
Les auteurs déclarent qu’il n’y a pas d’intérêts concurrents dans la préparation de ce manuscrit.
Les auteurs tiennent à remercier les membres du laboratoire Henne pour leur aide et leurs conseils conceptuels dans la réalisation de cette étude. W.M.H. est soutenu par des fonds de la Welch Foundation (I-1873), du NIH NIGMS (GM119768), du Ara Paresghian Medical Research Fund et du UT Southwestern Endowed Scholars Program. S.R a été soutenu par une subvention du programme T32 (5T32GM008297).
....Name | Company | Catalog Number | Comments |
[1-C14] Acetic acid sodium salt specific activity: 45-60mCi | PerkinElmer | NEC084H001MC | |
18:1 1,2 dioleoyl-sn-glycerol | Avanti | 800811O | |
200 proof absolute ethanol | Sigma | 459836 | |
Acid washed glass beads 425-600um | Sigma | G8772 | |
Amber bulbs for Pastuer pipettes | Fisher | 03-448-24 | |
Ammonium Sulfate >99% | Sigma | A4418 | |
Beckman LS6500 scintillation counter | PerkinElmer | A481000 | |
Chloroform (HPLC grade) | Fisher | C607SK | |
Cholesterol >99% | Sigma | C8667 | |
Cholesteryl-linoleate >98% | Sigma | C0289 | |
Concentrated sulfuric acid | Sigma | 339741 | |
Corning 50mL conical tubes, polypropylene with centristar cap | Sigma | CLS430829 | |
Dextrose, anhydrous grade | Sigma | D9434 | |
Diethyl ether anhydrous grade | Sigma | 296082 | |
Drying oven | Fisher | 11-475-155 | |
EcoLume scintillation liquid | VWR | IC88247001 | |
Eppendorf 5424R centrifuge | Fisher | 05-401-205 | |
GE Storage phosphor screen | Sigma | GE28-9564-75 | |
GE Typhoon FLA9500 imager | |||
Glacial acetic acid, ACS grade | Sigma | 695092 | |
Glass 6mL scintillation vials | Sigma | M1901 | |
Glass centrifuge tube caps | Fisher | 14-595-36A | |
Glass centrifuge tubes | Fisher | 14-595-35A | |
Glass Pasteur pipette | Fisher | 13-678-20C | |
Hexane, anhydrous grade | Sigma | 296090 | |
L-Adenine >99% | Sigma | A8626 | |
L-Alanine >98% | Sigma | A7627 | |
L-Arginine >99% | Sigma | A1270000 | |
L-Asparagine >98% | Sigma | A0884 | |
L-Aspartate >98% | Sigma | A9256 | |
L-Cysteine >97% | Sigma | W326305 | |
L-Glutamic acid monosodium salt monohydrate >98% | Sigma | 49621 | |
L-Glutamine >99% | Sigma | G3126 | |
L-Glycine >99% | Sigma | G8898 | |
L-Histidine >99% | Sigma | H8000 | |
L-Isoleucine >98% | Sigma | I2752 | |
L-Leucine >98% | Sigma | L8000 | |
L-Lysine >98% | Sigma | L5501 | |
L-Methionine, HPLC grade | Sigma | M9625 | |
L-Phenylalanine, reagent grade | Sigma | P2126 | |
L-Proline >99% | Sigma | P0380 | |
L-Serine >99% | Sigma | S4500 | |
L-Theronine, reagent grade | Sigma | T8625 | |
L-Tryptophan >98% | Sigma | T0254 | |
L-Tyrosine >98% | Sigma | T3754 | |
L-Uracil >99% | Sigma | U0750 | |
L-Valine >98% | Sigma | V0500 | |
Methanol, ACS grade | Fisher | A412 | |
Oleic acid >99% | Sigma | O1008 | |
p-anisaldehyde | Sigma | A88107 | |
Petroleum ether, ACS grade | Sigma | 184519 | |
Phosphatidylcholine, dipalmitoyl >99% | Sigma | P1652 | |
Pipettes | Eppendorf | 2231000713 | |
Potassium chloride, ACS grade | Sigma | P3911 | |
Sodium Hydroxide pellets, certified ACS | Fisher | S318-100 | |
Squalene >98% | Sigma | S3626 | |
Succinic Acid crystalline/certified | Fisher | 110-15-6 | |
TLC saturation pad | Sigma | Z265225 | |
TLC silica gel 60G glass channeled plate | Fisher | NC9825743 | No fluorescent indicators |
Transparency plastic film | Apollo | 829903 | |
Tricine | Sigma | T0377 | |
Triolein >99% | Sigma | T7140 | |
Vortex mixer | Fisher | 02-215-414 | |
Whatman exposure cassette | Sigma | WHA29175523 | |
Yeast nitrogen base without ammonium sulfate and amino acids | Sigma | Y1251 |
Demande d’autorisation pour utiliser le texte ou les figures de cet article JoVE
Demande d’autorisationThis article has been published
Video Coming Soon