Analyse de la synthèse lipidique neutre chez Saccharomyces cerevisiae par marquage métabolique et chromatographie sur couche mince

Résumé

Ici, un protocole est présenté pour le profilage métabolique de la levure avec de l’acide ¹⁴C-acétique, qui est couplé à la chromatographie sur couche mince pour la séparation des lipides neutres.

Résumé

Les lipides neutres (LNI) sont une classe de biomolécules hydrophobes et sans charge qui jouent un rôle clé dans l’homéostasie énergétique et lipidique. Les NL sont synthétisés de novo à partir de l’acétyl-CoA et sont principalement présents chez les eucaryotes sous forme de triglycérides (TG) et d’esters de stérols (SE). Les enzymes responsables de la synthèse des LNL sont hautement conservées de Saccharomyces cerevisiae (levure) à l’homme, faisant de la levure un organisme modèle utile pour disséquer la fonction et la régulation des enzymes du métabolisme NL. Bien que l’on sache beaucoup de choses sur la façon dont l’acétyl-CoA est converti en un ensemble diversifié d’espèces NL, des mécanismes de régulation des enzymes du métabolisme NL et comment une mauvaise régulation peut contribuer aux pathologies cellulaires sont encore en cours de découverte. De nombreuses méthodes d’isolement et de caractérisation des espèces de Terre-Neuve-et-Labrador ont été mises au point et utilisées au cours de décennies de recherche; toutefois, il n’a pas été question d’un protocole quantitatif et simple pour la caractérisation complète des principales espèces de Terre-Neuve-et-Labrador. Ici, une méthode simple et adaptable pour quantifier la synthèse de novo des principales espèces nl dans la levure est présentée. Nous appliquons ¹⁴marques métaboliques de l’acide C-acétique couplées à la chromatographie sur couche mince pour séparer et quantifier une gamme variée de NL physiologiquement importantes. De plus, cette méthode peut être facilement appliquée pour étudier les taux de réaction in vivo des enzymes NL ou la dégradation des espèces NL au fil du temps.

Introduction

L’acétyl-CoA est l’élément constitutif fondamental de diverses biomolécules, y compris les lipides neutres (LNL), qui servent de monnaie biomoléculaire polyvalente pour la construction de membranes, la génération d’ATP et la régulation de la signalisation cellulaire^1,2. La disponibilité des LNL à être déviés dans l’une de ces voies respectives est, en partie, réglementée par leur stockage. Les gouttelettes lipidiques (LD), organites cytoplasmiques composés de noyaux hydrophobes de triglycérides (TG) et d’esters de stérols (SE), sont les principaux compartiments de stockage de la plupart des LL cellulaires. En ....

Protocole

1. Croissance et étiquetage des cellules de levure avec de l’acide ¹⁴C-acétique

1. Inoculer une culture de levure en cueillant une colonie dans une assiette et en la distribuant dans 20 mL de milieux synthétiques complets (SC) contenant 2 % de dextrose (voir dossier supplémentaire pour la recette des milieux SC). Incuber à 30 °C pendant la nuit en agitant à 200 tr/min.
   REMARQUE: L’état de croissance, le volume de l’échantillon et le traitement diffèrent en fonction du ou des lipides d’intérêt. Avant de mener des expériences complètes, les conditions de croissance optimales et les volumes de culture doivent être déterminés empiriqu....

Résultats

Dans ce protocole, nous avons démontré que le labeling, la détection et la quantification des espèces NL peuvent être réalisés par ¹⁴étiquetage métabolique de l’acide C-acétique. Les principales espèces nl peuvent être séparées dans un système de solvant de 50:40:10:1 (v/v/v/v%) Hexane:Éther de pétrole:Éther diéthylique:Acide acétique (Figure 1A, B). L’imagerie au phosphore permet de visualiser l’acide gras libre marqué (FFA), le triacyl.......

Discussion

Ici, un protocole de radiomarquage polyvalent pour surveiller quantitativement la synthèse des espèces NL dans la levure est présenté. Ce protocole est très modulaire, ce qui permet de terminer la procédure dans les 3-6 jours. De plus, il existe une abondante littérature sur l’utilisation de la TLC pour séparer les espèces lipidiques et les métabolites, ce qui devrait permettre à l’utilisateur de détecter plusieurs espèces lipidiques d’intérêt avec un simple changement des systèmes de solvants TLC

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
[1-C14] Acetic acid sodium salt specific activity: 45-60mCi	PerkinElmer	NEC084H001MC
18:1 1,2 dioleoyl-sn-glycerol	Avanti	800811O
200 proof absolute ethanol	Sigma	459836
Acid washed glass beads 425-600um	Sigma	G8772
Amber bulbs for Pastuer pipettes	Fisher	03-448-24
Ammonium Sulfate >99%	Sigma	A4418
Beckman LS6500 scintillation counter	PerkinElmer	A481000
Chloroform (HPLC grade)	Fisher	C607SK
Cholesterol >99%	Sigma	C8667
Cholesteryl-linoleate >98%	Sigma	C0289
Concentrated sulfuric acid	Sigma	339741
Corning 50mL conical tubes, polypropylene with centristar cap	Sigma	CLS430829
Dextrose, anhydrous grade	Sigma	D9434
Diethyl ether anhydrous grade	Sigma	296082
Drying oven	Fisher	11-475-155
EcoLume scintillation liquid	VWR	IC88247001
Eppendorf 5424R centrifuge	Fisher	05-401-205
GE Storage phosphor screen	Sigma	GE28-9564-75
GE Typhoon FLA9500 imager
Glacial acetic acid, ACS grade	Sigma	695092
Glass 6mL scintillation vials	Sigma	M1901
Glass centrifuge tube caps	Fisher	14-595-36A
Glass centrifuge tubes	Fisher	14-595-35A
Glass Pasteur pipette	Fisher	13-678-20C
Hexane, anhydrous grade	Sigma	296090
L-Adenine >99%	Sigma	A8626
L-Alanine >98%	Sigma	A7627
L-Arginine >99%	Sigma	A1270000
L-Asparagine >98%	Sigma	A0884
L-Aspartate >98%	Sigma	A9256
L-Cysteine >97%	Sigma	W326305
L-Glutamic acid monosodium salt monohydrate >98%	Sigma	49621
L-Glutamine >99%	Sigma	G3126
L-Glycine >99%	Sigma	G8898
L-Histidine >99%	Sigma	H8000
L-Isoleucine >98%	Sigma	I2752
L-Leucine >98%	Sigma	L8000
L-Lysine >98%	Sigma	L5501
L-Methionine, HPLC grade	Sigma	M9625
L-Phenylalanine, reagent grade	Sigma	P2126
L-Proline >99%	Sigma	P0380
L-Serine >99%	Sigma	S4500
L-Theronine, reagent grade	Sigma	T8625
L-Tryptophan >98%	Sigma	T0254
L-Tyrosine >98%	Sigma	T3754
L-Uracil >99%	Sigma	U0750
L-Valine >98%	Sigma	V0500
Methanol, ACS grade	Fisher	A412
Oleic acid >99%	Sigma	O1008
p-anisaldehyde	Sigma	A88107
Petroleum ether, ACS grade	Sigma	184519
Phosphatidylcholine, dipalmitoyl >99%	Sigma	P1652
Pipettes	Eppendorf	2231000713
Potassium chloride, ACS grade	Sigma	P3911
Sodium Hydroxide pellets, certified ACS	Fisher	S318-100
Squalene >98%	Sigma	S3626
Succinic Acid crystalline/certified	Fisher	110-15-6
TLC saturation pad	Sigma	Z265225
TLC silica gel 60G glass channeled plate	Fisher	NC9825743	No fluorescent indicators
Transparency plastic film	Apollo	829903
Tricine	Sigma	T0377
Triolein >99%	Sigma	T7140
Vortex mixer	Fisher	02-215-414
Whatman exposure cassette	Sigma	WHA29175523
Yeast nitrogen base without ammonium sulfate and amino acids	Sigma	Y1251