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Dans cet article

  • Résumé
  • Résumé
  • Introduction
  • Protocole
  • Résultats
  • Discussion
  • Déclarations de divulgation
  • Remerciements
  • matériels
  • Références
  • Réimpressions et Autorisations

Résumé

Ici, un protocole est présenté pour le profilage métabolique de la levure avec de l’acide 14C-acétique, qui est couplé à la chromatographie sur couche mince pour la séparation des lipides neutres.

Résumé

Les lipides neutres (LNI) sont une classe de biomolécules hydrophobes et sans charge qui jouent un rôle clé dans l’homéostasie énergétique et lipidique. Les NL sont synthétisés de novo à partir de l’acétyl-CoA et sont principalement présents chez les eucaryotes sous forme de triglycérides (TG) et d’esters de stérols (SE). Les enzymes responsables de la synthèse des LNL sont hautement conservées de Saccharomyces cerevisiae (levure) à l’homme, faisant de la levure un organisme modèle utile pour disséquer la fonction et la régulation des enzymes du métabolisme NL. Bien que l’on sache beaucoup de choses sur la façon dont l’acétyl-CoA est converti en un ensemble diversifié d’espèces NL, des mécanismes de régulation des enzymes du métabolisme NL et comment une mauvaise régulation peut contribuer aux pathologies cellulaires sont encore en cours de découverte. De nombreuses méthodes d’isolement et de caractérisation des espèces de Terre-Neuve-et-Labrador ont été mises au point et utilisées au cours de décennies de recherche; toutefois, il n’a pas été question d’un protocole quantitatif et simple pour la caractérisation complète des principales espèces de Terre-Neuve-et-Labrador. Ici, une méthode simple et adaptable pour quantifier la synthèse de novo des principales espèces nl dans la levure est présentée. Nous appliquons 14marques métaboliques de l’acide C-acétique couplées à la chromatographie sur couche mince pour séparer et quantifier une gamme variée de NL physiologiquement importantes. De plus, cette méthode peut être facilement appliquée pour étudier les taux de réaction in vivo des enzymes NL ou la dégradation des espèces NL au fil du temps.

Introduction

L’acétyl-CoA est l’élément constitutif fondamental de diverses biomolécules, y compris les lipides neutres (LNL), qui servent de monnaie biomoléculaire polyvalente pour la construction de membranes, la génération d’ATP et la régulation de la signalisation cellulaire1,2. La disponibilité des LNL à être déviés dans l’une de ces voies respectives est, en partie, réglementée par leur stockage. Les gouttelettes lipidiques (LD), organites cytoplasmiques composés de noyaux hydrophobes de triglycérides (TG) et d’esters de stérols (SE), sont les principaux compartiments de stockage de la plupart des LL cellulaires. En ....

Protocole

1. Croissance et étiquetage des cellules de levure avec de l’acide 14C-acétique

  1. Inoculer une culture de levure en cueillant une colonie dans une assiette et en la distribuant dans 20 mL de milieux synthétiques complets (SC) contenant 2 % de dextrose (voir dossier supplémentaire pour la recette des milieux SC). Incuber à 30 °C pendant la nuit en agitant à 200 tr/min.
    REMARQUE: L’état de croissance, le volume de l’échantillon et le traitement diffèrent en fonction du ou des lipides d’intérêt. Avant de mener des expériences complètes, les conditions de croissance optimales et les volumes de culture doivent être déterminés empiriqu....

Résultats

Dans ce protocole, nous avons démontré que le labeling, la détection et la quantification des espèces NL peuvent être réalisés par 14étiquetage métabolique de l’acide C-acétique. Les principales espèces nl peuvent être séparées dans un système de solvant de 50:40:10:1 (v/v/v/v%) Hexane:Éther de pétrole:Éther diéthylique:Acide acétique (Figure 1A, B). L’imagerie au phosphore permet de visualiser l’acide gras libre marqué (FFA), le triacyl.......

Discussion

Ici, un protocole de radiomarquage polyvalent pour surveiller quantitativement la synthèse des espèces NL dans la levure est présenté. Ce protocole est très modulaire, ce qui permet de terminer la procédure dans les 3-6 jours. De plus, il existe une abondante littérature sur l’utilisation de la TLC pour séparer les espèces lipidiques et les métabolites, ce qui devrait permettre à l’utilisateur de détecter plusieurs espèces lipidiques d’intérêt avec un simple changement des systèmes de solvants TLC

Déclarations de divulgation

Les auteurs déclarent qu’il n’y a pas d’intérêts concurrents dans la préparation de ce manuscrit.

Remerciements

Les auteurs tiennent à remercier les membres du laboratoire Henne pour leur aide et leurs conseils conceptuels dans la réalisation de cette étude. W.M.H. est soutenu par des fonds de la Welch Foundation (I-1873), du NIH NIGMS (GM119768), du Ara Paresghian Medical Research Fund et du UT Southwestern Endowed Scholars Program. S.R a été soutenu par une subvention du programme T32 (5T32GM008297).

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matériels

NameCompanyCatalog NumberComments
[1-C14] Acetic acid sodium salt specific activity: 45-60mCiPerkinElmerNEC084H001MC
18:1 1,2 dioleoyl-sn-glycerolAvanti800811O
200 proof absolute ethanolSigma459836
Acid washed glass beads 425-600umSigmaG8772
Amber bulbs for Pastuer pipettesFisher03-448-24
Ammonium Sulfate >99%SigmaA4418
Beckman LS6500 scintillation counterPerkinElmerA481000
Chloroform (HPLC grade)FisherC607SK
Cholesterol >99%SigmaC8667
Cholesteryl-linoleate >98%SigmaC0289
Concentrated sulfuric acidSigma339741
Corning 50mL conical tubes, polypropylene with centristar capSigmaCLS430829
Dextrose, anhydrous gradeSigmaD9434
Diethyl ether anhydrous gradeSigma296082
Drying ovenFisher11-475-155
EcoLume scintillation liquidVWRIC88247001
Eppendorf 5424R centrifugeFisher05-401-205
GE Storage phosphor screenSigmaGE28-9564-75
GE Typhoon FLA9500 imager
Glacial acetic acid, ACS gradeSigma695092
Glass 6mL scintillation vialsSigmaM1901
Glass centrifuge tube capsFisher14-595-36A
Glass centrifuge tubesFisher14-595-35A
Glass Pasteur pipetteFisher13-678-20C
Hexane, anhydrous gradeSigma296090
L-Adenine >99%SigmaA8626
L-Alanine >98%SigmaA7627
L-Arginine >99%SigmaA1270000
L-Asparagine >98%SigmaA0884
L-Aspartate >98%SigmaA9256
L-Cysteine >97%SigmaW326305
L-Glutamic acid monosodium salt monohydrate >98%Sigma49621
L-Glutamine >99%SigmaG3126
L-Glycine >99%SigmaG8898
L-Histidine >99%SigmaH8000
L-Isoleucine >98%SigmaI2752
L-Leucine >98%SigmaL8000
L-Lysine >98%SigmaL5501
L-Methionine, HPLC gradeSigmaM9625
L-Phenylalanine, reagent gradeSigmaP2126
L-Proline >99%SigmaP0380
L-Serine >99%SigmaS4500
L-Theronine, reagent gradeSigmaT8625
L-Tryptophan >98%SigmaT0254
L-Tyrosine >98%SigmaT3754
L-Uracil >99%SigmaU0750
L-Valine >98%SigmaV0500
Methanol, ACS gradeFisherA412
Oleic acid >99%SigmaO1008
p-anisaldehydeSigmaA88107
Petroleum ether, ACS gradeSigma184519
Phosphatidylcholine, dipalmitoyl >99%SigmaP1652
PipettesEppendorf2231000713
Potassium chloride, ACS gradeSigmaP3911
Sodium Hydroxide pellets, certified ACSFisherS318-100
Squalene >98%SigmaS3626
Succinic Acid crystalline/certifiedFisher110-15-6
TLC saturation padSigmaZ265225
TLC silica gel 60G glass channeled plateFisherNC9825743No fluorescent indicators
Transparency plastic filmApollo829903
TricineSigmaT0377
Triolein >99%SigmaT7140
Vortex mixerFisher02-215-414
Whatman exposure cassetteSigmaWHA29175523
Yeast nitrogen base without ammonium sulfate and amino acidsSigmaY1251

Références

  1. Konige, M., Wang, H., Sztalryd, C. Role of adipose specific lipid droplet proteins in maintaining whole body energy homeostasis. Biochimica Et Biophysica Acta. 1842 (3), 393-401 (2014).
  2. Arrese, E. L., Saudale, F. Z., Soulages, J. L.

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