Überlegungen zur Sammlung, Verarbeitung und Lagerung für die Biomarkerforschung im Urin

Zusammenfassung

Dieses Protokoll zielt darauf ab, Überlegungen zur Entnahme, Verarbeitung und Lagerung von Urinproben für Biomarker-Studien zu Biomarker-Studien zu Harnwegsinfektionen zu liefern.

Zusammenfassung

Es gibt mehrere Harnwegsproteine, die sich als vielversprechende Marker für Harnwegsinfektionen erweisen. Die Identifizierung eines neuartigen Biomarkers, der im Vergleich zu aktuellen diagnostischen Methoden eine höhere Vorhersagegenauigkeit aufweist, hat das Potenzial, die Fähigkeit zur Behandlung von Patienten mit Harnwegsinfektionen erheblich zu verbessern. Die Entnahme, Verarbeitung und Lagerung von Proben kann sich jedoch möglicherweise auf die Ergebnisse der Biomarkerforschung auswirken. Das Verständnis der Auswirkungen jeder dieser Phasen auf Biomarker-Studien ist notwendig, um zukünftige, qualitativ hochwertige Forschung in diesem Bereich zu informieren und andere Studien in diesem Bereich kritisch zu überprüfen. Hier gibt die Studie einen Überblick über die Literatur zu den Auswirkungen der einzelnen Phasen der Urinprobenverarbeitung und berichtet über die Auswirkungen verschiedener Erkrankungen auf Harnproteine. Das Protokoll konzentriert sich auf die Entnahmetechniken, die Zeit und Temperatur der Lagerung, die Verarbeitungstechniken, die Verwendung von Reagenzien und das langfristige Einfrieren der Biomarkerstabilität. Der Schwerpunkt liegt auf Proteinen, aber auch auf andere Materialien, die in der Biomarkerforschung eingesetzt werden können. Auf diese Weise wird dieses Protokoll zukünftigen Forschern einen Leitfaden an die Hand geben, um bei der Gestaltung von Studien zu Biomarkern im Urin zu helfen.

Einleitung

Harnwegsinfektionen (HWI) sind eine der häufigsten bakteriellen Infektionen bei Kindern und Erwachsenen¹. Während die Diagnose einer Harnwegsinfektion in einigen Populationen unkompliziert sein kann, kann sie in anderen, wie z. B. bei Menschen mit neuropathischer Blase², komplexer sein. Die Fähigkeit, Harnwegsinfektionen genau zu diagnostizieren, wird dazu beitragen, die Bemühungen um den Umgang mit Antibiotika zu verbessern, indem der Einsatz unnötiger Antibiotika verringert wird, und möglicherweise die frühere Diagnose von Harnwegsinfektionen unterstützen, wodurch das Morbiditätsrisiko verringert wird. Angesichts der Prävalenz von Harnwegsinfektionen besteht ein erhebliches Interesse an einer besseren Behandlung dieser häufigen Infektion.

Es gibt eine zunehmende Anzahl neuartiger Biomarker in der Literatur, die vielversprechend in ihrer Fähigkeit sind, Harnwegsinfektionen^zu diagnostizieren 3,4,5,6,7. Es gibt jedoch mehrere Faktoren, die mit der Verarbeitung von Urinproben verbunden sind und das Potenzial haben, die Ergebnisse zu verändern. Diese Faktoren reichen von Entnahmemethoden, Temperatur und Dauer der Kurz- und Langzeitlagerung, Verarbeitungstechniken, Verwendung von Reagenzien und Gefrier-Tau-Zyklen⁸. Zu verstehen, wie sich Veränderungen in jedem dieser Bereiche auf die Biomarker-Messwerte auswirken können, ist notwendig, um sowohl die Forschung in der Literatur kritisch zu interpretieren als auch qualitativ hochwertige Studien zu konzipieren, die sich auf Urin-Biomarker konzentrieren.

Hier wird ein narrativer Überblick über die Auswirkungen der einzelnen Faktoren, einschließlich Sammeltechniken, kurz- und langfristiger Lagertemperatur und -dauer, Reagenzienverwendung und die Wirkung von Gefrier-Tau-Zyklen, auf Proteine gegeben, die als Urin-Biomarker nützlich sein können, und Empfehlungen für eine optimale Verarbeitung auf der Grundlage dieser Literaturübersicht gegeben. Dieses Protokoll konzentriert sich auf Protein-Biomarker, die mit Western Blots oder ELISAs gemessen werden.

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Protokoll

Dieses Protokoll folgt den Richtlinien der Ethikkommission der Humanforschung der Institution. Stellen Sie sicher, dass die Genehmigung des Institutional Review Board (IRB) eingeholt wird, bevor biologische Proben für die Forschung entnommen und verwendet werden.

1. Sammlung

1. Entnehmen Sie die Urinprobe in einem sterilen Probenbecher. Entscheiden Sie über die Art der Urinprobe sowie über spezifische Ein- und Ausschlusskriterien auf der Grundlage des spezifischen Studiendesigns. Verwenden Sie für Harnwegsinfektionsuntersuchungen entweder die Clean-Catch-Methode oder eine Katheterisierung, um eine Kontamination des Damms zu vermeiden.
2. Um eine saubere Urinprobe zu erhalten, weisen Sie die Teilnehmer an, den periurethralen Bereich mit einem Handtuch abzuwischen, eine kleine Menge in die Toilette zu entleeren und dann in den Probenbecher zu urinieren.
3. Weisen Sie Frauen an, die Schamlippen mit den Fingern zu spreizen, und Männer, ihre Vorhaut (falls zutreffend) vor dem Wasserlassen zurückzuziehen, um eine Kontamination zu vermeiden.
4. Notieren Sie den Zeitpunkt der Sammlung.
5. Sammeln Sie die relevanten klinischen Daten von jedem Teilnehmer, wie es für das jeweilige Studiendesign und die Forschungsfrage erforderlich ist.
6. Erwägen Sie, vor der Verarbeitung und Lagerung jeder Probe eine Urinanalyse oder einen Urinmessstab durchzuführen, wenn diese Daten nicht zuverlässig aus der elektronischen Patientenakte verfügbar sind.

2. Probenverarbeitung und -lagerung

1. Verarbeiten Sie die Proben sofort. Ist dies nicht möglich, lagern Sie die Probe bis zu 24 h bei 4 °C.
2. Wenn Proben nicht bei 4 °C gelagert werden können oder länger als 24 h bei 4 °C gelagert werden müssen, sind 0,2 M Borsäure oder 10 mM NaN₃ zu den Proben hinzuzufügen. Stellen Sie sicher, dass diese Reagenzien mit geplanten nachgelagerten Anwendungen kompatibel sind.
3. Erfassen Sie die Zeitdauer der Proben bei 4 °C.
4. Zentrifugieren Sie die Proben bei 1000-1500 x g für 10-20 min. Die Zentrifugation muss nicht bei 4 °C erfolgen.
5. Der Überstand wird aufgefangen und in separate Mikrozentrifugenröhrchen aliquotiert.
6. Beschriften Sie die Röhrchen mit mehreren, eindeutigen Identifikatoren (z. B. Datum und Probenidentifikation (ID)). Erwägen Sie die Verwendung von computergenerierten Barcodes, die speziell für die Lagerung biologischer Proben bei -80 °C entwickelt wurden. Falls nicht verfügbar, stellen Sie sicher, dass der Stift, der zum Etikettieren der Proben verwendet wird, wasserfest ist.
7. Beschriften Sie jede Gefrierbox so, dass jeder Standort einen bestimmten Code hat. Nummerieren Sie dazu jede Spalte mit einem anderen Buchstaben und jede Zeile mit einer Zahl. Dies ermöglicht die Erstellung von Karten oder anderen Führern für eine einfache Probenlokalisierung.
8. Frieren Sie die Proben sofort bei -80 °C ein. Notieren Sie die Zeit des Einfrierens.
9. Tauen Sie die Proben am Tag der Messung in einem 37 °C warmen Wasserbad auf, um eine unnötige Lagerung bei Raumtemperatur oder 4 °C zu minimieren.
10. Notieren Sie die Zeiten und die Anzahl der zusätzlichen Gefrier-Tau-Zyklen für jedes Aliquot.

3. Würdigung

1. Bei der Verwendung von handelsüblichen ELISAs sind die Angaben des Herstellers zu beachten.
2. Führen Sie die Beispiele in doppelter Ausführung aus.
3. Identifizieren Sie die erwartete Konzentration des interessierenden Proteins, um sicherzustellen, dass die Proteingehalte in den Proben innerhalb des Bereichs des Kits liegen. Wenn der erwartete Proteingehalt den oberen Standard überschreitet, verdünnen Sie die Proben.
4. Nachdem die Daten vom Plate Reader (ELISA) oder Western Blot erhalten wurden, bestimmen Sie die Konzentration jedes Biomarkers in der Probe manuell (nicht empfohlen) oder mit einer beliebigen Software.
5. Analysieren Sie die Ergebnisse. Die Datenanalyse hängt vom individuellen Studiendesign ab.
6. Erwägen Sie, die Biomarkerwerte anzupassen, um die Urinkonzentration zu berücksichtigen.
   HINWEIS: Traditionell haben Biomarkerforscher Urinkreatinin als Methode zur Normalisierung verwendet, insbesondere bei Teilnehmern mit normaler Nierenfunktion, um die Urinkonzentration zu berücksichtigen. Andere berichten jedoch, dass die Normalisierung keinen Unterschied in den Ergebnissen macht⁴. Um diese Hürde zu überwinden, berichten einige Forscher sowohl von normalisierten als auch von nicht normalisierten Ergebnissen.
7. Empfehlen Sie die Angabe von Zeitbereichen von der Entnahme bis zum Einfrieren sowie die Zeitdauer bei 4 °C vor der Verarbeitung in veröffentlichten Manuskripten, um eine Interpretation der Ergebnisse im Rahmen der Probenverarbeitung zu ermöglichen (Abbildung 1)

4. Einfluss verschiedener Lagerbedingungen auf das neutrophile Gelatinase-assoziierte Lipocalin (NGAL).

1. Frischen Urin mit 2 ng/ml rekombinantem NGAL aufspießen.
2. Aliquotieren Sie den Urin und setzen Sie ihn verschiedenen Verarbeitungs- und Lagerbedingungen aus.
   1. Zentrifugieren Sie den Urin bei 1000-1500 x g für 10-20 min. Die Zentrifugation muss nicht bei 4 °C erfolgen. Unter verschiedenen Bedingungen (20 °C, 4 °C, -20 °C) für 24 h, 48 h oder 72 h lagern.
   2. Das Aliquot der Probe zum Vergleich bei -80 °C lagern.
3. Nachdem Sie die Proben unter den in Schritt 4.2.1 genannten verschiedenen Bedingungen gehalten haben, messen Sie die NGAL-Werte in den Proben mit einem handelsüblichen ELISA-Kit, das die Kontrollen gemäß den Anweisungen des Herstellers enthält.

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Ergebnisse

Die Zentrifugation hatte einen geringen Einfluss auf die NGAL-Werte. Zentrifugierte Proben, die bei -80 °C gelagert wurden, wiesen niedrigere NGAL-Werte auf als nicht zentrifugierte Proben (2,17 ng/mL ± 0,32 ng/ml, 2,77 ng/mL ± 0,21 ng/ml). Gefrierzyklen wirkten sich auch auf die NGAL-Werte nach dem dritten Frost-Tau-Zyklus aus. (Abbildung 2). Von den untersuchten Bedingungen (Zentrifugation, Frost-Tau-Zyklen und Lagertemperatur) hatte die Lagertemperatur...

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Diskussion

Die Bedeutung konsistenter und reproduzierbarer Ergebnisse beschränkt sich nicht nur auf den Erfolg einzelner Studien, sondern ermöglicht auch einen besseren Vergleich der Ergebnisse innerhalb der Literatur⁹. Unterschiede zwischen den Studien in wichtigen Verfahrensschritten können zu irreversiblen Verzerrungen führen, die sich auf die Biomarkersignale und ihre Interpretation auswirken können, was für Diskrepanzen zwischen mehreren Studien verantwortlich sei...

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Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Boric acid	Sigma-Aldrich	B6768	To be considered for samples that cannot be rapidly processed and frozen
Freezer boxes	Fisher Scientific	03-395-464
Microcentrifuge tubes	Thomas scientific	1149X93
NGAL ELISA Kit	R&D Systems	DLCN20	Used to create representative results
Pipette and tips	Dependent on pipette size and volume of fluid.
Sodium azide	Sigma-Aldrich	S2002	To be considered for samples that cannot be rapidly processed and frozen
Urine collection cups	Thermo Scientific	3122B03ORG	Sterile cups not required unless needed for other studies