Normotherme Unterdruckbeatmung ex situ Lungenperfusion: Beurteilung der Lungenfunktion und des Lungenstoffwechsels

Zusammenfassung

In diesem Artikel wird ein porcines Modell der Unterdruckbeatmung ex situ Lungenperfusion beschrieben, einschließlich Beschaffung, Befestigung und Management auf der maßgeschneiderten Plattform. Der Fokus liegt auf Anästhesie- und Operationstechniken sowie auf der Fehlersuche.

Zusammenfassung

Die Lungentransplantation (LTx) ist nach wie vor der Behandlungsstandard für Lungenerkrankungen im Endstadium. Ein Mangel an geeigneten Spenderorganen und Bedenken hinsichtlich der Qualität der Spenderorgane, die durch übermäßige geografische Transportdistanzen und strenge Aufnahmekriterien für Spenderorgane verschärft werden, schränken die derzeitigen LTx-Bemühungen ein. Die Ex-situ-Lungenperfusion (ESLP) ist eine innovative Technologie, die sich als vielversprechend erwiesen hat, um diese Einschränkungen abzuschwächen. Die physiologische Beatmung und Perfusion der Lunge außerhalb des Entzündungsmilieus des Spenderkörpers bietet der ESLP mehrere Vorteile gegenüber der traditionellen kaltstatischen Konservierung (CSP). Es gibt Hinweise darauf, dass die Unterdruckbeatmung (NPV) ESLP der Überdruckbeatmung (PPV) ESLP überlegen ist, wobei PPV eine signifikantere beatmungsinduzierte Lungenschädigung, eine proinflammatorische Zytokinproduktion, ein Lungenödem und eine Bullae-Bildung induziert. Der NPV-Vorteil ist möglicherweise auf die homogene Verteilung des intrathorakalen Drucks über die gesamte Lungenoberfläche zurückzuführen. Die klinische Sicherheit und Machbarkeit eines kundenspezifischen NPV-ESLP-Geräts wurde kürzlich in einer klinischen Studie mit menschlichen Lungen mit Extender-Kriterien (ECD) nachgewiesen. In dieser Arbeit wird die Verwendung dieser kundenspezifischen Vorrichtung in einem juvenilen Schweinemodell von normothermem NPV-ESLP über eine Dauer von 12 Stunden beschrieben, wobei besonderes Augenmerk auf Managementtechniken gelegt wird. Die präoperative Vorbereitung, einschließlich der Initialisierung der ESLP-Software, des Primings und der Entlüftung des ESLP-Schaltkreises sowie der Zugabe von antithrombotischen, antimikrobiellen und entzündungshemmenden Wirkstoffen, wird spezifiziert. Die intraoperativen Techniken der zentralen Entnahme von Leitungen, der Lungenbiopsie, der Ausblutung, der Blutentnahme, der Kardiktomie und der Pneumonektomie werden beschrieben. Darüber hinaus wird ein besonderer Fokus auf anästhesische Überlegungen gelegt, wobei die Anästhesieeinleitung, -erhaltung und -dynamik skizziert werden. Das Protokoll gibt auch die Initialisierung, Wartung und Beendigung der Perfusion und Beatmung durch das benutzerdefinierte Gerät an. Dynamische Organmanagementtechniken, einschließlich Veränderungen der Beatmung und der Stoffwechselparameter zur Optimierung der Organfunktion, werden ausführlich beschrieben. Abschließend wird die physiologische und metabolische Beurteilung der Lungenfunktion charakterisiert und in den repräsentativen Ergebnissen dargestellt.

Einleitung

Die Lungentransplantation (LTx) ist nach wie vor die Standardtherapie bei Lungenerkrankungen im Endstadium¹; LTx weist jedoch erhebliche Einschränkungen auf, darunter eine unzureichende Nutzung der Spenderorgane² und eine Wartelistensterblichkeit von 40 %³, die höher ist als bei jeder anderen Transplantation solider Organe ^4,5. Die Nutzungsraten der Spenderorgane sind aufgrund von Bedenken hinsichtlich der Organqualität niedrig (20-30%). Übermäßige geografische Transportdistanzen und strenge Kriterien für die Akzeptanz von Spenderorganen verschärfen diese Qualitätsbedenken. LTx hinkt auch anderen soliden Organtransplantationen in Bezug auf langfristige Transplantate und Patientenergebnisse hinterher². Die primäre Transplantatdysfunktion (PID), die am häufigsten durch eine ischämische Reperfusionsschädigung (IRI) verursacht wird, stellt die Hauptursache für die 30-Tage-Mortalität und Morbidität nach LTx dar und erhöht das Risiko für eine chronische Transplantatdysfunktion ^6,7. Bemühungen, IRI zu verringern und sichere Transportzeiten zu verlängern, sind von größter Bedeutung, um die Patientenergebnisse zu verbessern.

Die Ex-situ-Lungenperfusion (ESLP) ist eine innovative Technologie, die sich als vielversprechend erwiesen hat, um diese Einschränkungen abzuschwächen. ESLP erleichtert die Erhaltung, Beurteilung und Rekonditionierung von Spenderlungen vor der Transplantation. Es hat zufriedenstellende kurz- und langfristige Ergebnisse nach der Transplantation von ECD-Lungen (Extended Criteria Donor) gezeigt, was zu einer Erhöhung der Anzahl geeigneter Spenderlungen für LTx beigetragen hat, wobei die Organnutzungsraten in einigen Zentren um 20 % gestiegen^sind 8,9,10. Im Vergleich zum aktuellen klinischen Standard für LTx, der kaltstatischen Konservierung (CSP), bietet ESLP mehrere Vorteile: Die Organerhaltungszeit ist nicht auf 6 h begrenzt, die Beurteilung der Organfunktion ist vor der Implantation möglich, und aufgrund der kontinuierlichen Organperfusion können Modifikationen am Perfusat vorgenommen werden, die die Organfunktion optimieren¹¹.

Die überwiegende Mehrheit der aktuellen ESLP-Geräte, die für den menschlichen Gebrauch entwickelt wurden, verwenden eine Überdruckbeatmung (PPV). Neuere Literatur hat jedoch gezeigt, dass diese Beatmungsstrategie der ESLP der Unterdruckbeatmung (NPV) unterlegen ist, wobei PPV eine signifikantere beatmungsinduzierte Lungenschädigung induziert^12,13,14,15. Sowohl in der menschlichen als auch in der Schweinelunge zeigt NPV-ESLP im Vergleich zur Überdruck-Ex-situ-Lungenperfusion (PPV-ESLP) eine überlegene Organfunktion in verschiedenen physiologischen Bereichen, einschließlich der proinflammatorischen Zytokinproduktion, des Lungenödems und der Bullae-Bildung¹⁵. Die homogene Verteilung des intrathorakalen Drucks über die gesamte Lungenoberfläche in NPV-ESLP wurde als ein signifikanter Faktor vorgeschlagen, der diesem Vorteil zugrunde liegt^15,16. Zusätzlich zu den präklinischen Vorteilen wurden die klinische Sicherheit und Durchführbarkeit von NPV-ESLP in einer kürzlich durchgeführten klinischen Studie nachgewiesen¹⁷. Unter Verwendung eines neuartigen NPV-ESLP-Geräts wurden zwölf menschliche Spenderlungen mit erweiterten Kriterien erfolgreich erhalten, bewertet und anschließend mit einer Überlebensrate von 100 % nach 30 Tagen und 1 Jahr transplantiert.

Das Ziel des vorliegenden Manuskripts ist es, ein Arbeitsprotokoll des NPV-ESLP-Geräts unseres Labors unter Verwendung von juvenilen Schweinelungen unter normothermen Bedingungen über einen Zeitraum von 12 Stunden zu demonstrieren. Die chirurgische Entnahme wird ausführlich behandelt, und die Einleitung, Verwaltung und Beendigung unserer kundenspezifischen Softwareplattform werden ebenfalls beschrieben. Die Strategie für die Gewebeentnahme und das Management der Proben wird ebenfalls erläutert.

Protokoll

Die in diesem Manuskript durchgeführten Verfahren entsprechen den Richtlinien des Canadian Council on Animal Care und dem Leitfaden für die Pflege und Verwendung von Versuchstieren. Das institutionelle Tierpflegekomitee der University of Alberta genehmigte die Protokolle. Es wurden ausschließlich weibliche junge Yorkshire-Schweine zwischen 35 und 50 kg verwendet. Alle Personen, die an ESLP-Verfahren beteiligt waren, mussten eine angemessene Schulung zur biologischen Sicherheit durchführen. Eine schematische Übersicht über das gesamte NPV-ESLP-Experiment ist in Abbildung 1 dargestellt.

1. Präoperative Vorbereitungen

1. Positionieren Sie die Orgelkammer auf dem ESLP-Wagen und montieren Sie die Silikon-Stützmembran (siehe Materialtabelle) zur Aufhängung an den Kammerhaken.
2. Montieren Sie den ESLP-Schlauch, den Sauerstoffentzieher, den arteriellen Filter und die Kreiselpumpe.
3. Verbinden Sie die Wasserleitungen des Wärmetauschers mit dem Desoxygenator sowie den Sweepgasschlauch.
4. Führen Sie die Temperaturfühlersonde (siehe Materialtabelle) in den Desoxygenator ein.
5. Befestigen Sie den Flusswandler der Pulmonalarterie (PA) (siehe Materialtabelle) am PA-Schlauch.
   Anmerkungen: Der Durchflussgeber verwendet Ultraschall, um den Durchfluss zu messen und an die Kreiselpumpe weiterzuleiten.
6. Verwenden Sie einen Dreiwegehahn, um den PA-Druckaufnehmer an der PA-Kanüle zu befestigen.
7. Befestigen Sie alle Schlauchverbindungen fest, um Undichtigkeiten zu vermeiden, und schließen Sie alle Absperrhähne und Luer-Schlösser, bevor Sie das Perfusat hinzufügen.
8. Füllen Sie den Kreislauf mit 1000 ml modifiziertem Perfusat (CHIP) für gängige Krankenhausinhaltsstoffe.
   HINWEIS: CHIP ist ein maßgeschneidertes, kostengünstiges Perfusat mit einer onkotischen Messung von 35 mmHg, vergleichbar mit proprietären Perfusatlösungen¹⁸.
9. Starten Sie die Software, nachdem der Kreislauf entlüftet wurde, um das Entlüften der Pumpe und der Leitungen zu erleichtern.
   HINWEIS: Diese Schritte sind mit Abbildung 2 und Abbildung 3 verknüpft.

2. ESLP-Software-Initialisierung, -Einstellungen und -Entlüftungsschaltung

1. Klicken Sie auf die Programmverknüpfung auf dem Monitor, um das ESLP-Programm zu starten. Wählen Sie " Scannen", " Warenkorb 3", " Verbinden", dann " NPV-Programm" und dann "Software initiieren".
2. Erhöhen Sie auf der Hauptseite nach dem Ansaugen des Kreislaufs die Durchflussdrehzahl auf 900, um Luft aus dem Kreislauf zu treiben und den Perfusatfluss durch die PA-Kanüle mit einem stetigen Flüssigkeitsstrom zu demonstrieren.
3. Fügen Sie dem Kreislauf 3,375 g Piperacillin-Tazobactam, 10.000 Einheiten Heparin (10.000 U/1,5 l Perfusat = 6,66 U/l) und 500 mg Methylprednison hinzu.
4. Nehmen Sie eine arterielle Blutgasprobe (ABG) des Perfusats zu Referenzzwecken.
5. Drehen Sie auf der Hauptseite CPAP auf bis zu 20 cm H₂Ø (max.) und schalten Sie es ein, um die Funktion zu überprüfen. Schalten Sie das Gerät aus, sobald der Vorgang bestätigt ist.
6. Drehen Sie EIP auf der Hauptseite auf -5 cm H₂0 und schalten Sie es ein, um die Funktion zu überprüfen. Schalten Sie das Gerät aus, sobald der Vorgang bestätigt ist.
7. Schalten Sie auf der Seite Einstellungen die Heizung ein (klicken Sie auf Heizung starten) und bestätigen Sie die Funktion. Ändern Sie den Temperatursollwert an den Monitoren und bestätigen Sie eine kongruente Änderung am Heizungswächter des Wagens. Schalten Sie das Gerät aus, sobald der Vorgang sichergestellt ist.
   HINWEIS: Das hier verwendete ESLP-Gerät ist mit einem kundenspezifischen Softwareprogramm ausgestattet (Abbildung 4). Das Programm ermöglicht die Steuerung der Pumpendrehzahl und der Beatmungsparameter, um den gewünschten PA-Fluss, den kontinuierlichen positiven Atemwegsdruck (CPAP), den endexspiratorischen Druck (EEP), den endinspiratorischen Druck (EIP), die Atembeziehung (RR) und das inspiratorische: exspiratorische (I:E) Verhältnis zu erreichen und aufrechtzuerhalten. Die Software berechnet Funktionsparameter und Druck-Volumen-Kreisläufe. Tabelle 1 listet alle von der Software bereitgestellten Überwachungsparameter auf.

3. Vorbereitungen für die Anästhesie

1. Ketamin (20 mg/kg) und Atropin (0,05 mg/kg) (intramuskuläre Injektionen) im Operationssaal als Prämedikation für das Spenderschwein verabreichen.
2. Legen Sie das Schwein in Rückenlage auf einen beheizten Operationstisch. Behalten Sie die Normothermie bei und fahren Sie mit der Maskeninduktion fort.
3. Titrate des Sauerstoffflusses in Übereinstimmung mit dem Tiergewicht, typischerweise 20-40 ml/kg.
4. Verabreichen Sie Isofluran zunächst in einer Dosierung von 4-5%. Dann nach 1-2 Minuten auf 3% reduzieren.
5. Beurteilen Sie die Tiefe der Anästhesie alle 5 Minuten. Stellen Sie sicher, dass das Schwein keinen Rückzugsreflex als Reaktion auf einen schädlichen Reiz hat.
6. Sobald die richtige Anästhesietiefe bestätigt ist, intubieren Sie das Schwein.
7. Streben Sie eine Sauerstoffsättigung von über 90 % an, indem Sie eine Pulsoximetersonde auf der Zunge (bevorzugt) oder am Ohr platzieren.
8. Stellen Sie den Sauerstofffluss (20-40 ml/kg) und das Inhalationsgas (1-3%) ein, um das Anästhesieniveau aufrechtzuerhalten.
9. Halten Sie die Beatmungseinstellungen bei einem Fernseher 6-10 ml/kg, Atemfrequenz von 12-30 Atemzügen/min, PEEP 5 cm H 2 O,Spitzendruck 20 cm H₂O.
10. Rasieren und waschen Sie sich mit Jod, um die Einschnittstelle vorzubereiten.

4. Lungenbiopsie, Ausblutung und Blutentnahme

1. Legen Sie eine zentrale Leitung für die Verabreichung von Flüssigkeit und Heparin ein.
   1. Machen Sie einen 5-8 cm langen Schnitt in der Mittellinie mit Elektrokauter, der über der Luftröhre zentriert ist und sich kranial von der Sternumkerbe erstreckt.
   2. Teilen Sie mit dem Kauter die Haut und das Unterhautfett.
   3. Um das linke oder rechte intravaskuläre Karotisbündel lateral der Luftröhre zu identifizieren, teilen Sie die Mittellinienebene zwischen den Gurtmuskeln und trennen Sie die Bindegewebsschichten.
   4. Verwenden Sie 2-0 Seidenbänder als Gefäßschlaufen, um eine distale und proximale Kontrolle über die Halsvene zu erhalten.
   5. Um den Blutfluss zu kontrollieren, binden Sie das kraniale umlaufende Band zusammen und ziehen Sie es am proximalen Band nach oben zurück.
   6. Um eine 7 Fr Mittellinie unterzubringen, machen Sie mit der Metzenbaum-Schere einen kleinen Schnitt in der Vene (~1/3 des Gefäßumfangs).
   7. Lösen Sie die Spannung an der proximalen Gefäßschlaufe und kanülieren Sie gleichzeitig die Vene. Binden Sie die Seide fest, um die Kanüle in einer Tiefe von 10 cm in der Vene zu befestigen.
   8. Schließen Sie eine Infusionsleitung mit 0,9 % normaler Kochsalzlösung an, nachdem Sie die Leitung mit Heparin (1 Einheit/ml) gespült haben. Wenn das Schwein aufgrund von Dehydrierung intravaskulär erschöpft ist, verabreichen Sie die Flüssigkeit. Hep-Lock für alle ungenutzten Ports.
2. Führen Sie eine mediane Sternotomie durch
   1. Identifiziere die sternale Kerbe und die Xipoidfortsätze als inzisionale Orientierungspunkte.
   2. Verwenden Sie Elektrokauter, um einen Mittellinienschnitt zu machen, der sich über das gesamte Brustbein erstreckt (ca. 40-50 cm) und den vorherigen Schnitt an der Sternumkerbe mit dem Xiphoid verbindet.
   3. Teilen Sie das Unterhautgewebe und die Faszie zwischen den Fasern des Musculus pectoralis major auf. Kauterisieren Sie alle blutenden Gefäße, um die Hämostase aufrechtzuerhalten.
   4. Verwenden Sie Elektrokauter, um die Mittellinie entlang des Brustbeins zu markieren. Verwenden Sie eine schwere Schere, um das Xiphoid zu schneiden, und spräparieren Sie mit einem Finger stumpf das Perikard vom hinteren Tisch des Brustbeins, um einen tastbaren Raum für die Sternumsäge zu schaffen.
   5. Legen Sie zwei Handtuchklammern auf gegenüberliegenden Seiten des Brustbeins auf Höhe der 4. Rippen seitlich des costochondralen Übergangs an. Kaufen Sie die darüber liegende Gewebe- und Faszienschicht innerhalb der Handtuchclips und heben Sie das Brustbein während der Sternotomie senkrecht vom Herzen weg.
   6. Führen Sie die Sternotomie mit einer elektrischen oder druckluftbetriebenen Säge mit den Zähnen nach oben durch, beginnend mit dem Xiphoid in Richtung der Brustbeinkerbe. Um Verletzungen der darunter liegenden Strukturen (z. B. Perikard und Vena brachiocephalica sowie Arteria innominata) zu vermeiden, gehen Sie mit der Säge schrittweise vor und ziehen Sie sie mit Handtuchklammern senkrecht zurück.
      HINWEIS: Das Brustbein taucht tief nach hinten in die Sternumkerbe ein, und die Säge muss nach hinten gerichtet werden, um die Sternotomie auf dieser Höhe abzuschließen.
   7. Verwenden Sie Kauterisation, um eine Hämostase des blutenden Brustbeins zu erreichen.
      HINWEIS: Hierfür kann auch Knochenwachs verwendet werden.
   8. 1.000 E/kg Heparin intravenös verabreichen. Nehmen Sie 5 Minuten nach der Verabreichung von Heparin eine In-vivo-Blutprobe .
   9. Verwenden Sie einen Finger, um die Pleura stumpf vom inneren Brustbein zu präparieren, um Platz für den Brustbeintraktor zu schaffen.
   10. Führen Sie einen Brustbeinretraktor mit einem Griff in Richtung Bauch ein und ziehen Sie ihn allmählich zurück, um das Mediastinum vollständig freizulegen.
3. Entfernen Sie den Thymus aus dem Perikard mit einer Kombination aus stumpfer Präparation mit dem Finger und Elektrokauterisation.
   Anmerkungen: Es ist am besten, den Thymus als ein großes Stück und nicht als kleine Stücke zu entfernen.
4. Nehmen Sie eine Biopsie des rechten oberen Lungenlappens zur Gewebeanalyse: Öffnen Sie die rechte Pleura, um den rechten Oberlappen freizulegen. Umkreisen Sie eine 1 cm³ große Portion mit 0-Seide, binden Sie diesen Teil der Lunge zusammen und schneiden Sie ihn mit einer Metzenbaum-Schere heraus.
   1. Teilen Sie die Biopsie in drei gleich große Portionen auf und legen Sie jeweils eine in Gel, Formalin und flüssigen Stickstoff (Snap Freeze) mit optimaler Schnitttemperatur (OCT).
   2. Lagern Sie die OCT- und schockgefrorenen Proben in einem Gefrierschrank bei -80 °C und lagern Sie die Formalinproben in einem 4 °C-Kühlschrank mit einem ordnungsgemäß verschlossenen Behälter.
      HINWEIS: Biopsieproben werden mit Hämatoxylin-Eosin-Färbung gefärbt, um die Histopathologie der Lungenschädigung zu untersuchen, einschließlich interstitieller Ödeme, alveolärer und interstitieller Entzündungen, interstitieller und perivaskulärer neutrophiler Infiltrate und Blutungen¹⁵.
5. Öffnen Sie den Herzbeutel. Zelten Sie den Herzbeutel mit einer Pinzette und machen Sie mit einer Metzenbaum-Schere einen Schnitt in der Mittellinie des Herzbeutels.
   1. Setzen Sie diesen Schnitt kranial bis zur Aortenwurzel fort, dann lateral, um die obere Hohlvene (SVC) freizulegen. Führen Sie die Perikardiotomie kaudal durch und entfernen Sie den Schnitt links und rechts auf Höhe der Herzspitze.
6. Euthanasiere das Schwein durch Ausbluten. Schneiden Sie das SVC ein und führen Sie eine Poole-Saugspitze (siehe Materialtabelle) in das Lumen ein, wobei die Saugspitze in die untere Hohlvene (IVC) vorgeschoben wird.
   HINWEIS: In der Vorderwand des linken Vorhofs (LA) wird ein Schnitt gemacht, um die Ausblutung zu beschleunigen.
   1. Heben Sie die Herzspitze an und schneiden Sie den LA 1 cm unterhalb der Koronarhöhle mit einer Metzenbaum-Schere ein. Bei der Ausblutung von 100 % O₂ auf Raumluft umstellen.
7. Entnahme von Vollblut: Die Poole-Spitzenabsaugung ist mit einem Zellschoner verbunden, um 1200 ml Vollblut zu sammeln, das abgeschleudert wird, um 500 ml verpackte rote Blutkörperchen (pRBC) zu produzieren.
   HINWEIS: Einstellung des Cell Saver-Protokolls: Füllfluss: 300 ml/min, Waschfluss: 100 ml/min, Leerfluss: 150 ml/min, Rückfluss: 150 ml/min, Waschvolumen: 300 ml, Konzentrationsfluss: 200 ml/min. Dies dauert ~5 Minuten.

5. Kardektomie

1. Führen Sie die Kardektomie durch: Heben Sie die Herzspitze kranial an und setzen Sie den vorherigen LA-Schnitt seitlich fort, um den Koronarsinus zu durchtrennen, wo die linke Hemi-Azygotenvene in ihn mündet.
2. Teilen Sie den LA, indem Sie medial über die vordere Oberfläche der PA-Bifurkation schneiden.
3. Transektieren Sie den IVC 1 cm über dem Zwerchfell. Verbinden Sie diesen Schnitt mit dem LA, indem Sie medial schneiden.
4. Vervollständigen Sie die Teilung des LA, indem Sie entlang der Oberseite der rechten Pulmonalarterie in Richtung der PA-Bifurkation schneiden.
   HINWEIS: Bei diesem Schritt wird die rechte obere Pulmonalvene aus der hinteren LA ausgeschlossen.
5. Heben Sie den IVC kranial an und durchtrennen Sie die rechte obere Lungenvene. Teilen Sie die perikardialen Reflexionen, die zwischen der Haupt-PA und dem rechten Atrium (RA)/SVC verschmelzen.
6. Legen Sie das Herz ab und durchtrennen Sie das SVC. Trennen Sie die SVC posterior von der Bindegewebsschicht und durchtrennen Sie die Azygotenvene.
7. Heben Sie das Herz kranial an, teilen Sie die PA auf Höhe der Pulmonalklappe. Die Aorta wird mit der Metzenbaum-Schere teilweise von der PA präpariert und anschließend die aufsteigende Aorta durchtrennt.
   HINWEIS: Damit ist die Herzrektomie abgeschlossen.

6. Pneumonektomie

1. Führen Sie die Pneumonektomie durch: Vergewissern Sie sich, dass das exspiratorische Tidalvolumen (TVe) ca. 10 ml/kg beträgt. Wechseln Sie zu einem inspiratorischen: exspiratorischen Verhältnis von 2:1, um dieses Ziel zu erreichen. Wenn der TV < 6 ml/kg bleibt, erhöhen Sie den Spitzendruck und/oder den PEEP, um das Ziel von 8-10 ml/kg für eine maximale alveoläre Rekrutierung zu erreichen.
2. Öffne die Pleura auf der linken Seite des Schweins. Machen Sie mit einer Metzenbaum-Schere einen horizontalen Schnitt entlang des hinteren Tisches des Brustbeins. Machen Sie zwei vertikale Schnitte entlang der Pleura bis zum Zwerchfellnerv am oberen und unteren Rand des Mediastinums.
   1. Exzizieren Sie die Pleura, indem Sie entlang des Zwerchfellnervs schneiden. Wiederholen Sie diesen Schritt auf der rechten Seite. Öffnen und entfernen Sie die Zwerchfellpleura in ähnlicher Weise, wobei die hintere LA-Manschette als untere Grenze verwendet wird, ähnlich wie beim Nervus phrenicus.
3. Teilen Sie die Pleuraansätze vom Zwerchfell in Richtung des linken unteren Lungenlappens. Verwenden Sie einen Deaver-Retraktor (siehe Materialtabelle), um die Membran nach oben zu halten. Teilen Sie das untere Pulmonalband auf der linken Seite und fahren Sie weiter nach oben in Richtung Hilum.
4. Versuchen Sie es mit einer "No-Touch-Technik" in Bezug auf das Lungengewebe selbst.
   Anmerkungen: Das heißt, versuchen Sie, die Lunge nur minimal manuell zu manipulieren, um ein Trauma zu vermeiden.
5. Trennen Sie auf der rechten Seite die IVC- und Pleurabefestigungen vom Zwerchfell. Ziehen Sie die Membran mit dem Deaver-Retraktor nach oben zurück. Durchtrennen Sie das untere Pulmonalband auf der rechten Seite und fahren Sie weiter nach oben in Richtung Hilum.
6. Teilen Sie die innominaten Venen und bogen Sie die Gefäße, um die Luftröhre freizulegen.
7. Präpariere stumpf das Gewebe, das die Luftröhre umgibt. Bei einem exspiratorischen Tidalvolumen (TVe) von ca. 10 ml/kg wird die Luftröhre mit einer Schlauchklemme bei maximaler Inhalation geklemmt.
8. Durchtrennen Sie die Luftröhre und heben Sie den eingeklemmten Teil für die verbleibenden Schritte nach oben, um die chirurgische Traktion zu gewährleisten.
9. Präparieren Sie die hintere Luftröhre aus der Speiseröhre durch stumpfe Dissektion mit einer schweren Metzenbaum-Schere und einer freien Hand. Teilen Sie alle verbleibenden Pleuraansätze, durchschneiden Sie die Aorta oberhalb und unterhalb des linken Bronchus und entfernen Sie die Lunge aus dem Brustkorb mit einem Segment der absteigenden Aorta.
10. Wiegen Sie die Lunge mit der Klemme und bewahren Sie sie schnell in einer Kühlbox voller Eis auf. Die Gewichtszunahme während des ESLP-Laufs ist ein Indikator für die Bildung von Ödemen.
    HINWEIS: Damit ist die Pneumonektomie abgeschlossen.

7. Platzierung der Lunge auf dem ESLP-Gerät

1. 500 ml pRBC werden in den Perfusionskreislauf gegeben (zuvor mit 1 l CHIP geprimt, Schritt 1.8), um ein Endvolumen von 1,5 l Perfusat zu erreichen.
   HINWEIS: Die Hämoglobinkonzentration liegt bei ca. 50 g/L oder einem Hämatokrit von 15%.
2. Machen Sie Fotos von der Lunge für Datensätze.
3. Biopsie des rechten mittleren Lungenlappens. Umkreisen Sie einen 1 cm³ großen Abschnitt mit 0-Seide, binden Sie diesen Teil der Lunge zusammen und entfernen Sie ihn mit einer Schere zur Gewebeanalyse, wie zuvor beschrieben (Schritt 4.4).
4. Befestigen Sie den 3/8-, 1/2-Zoll-Schlauchadapter an der Hauptpulmonalarterie (mPA). Fassen Sie gegenüberliegende Seiten des mPA mit Hilfe von Druckknöpfen. Setzen Sie den Adapter mit dem 1/2-Zoll-Teil in das mPA ein und halten Sie ihn fest, während ein Assistent den Adapter mit 0-Seidenbändern in Position hält.
   HINWEIS: Der Adapter sollte 2-3 cm über der PA-Bifurkation sitzen (wenn die PA eine unzureichende Länge hat, kann ein Segment der absteigenden Aorta des Spenderschweins durchgehend auf das mPA genäht werden, um zusätzliche Länge zu erhalten).
5. Legen Sie die Lunge in Rückenlage auf die Silikon-Stützmembran und verbinden Sie sie mit dem ESLP-Gerät.
6. Platzieren Sie eine zweite Schlauchklemme auf der Luftröhre in der Nähe der Position des Trachealbronchus. Entfernen Sie die distalere Klemme und intubieren Sie die Luftröhre mit dem Endotrachealtubus (ETT).
   1. Befestigen Sie das ETT mit zwei Kabelbindern. Klemmen Sie die Beatmungsleitung mit einer Schlauchklemme ab und lösen Sie die proximale Klemme von der Luftröhre.
      Anmerkungen: Die Lunge bleibt aufgeblasen, wenn dies richtig gemacht wird und es keine Luftlecks gibt.
7. Schließen Sie den PA-Adapter an die PA-Leitung an und entlüften Sie den mPA. Starten Sie den Timer für die Perfusion.
   HINWEIS: In Abbildung 5 finden Sie eine fotografische Darstellung der Schritte.

8. Initiierung der Perfusion und Beatmung

1. Klicken Sie auf der Seite Einstellungen auf Heizung starten und stellen Sie die Temperatur auf 38 °C ein. Geben Sie auch das Gewicht des Schweins ein, um das Herzzeitvolumen (Flow) zu berechnen.
2. Stellen Sie auf der Hauptseite den CPAP-Wert auf 20 cm H₂Ø ein und klicken Sie auf CPAP starten. Wenn die Belüftung beginnt, klemmen Sie die Lüftungsleitung ab.
3. Setzen Sie den arteriellen Drucksensor auf Null. Klemmen Sie die PA-Leitung über dem Drucksensor mit einer Schlauchschelle ein. Öffnen Sie den Sensor für Raumluft, klicken Sie auf der Seite Einstellungen auf ZERO PAP und Zero Bld Flow und bestätigen Sie dann, dass die Messwerte auf der Hauptseite auf Null gesetzt sind.
   1. Schließen Sie den Absperrhahn des Drucksensors, um den Leitungsdruck abzulesen, öffnen Sie die Leitung zur PA-Kanüle, wählen Sie auf der Hauptseite 10 % Herzzeitvolumen aus, klicken Sie auf Zurück zum PA-Handbuch (Schaltfläche wird grün) und klemmen Sie dann die PA-Leitung ab.
      HINWEIS: Die Leitung ist jetzt korrekt auf Null gesetzt und die Pumpe fließt jetzt 10 % des berechneten Herzzeitvolumens.
4. Ziehen Sie 10 ml Perfusat für die Zentrifugalanalyse und zeichnen Sie eine Zeit Null (T0) ABG.
5. Sobald die Lunge 10 Minuten lang durchblutet ist, erhöhen Sie den Fluss auf 20 % des Herzzeitvolumens.
6. Wenn die Perfusattemperatur 32 °C erreicht, befestigen Sie den Kammerdeckel mit Klemmen, um einen luftdichten Verschluss zu schaffen. Positionieren Sie die Lunge optimal, bevor Sie den Deckel aufsetzen. Reparieren Sie alle Luftlecks mit Prolen der Größe 6-0 an BV-1-Nadeln.
7. Klemmen Sie bei geschlossenem Deckel den Beatmungsschlauch fest und schalten Sie CPAP aus. Klicken Sie auf der Seite " Einstellungen " auf "Zero ITP", "Zero Paw", "Zero Air Flow" und bestätigen Sie dann, dass die Messwerte auf der Hauptseite auf Null gesetzt werden.
   1. Klicken Sie bei 20 cm H₂Ø auf CPAP starten und klemmen Sie den Beatmungsschlauch ab. Stellen Sie als Nächstes das EEP-Ziel auf 0cm H 2 O, EIP auf 1 cm H₂0, RR 10, I:E-Verhältnis 1:1 ein und klicken Sie auf Drücken, um die Entlüftung zu starten, um die Unterdruckbeatmung zu aktivieren.
   2. Hören Sie, wie die Entlüftung ihre Funktion ändert, und befestigen Sie dann den Belüftungsschlauch des seitlichen Anschlusses an der Kammer.
      HINWEIS: Das Beatmungsgerät beginnt seinen Atemzyklus mit der Ausatmung. Die Lunge drückt sich leicht zusammen, wenn der seitliche Port beim Ausatmen befestigt wird. Es ist vorzuziehen, zu warten und auf die Inhalation zu hören und dann den seitlichen Anschluss anzuschließen, um die Rekrutierung zu maximieren.
8. Verringern Sie in den nächsten Atemzügen den CPAP-Wert auf 12 cm H2O, während Sie gleichzeitig den EIP auf -9 cm H2O erhöhen. Halten Sie diese Beatmungsparameter in der ersten Stunde aufrecht, reduzieren Sie dann den CPAP-Wert auf 8-10 cmH2O, abhängig von der Alveolarrekrutierung, und erhöhen Sie den EIP auf -₁₂bis -13_cmH2O.
9. Stellen Sie den Spitzendruck auf 20-21 cm H₂O ein.
   HINWEIS: Wenn zum Zeitpunkt der Pneumonektomie höhere Drücke erforderlich waren, wird dies zum Zielspitzendruck.
10. Wenn die Perfusattemperatur 35 °C erreicht, erhöhen Sie den Durchfluss auf 30 % des Herzzeitvolumens.
    HINWEIS: Dies sind die Einstellungen für die Organkonservierung (Tabelle 2).
11. Nach 3, 5, 7, 9, 11 h mit einem Durchfluss von 50 % des Herzzeitvolumens und der Zugabe von gemischtem Sweepgas (89 % N 2, 8 % CO 2, 3 % O₂), das dem Desoxygenator mit 0,125 l/min zugesetzt wird, um die systemische Sauerstoffnutzung zu simulieren (Tabelle 3).
12. Ziehen Sie während des Konservierungsmodus zu jeder ungeraden Stunde eine 10-ml-Probe Perfusat für zukünftige Analysen. Entnahme einer 1-ml-ABG-Probe vor dem Desoxygenator jede Stunde.
13. Nach 5 Minuten Evaluierungsmodus werden ABGs aus den Anschlüssen vor und nach dem Desoxygenator entnommen (Tabelle 4).
    HINWEIS: Damit ist die Platzierung der Lunge auf ESLP und die Initiierung der Perfusion und Beatmung abgeschlossen. Siehe Tabelle 2 für die Initiierung des Protokolls. In Tabelle 3 sind die beiden Modi des NPV-ESLP aufgeführt.

9. Stoffwechselunterstützung der Lunge

1. Überprüfen Sie den Perfusat-Glukosespiegel stündlich über die ABG-Analyse. Setzen Sie die Glukose auf 3-6 mmol/l und titrieren Sie entsprechend den Verbrauchsraten mit einer Standard-Infusionspumpe für eine kontinuierliche Glukoseinfusion und Bolusdosen nach Bedarf.
   Anmerkungen: Eine weitere Infusionspumpe gibt eine kontinuierliche Infusion von 2 U/h Insulin ab. CHIP enthält, wie die meisten anderen Organperfusionslösungen, Glukose als primäres Energiesubstrat.

10. Heparin, antimikrobielle und entzündungshemmende Wirkstoffe

1. Fügen Sie dem Perfusion zu Beginn der Perfusion 10.000 Einheiten Heparin hinzu, bevor Sie pRBC hinzufügen.
2. Fügen Sie dem Perfusat zu Beginn der Perfusion 3,375 g Piperacillin-Tazobactam hinzu, bevor Sie pRBC hinzufügen.
3. Fügen Sie dem Perfusat zu Beginn der Perfusion 500 mg Methylprednisolon hinzu, bevor Sie pRBC hinzufügen.

11. Beurteilung der Lungenfunktion

1. Verwenden Sie die beiden unterschiedlichen Modi der Beatmung und Perfusion während eines ESLP-Laufs: Konservierung und Auswertung.
   HINWEIS: Weitere Informationen finden Sie unter Konservierung und Bewertung (Tabelle 3). Erhaltungsmodus: Herzzeitvolumen 30%, PEEP 8-12, EEP 0, EIP -10 bis -12, Spitzendruck 20-22 cm_H2O, RR 6-10 und I:E-Verhältnis 1:1-1,5. ESLP-Läufe dauern in der Regel 12 Stunden, können aber auch auf 24 Stunden verlängert werden.
2. Stellen Sie den Spitzendruck so ein, dass er dem Spitzendruck der Pneumonektomie entspricht, und erreichen Sie einen Ziel-TV von 10 ml/kg.
   HINWEIS: Obwohl ein TVe von 10 ml/kg angestrebt wird, werden im Allgemeinen 6-8 ml/kg erreicht.
3. Führen Sie während der Konservierung alle 30 Minuten eine Rekrutierung von 30 Minuten oder weniger durch.
   HINWEIS: Die Dauer und der Umfang der Rekrutierung hängen von der erreichten TVe ab. Wenn TVe 8-10 ml/kg betragen, ist keine weitere Rekrutierung erforderlich.
4. Erhöhen Sie für die Rekrutierung den PEEP auf 10-12 cm H2O, verringern Sie RR auf 6 Atemzüge/min, erhöhen Sie den Spitzendruck um 2-4 cm H 2 0, ohne 30 cm H₂O zu überschreiten (selten überschreiten wir 25 cm_H2O) und ändern Sie das I:E-Verhältnis auf 1:0,5.
   HINWEIS: Im Allgemeinen werden nur ein oder zwei dieser Änderungen pro 30-Minuten-Intervall vorgenommen, wobei die Erhöhung des PEEP und des Spitzendrucks am effektivsten ist.
5. Nach 3, 5, 7, 9, 11 Uhr die Organfunktion beurteilen.
   HINWEIS: Der wichtigste Parameter von Interesse ist das PF-Verhältnis; Die dynamische Nachgiebigkeit und die PA-Drücke werden jedoch genau überwacht (Abbildung 6).
6. Erhöhen Sie während der Auswertung das Herzzeitvolumen auf 50 %, während ein gemischtes Sweepgas (89 % N 2, 8 % CO 2, 3 % O₂) mit einer Durchflussrate von 0,125 l/min über den Desoxygenator in den Kreislauf gegeben wird.
   HINWEIS: Dies repliziert den systemischen Sauerstoffmangel und tritt über 5 Minuten auf. Verringern Sie während dieser Zeit den PEEP auf 5 cm H₂O unter Beibehaltung des Spitzendrucks und erhöhen Sie den EIP entsprechend. Halten Sie RR bei 10 bpm und stellen Sie I:E entweder auf 1 oder 1,5 ein, je nachdem, ob die Lunge Luft einzuschließen scheint oder nicht.
7. Führen Sie die Funktionsberechnungen für den pulmonalen Gefäßwiderstand, die Minutenbeatmung, die dynamische Compliance und das P/F-Verhältnis durch.
   HINWEIS: Der pulmonale Gefäßwiderstand kann wie folgt berechnet werden: [(PAP - LAP)/CO] x 80, wobei der LAP (linksatrialer Druck) aufgrund der Konstruktion eines offenen LA-Drainagesystems 0 mmHg beträgt.
   Minute Ventilation wird berechnet durch: TVexpiratory x RR
   Die dynamische Konformität wird wie folgt berechnet: TVexpiratory/EIP
   Das P/F-Verhältnis wird wie folgt berechnet: PaO2/Fi02, wobei FiO2 21 % beträgt.
   Die ESLP-Software berechnet und zeichnet automatisch und kontinuierlich Beatmungs- und Funktionsindizes auf.

12. Metabolische Beurteilung der ex situ perfundierten Lunge

1. Beurteilen Sie stündlich den Stoffwechselzustand des Perfusats über ABGs, die als Surrogatmarker für den Zustand der Lunge fungieren. Sammeln Sie 10 ml des Perfusats aus dem Anschluss des Pre-Deoxygenators für zukünftige Analysen.
   HINWEIS: Die Blutgasanalyse dient auch zur Überwachung des Gas- und Ionenzustands des Perfusats.
2. Verwenden Sie PaO2 als Marker für die allgemeine Lungenfunktion.
   HINWEIS: Dies gilt insbesondere in Evaluierungsphasen, in denen dem Kreislauf gemischtes Sweepgas zugeführt wird, um eine systemische Sauerstoffentziehung zu simulieren. Prä- und Post-Desoxygenierungsgase werden verglichen, um die Sauerstofferhöhung durch die Lunge zu beurteilen.
3. Streben Sie eine normale pH-korrekte Azidose (7,35-7,45) mit Boli von Tris-Hydroxymethylaminomethan (THAM)-Puffer an (siehe Materialtabelle).
   HINWEIS: Die Alkalose wird in der Regel nicht korrigiert und überschreitet 7,55 nicht. Der CO₂ -Sweep kann dem Kreislauf zugesetzt werden, um dies auf den Normalwert zu korrigieren oder wenn die Alkalose diesen Schwellenwert überschreitet.
4. PaCO₂ ist freizügig zu behandeln und liegt in der Regel im Bereich von 10 bis 20 mmHg.
   HINWEIS: Diese Werte werden als Zeichen für eine zufriedenstellende Belüftung interpretiert. Die Elektrolyte werden während der ESLP nicht eingestellt, sondern im Rahmen der Standard-ABG-Analyse überwacht. Laktat steigt mit zunehmender Dauer von ESLP an, ebenso wie Kalium. Natrium bleibt stabil (135-145 mmol/l) und Kalzium ist in der Regel niedrig. Tabelle 4 enthält repräsentative Ergebnisse der Perfusatanalyse von ABGs während eines 12-stündigen NPV-ESLP-Laufs bei Normothermie und 30% Herzzeitvolumen unter Verwendung eines zellulären Perfusats (Blut + CHIP).

13. Beenden der Perfusion, Beatmung und Trennung der Lunge vom ESLP-Gerät

1. Klicken Sie auf der Seite Einstellung auf Server herunterfahren.
2. Entfernen Sie den Deckel von der Kammer. Trennen Sie den PA-Adapter von der PA-Kanüle.
3. Extubieren Sie die Luftröhre. Um das Ausmaß der Ödembildung zu bestimmen, wiegen Sie die Lunge.
4. Nehmen Sie eine 1 cm³ große Gewebebiopsie des Nebenlappens und teilen Sie sie wie zuvor beschrieben in drei Stücke.
5. Führen Sie die abschließenden Gasanalysen durch, zentrifugieren Sie die Perfusatproben und lagern Sie die Gewebebiopsien wie zuvor beschrieben (Schritt 4.4).
   Anmerkungen: Zentrifugationseinstellungen: Geschwindigkeit, 112 x g; Beschleunigung, 9; Entschleunigung, 9; Temperatur, 4 °C, und Zeit, 15 min Dauer.
6. Schließen Sie das Programm. Alle aufgezeichneten Daten werden gespeichert.
7. Entsorgen Sie gemäß den institutionellen Protokollen das verbleibende Gewebe, Blut und bioaktive Materialien.
8. Reinigen Sie den ESLP-Wagen mit einem desinfizierenden Reiniger für harte Oberflächen (z. B. 70 % Ethanol) und legen Sie alle wiederverwendbaren Komponenten in einen Gefrierschrank bei -20 °C, um das Wachstum von Bakterien zu reduzieren.

Ergebnisse

Zu Beginn der Lungenperfusion und -beatmung (Erhaltungsmodus) weist die Lunge im Allgemeinen einen niedrigen pulmonalarteriellen Druck (< 10 mmHg) und eine geringe dynamische Compliance (< 10 ml/mmHg) auf, da sich das Perfusat zur Normothermie erwärmt. Yorkshire-Schweine mit einem Gewicht von 35-50 kg führen in der Regel zu einem Lungengewicht von 350-500 g. Während der ersten Stunde NPV-ESLP beträgt das gemessene exspiratorische Tidalvolumen (TVe) 0-2 ml/kg und das inspiratorische Tidalvolumen (TVi) 100-200 ml. TVe ...

Diskussion

Es gibt mehrere kritische chirurgische Schritte zusammen mit der Fehlerbehebung, die erforderlich sind, um einen erfolgreichen ESLP-Lauf zu gewährleisten. Juvenile Schweinelungen sind im Vergleich zu erwachsenen menschlichen Lungen extrem empfindlich, daher muss der beschaffende Chirurg beim Umgang mit Schweinelungen vorsichtig sein. Es ist wichtig, eine "No-Touch"-Technik auszuprobieren, um ein Trauma und eine Atelektase beim Sezieren der Lunge zu vermeiden. "No-Touch" bedeutet, dass bei der Beschaffung nur ein Minimum...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
0 ETHIBOND Green 1 x 36" Endo Loop 0	ETHICON	D8573
2-0 SILK Black 12" x 18" Strands	ETHICON	SA77G
ABL 800 FLEX Blood Gas Analyzer	Radiometer	989-963
Adult-Pediatric Electrostatic Filter HME - Small	Covidien	352/5877
Arterial Filter	SORIN GROUP	01706/03
Backhaus Towel Clamp	Pilling	454300
Biomedicus Pump	Maquet	BPX-80
Cable Ties – White 12”	HUASU International	HS4830001
Calcium Chloride	Fisher Scientific	C69-500G
Cooley Sternal Retractor	Pilling	341162
CUSHING Gutschdressing Forceps	Pilling	466200
D-glucose	Sigma-Aldrich	G5767-500G
Deep Deaver Retractor	Pilling	481826
Debakey Straight Vascular Tissue Forceps	Pilling	351808
Debakey-Metzenbaum Dissecting	Pilling	342202
Scissors	Pilling	342202
Endotracheal Tube 9.0mm CUFD	Mallinckrodt	9590E	Cuff removed for ESLP apparatus
Flow Transducer	BIO-PROBE	TX 40
Human Albumin Serum	Grifols Therapeutics	2223708
Infusion Pump	Baxter	AS50
Inspire 7 M Hollow Fiber Membrane Oxygenator	SORIN GROUP	K190690
Intercept Tubing 1/4" x 1/16" x 8'	Medtronic	3108
Intercept Tubing 3/8" x 3/32" x 6'	Medtronic	3506
Intercept Tubing Connector 3/8" x 1/2"	Medtronic	6013
MAYO Dissecting Scissors	Pilling	460420
Medical Carbon Dioxide Tank	Praxair	5823115
Medical Nitrogen Tank	Praxair	NI M-K
Medical Oxygen Tank	Praxair	2014408
Organ Chamber	Tevosol
PlasmaLyte A	Baxter	TB2544
Poole Suction Tube	Pilling	162212
Potassium Phosphate	Fischer Scientific	P285-500G
Scale	TANITA	KD4063611
Silicon Support Membrane	Tevosol
Sodium Bicarbonate	Sigma-Aldrich	792519-1KG
Sodium Chloride 0.9%	Baxter	JB1324
Sorin XTRA Cell Saver	SORIN GROUP	75221
Sternal Saw	Stryker	6207
Surgical Electrocautery Device	Kls Martin	ME411
Temperature Sensor probe	Omniacell Tertia Srl	1777288F
THAM Buffer	Thermo Fisher Scientific	15504020	made from UltraPureTM Tris
TruWave Pressure Transducer	Edwards	VSYPX272
Two-Lumen Central Venous Catheter 7fr	Arrowg+ard	CS-12702-E
Vorse Tubing Clamp	Pilling	351377
Willauer-Deaver Retractor	Pilling	341720
Yankauer Suction Tube	Pilling	162300