Perfusão pulmonar ex situ com pressão negativa normotérmica: avaliação da função e metabolismo pulmonar

Resumo

Este trabalho descreve um modelo porcino de ventilação com pressão negativa ex situ de perfusão pulmonar, incluindo captação, fixação e manejo em plataforma personalizada. O foco é feito nas técnicas anestésicas e cirúrgicas, bem como na solução de problemas.

Resumo

O transplante pulmonar (TxL) continua sendo o padrão de tratamento para doença pulmonar em estágio terminal. A escassez de órgãos de doadores adequados e as preocupações com a qualidade dos órgãos do doador, exacerbadas pela distância geográfica excessiva de transporte e pelos rigorosos critérios de aceitação de órgãos de doadores, representam limitações aos esforços atuais de TxL. A perfusão pulmonar ex situ (PEPS) é uma tecnologia inovadora que tem se mostrado promissora na atenuação dessas limitações. A ventilação fisiológica e a perfusão dos pulmões fora do meio inflamatório do corpo doador proporcionam várias vantagens à ESLP em relação à preservação estática a frio (PSC) tradicional. Há evidências de que a ESLP de ventilação com pressão negativa (VPN) é superior à ESLP de ventilação com pressão positiva (VPP), com VPP induzindo lesão pulmonar induzida por ventilação mecânica mais significativa, produção de citocinas pró-inflamatórias, edema pulmonar e formação de bolhas. A vantagem do VPN talvez se deva à distribuição homogênea da pressão intratorácica em toda a superfície pulmonar. A segurança clínica e a viabilidade de um dispositivo personalizado de VPN-ESLP foram demonstradas em um ensaio clínico recente envolvendo pulmões humanos de doadores com critérios extensores (ECD). Neste trabalho, o uso deste dispositivo personalizado é descrito em um modelo suíno juvenil de NPV-ESLP normotérmico ao longo de 12 h de duração, prestando especial atenção às técnicas de manejo. A preparação pré-cirúrgica, incluindo a inicialização do software ESLP, priming e desarejamento do circuito ESLP, e a adição de agentes antitrombóticos, antimicrobianos e anti-inflamatórios, é especificada. São descritas as técnicas intraoperatórias de inserção do cateter central, biópsia pulmonar, exsanguinação, coleta de sangue, cardiectomia e pneumonectomia. Além disso, um foco especial é dado às considerações anestésicas, com indução, manutenção e modificações dinâmicas da anestesia descritas. O protocolo também especifica a inicialização, manutenção e término da perfusão e ventilação do dispositivo personalizado. Técnicas de manejo dinâmico de órgãos, incluindo alterações na ventilação e parâmetros metabólicos para otimizar a função do órgão, são descritas detalhadamente. Finalmente, a avaliação fisiológica e metabólica da função pulmonar é caracterizada e retratada nos resultados representativos.

Introdução

O transplante pulmonar (TxP) continua sendo o padrão de tratamento para doença pulmonar terminal¹; no entanto, o TxP apresenta limitações significativas, incluindo utilização inadequada de órgãos de doadores² e mortalidade na lista de espera de 40%³, que é maior do que qualquer outro transplante de órgão sólido ^4,5. As taxas de utilização de órgãos de doadores são baixas (20-30%) devido a preocupações com a qualidade dos órgãos. A distância geográfica excessiva de transporte, agravada por critérios rigorosos de aceitação de órgãos de doadores, exacerba essas preocupações de qualidade. O TxT também está atrás de outros transplantes de órgãos sólidos em termos de enxerto de longo prazo e resultados do paciente². A disfunção primária do enxerto (DPE), mais frequentemente causada por lesão de reperfusão isquêmica (IRI), representa a principal causa de mortalidade e morbidade em 30 dias pós-TxH e aumenta o risco de disfunção crônica do enxerto ^6,7. Esforços para diminuir a IRI e estender os tempos de transporte seguros são fundamentais para melhorar os resultados dos pacientes.

A perfusão pulmonar ex situ (PEPS) é uma tecnologia inovadora que tem se mostrado promissora na atenuação dessas limitações. A ESLP facilita a preservação, avaliação e recondicionamento dos pulmões doados antes do transplante. Tem apresentado resultados satisfatórios a curto e longo prazo após o transplante de pulmões com doador de critério estendido (DCE), contribuindo para um aumento no número de pulmões doados adequados para TxL, com taxas de utilização de órgãos aumentando em 20% em alguns centros ^8,9,10. Em comparação com o padrão clínico atual para TxT, a preservação estática a frio (PSC), a PSL oferece várias vantagens: o tempo de preservação do órgão não é limitado a 6 h, a avaliação da função do órgão é possível antes do implante e, devido à perfusão contínua do órgão, modificações podem ser feitas no perfusato que otimiza a função do órgão¹¹.

A grande maioria dos dispositivos ESLP atuais projetados para uso humano utilizam ventilação com pressão positiva (VPP); no entanto, a literatura recente tem indicado que essa estratégia ventilatória é inferior à ESLP com pressão negativa (VPN), com VPP induzindo lesão pulmonar induzida por ventilação mecânica mais significativa^12,13,14,15. Tanto em pulmões humanos quanto em suínos, o VPN-ESLP exibe função orgânica superior quando comparado à perfusão pulmonar ex situ com pressão positiva (PSVP-ESLP) em vários domínios fisiológicos, incluindo produção de citocinas pró-inflamatórias, edema pulmonar e formação de bolhas¹⁵. A distribuição homogênea da pressão intratorácica em toda a superfície pulmonar no VPN-ESLP tem sido sugerida como um fator significativo subjacente a essa vantagem^15,16. Além de seus benefícios pré-clínicos, a segurança clínica e a viabilidade do VPN-ESLP foram demonstradas em um ensaio clínico recente¹⁷. Utilizando um novo dispositivo de NPV-ESLP, doze pulmões humanos de doadores de critérios estendidos foram preservados, avaliados e posteriormente transplantados com 100% de sobrevida em 30 dias e 1 ano.

O objetivo do presente artigo é demonstrar um protocolo de trabalho do dispositivo NPV-ESLP de nosso laboratório utilizando pulmões suínos juvenis sob condições normotérmicas por 12 h de duração. A recuperação cirúrgica é abordada em detalhes, e a iniciação, o gerenciamento e o término de nossa plataforma de software personalizado também são descritos. A estratégia para a coleta de tecidos e o manejo das amostras também é explicado.

Protocolo

Os procedimentos realizados neste manuscrito estão de acordo com as diretrizes do Conselho Canadense de Cuidados com Animais e com o guia para cuidados e uso de animais de laboratório. O comitê institucional de cuidados com animais da Universidade de Alberta aprovou os protocolos. Foram utilizados exclusivamente suínos fêmeas juvenis de Yorkshire entre 35-50 kg. Treinamento adequado em biossegurança foi exigido por todos os indivíduos envolvidos nos procedimentos de ESLP. Uma visão geral esquemática de todo o experimento NPV-ESLP está representada na Figura 1.

1. Preparações pré-cirúrgicas

1. Posicione a câmara de órgão no carrinho ESLP e monte a membrana de suporte de silicone (consulte Tabela de Materiais) nos ganchos da câmara para suspensão.
2. Monte a tubulação ESLP, o desoxigenador, o filtro arterial e a bomba centrífuga.
3. Conecte as linhas de água do trocador de calor ao desoxigenador, bem como à tubulação de gás de varredura.
4. Insira a sonda do sensor de temperatura (consulte Tabela de Materiais) no desoxigenador.
5. Fixe o transdutor de fluxo da artéria pulmonar (AP) (ver Tabela de Materiais) na tubulação PA.
   NOTA: O transdutor de fluxo usa ultrassom para medir o fluxo e retransmiti-lo de volta à bomba centrífuga.
6. Use uma torneira de três vias para prender o transdutor de pressão PA à cânula PA.
7. Conecte firmemente todas as conexões de tubulação para evitar vazamentos e feche todas as torneiras e travas Luer antes de adicionar o perfusato.
8. Primer o circuito com 1000 mL de perfusato de ingrediente hospitalar comum modificado (CHIP).
   NOTA: O CHIP é um perfusato de baixo custo feito sob medida com uma medida oncótica de 35 mmHg, comparável a soluções proprietárias de perfusato¹⁸.
9. Inicie o software depois que o circuito estiver preparado para facilitar a desarejamento da bomba e das linhas.
   Observação : essas etapas estão associadas com a Figura 2 e Figura 3.

2. Inicialização, ajustes e circuito de desaire do software ESLP

1. Clique no atalho do programa no monitor para iniciar o programa ESLP. Selecione Scan, Cart 3, Connect e, em seguida, NPV program seguido por Launch Software.
2. Na página principal, uma vez que o circuito é preparado, aumente os RPMs de fluxo para 900 para conduzir o ar para fora do circuito e demonstrar o fluxo de perfusato através da cânula PA com um fluxo constante de fluido.
3. Adicionar ao circuito 3,375 g de piperacilina-tazobactam, 10.000 unidades de heparina (10.000 U/1,5L de perfusato = 6,66 U/L) e 500 mg de metilprednisona.
4. Colher uma amostra de gasometria arterial (gasometria) do perfusato para fins de referência.
5. Na página principal , gire o CPAP até 20 cm H₂O (máx.) e ligue-o para verificar a função. Desligue assim que a operação for confirmada.
6. Na página principal , gire EIP para -5 cm H₂0 e ligue-o para verificar a função. Desligue assim que o processo for confirmado.
7. Na página Configurações , ligue o aquecedor (clique em Iniciar Aquecedor) e confirme a função. Altere o ponto de ajuste de temperatura nos monitores e confirme uma mudança congruente no monitor do aquecedor no carrinho. Desligue assim que a operação estiver assegurada.
   NOTA: O aparelho ESLP usado aqui está equipado com um programa de software personalizado (Figura 4). O programa permite o controle da velocidade da bomba e dos parâmetros ventilatórios para atingir e manter o fluxo PA desejado, pressão positiva contínua nas vias aéreas (CPAP), pressão expiratória final (EEP), pressão inspiratória final (EIP), relação respiratória (FR) e relação inspiratória: expiratória (I:E). O software calcula parâmetros funcionais e loops pressão-volume. A Tabela 1 lista todos os parâmetros de monitoramento fornecidos pelo software.

3. Preparações para anestesia

1. Administrar cetamina (20 mg/kg) e atropina (0,05 mg/kg) (injeções intramusculares) na sala de cirurgia como pré-medicação para o porco doador.
2. Coloque o porco em decúbito dorsal sobre uma mesa cirúrgica aquecida. Manter a normotermia e proceder com a indução da máscara.
3. Titular o fluxo de oxigênio de acordo com o peso do animal, tipicamente 20-40 mL/kg.
4. Administrar isoflurano inicialmente a 4-5%. Em seguida, reduza para 3% após 1-2 min.
5. Avaliar a profundidade da anestesia a cada 5 min. Certifique-se de que o porco não tenha reflexo de retirada em resposta a um estímulo nocivo.
6. Uma vez confirmada a profundidade correta da anestesia, intubar o porco.
7. Atingir uma saturação de oxigênio acima de 90% colocando uma sonda de oxímetro de pulso na língua (preferencial) ou no ouvido.
8. Ajustar o fluxo de oxigênio (20-40 mL/kg) e o gás inalatório (1-3%) para manter o nível de anestesia.
9. Manter as regulagens do ventilador em TV 6-10 mL/kg, frequência respiratória de 12-30 ciclos/min, PEEP 5 cm H 2 O, Pressãode Pico 20 cm H₂O.
10. Faça a barba e lave com iodo para preparar o local da incisão.

4. Biópsia pulmonar, exsanguinação e coleta de sangue

1. Inserir uma linha central para administração de fluidos e heparina.
   1. Fazer uma incisão mediana de 5-8 cm com eletrocautério centrado sobre a traqueia e estendendo-se cranialmente a partir da fúrcula esternal.
   2. Usando o cautério, divida a pele e a gordura subcutânea.
   3. Para identificar o feixe intravascular carotídeo esquerdo ou direito lateral à traqueia, divida o plano da linha média entre os músculos da cinta e separe as camadas de tecido conjuntivo.
   4. Usando laços de seda 2-0 como alças de vaso, obtém-se controle distal e proximal da veia jugular.
   5. Para controlar o fluxo sanguíneo, amarre o laço cranial e retraia para cima no laço proximal.
   6. Para acomodar uma linha central de 7 Fr, faça uma pequena incisão na veia usando a tesoura de Metzenbaum (~1/3 da circunferência do vaso).
   7. Soltar a tensão na alça do vaso proximal simultaneamente canular a veia. Amarre a seda para fixar a cânula na veia a uma profundidade de 10 cm.
   8. Conectar a uma linha IV de solução salina normal a 0,9% após lavar a linha com heparina (1 unidade/mL). Se o porco estiver esgotado intravascularmente devido à desidratação, administre o líquido. Hep-lock todas as portas não utilizadas.
2. Realizar esternotomia mediana
   1. Identificar a fúrcula esternal e os processos xifoides como pontos incisionais.
   2. Use o eletrocautério para fazer uma incisão mediana que abrange todo o esterno (aproximadamente 40-50 cm) e conecta a incisão anterior na fúrcula esternal ao xifoide.
   3. Divida o tecido subcutâneo e a fáscia entre as fibras do músculo peitoral maior. Cauterizar quaisquer vasos sangrantes para manter a hemostasia.
   4. Use o eletrocautério para marcar a linha média ao longo do osso esternal. Use uma tesoura pesada para cortar o xifoide e use um dedo para dissecar o pericárdio sem rodeios da mesa posterior do esterno para criar um espaço palpável para acomodar a serra esternal.
   5. Aplicar dois grampos de toalha em lados opostos do esterno ao nível da 4ª costela lateral à junção costocondral. Compre o tecido sobrejacente e a camada de fáscia dentro dos clipes de toalha e levante o esterno verticalmente para longe do coração durante a esternotomia.
   6. Realizar a esternotomia com serra elétrica ou pneumática, dentes para cima, partindo do xifoide em direção à fossa esternal. Para evitar lesões nas estruturas subjacentes (por exemplo, pericárdio e veia braquiocefálica e artéria inominada), prossiga gradualmente com a serra e retraia verticalmente usando clipes de toalha.
      OBS: O esterno mergulha profundamente posteriormente na fúrcula esternal, e a serra deve ser direcionada posteriormente para completar a esternotomia nesse nível.
   7. Utilizar cautério para obtenção de hemostasia do esterno sangrante.
      NOTA: A cera de osso também pode ser empregada para este fim.
   8. Administrar 1.000 U/kg de heparina por via intravenosa. Colher uma amostra de sangue in vivo 5 minutos após a administração de heparina.
   9. Use um dedo para dissecar bruscamente a pleura do esterno interno para criar espaço para o afastador esternal.
   10. Insira um afastador esternal com uma alça em direção ao abdome e retraia gradualmente para expor completamente o mediastino.
3. Remova o timo do pericárdio usando uma combinação de dissecção romba com um dedo e eletrocautério.
   NOTA: É melhor remover o timo como uma peça grande em vez de pequenos pedaços.
4. Faça uma biópsia do lobo pulmonar superior direito para análise do tecido: abra a pleura direita para expor o lobo superior direito. Circunde uma porção de 1cm³ com 0-seda, amarre e excise essa porção do pulmão usando uma tesoura de Metzenbaum.
   1. Divida a biópsia em três porções de tamanho igual e coloque uma de cada em gel de temperatura de corte ideal (OCT), formalina e nitrogênio líquido (snap freeze).
   2. Conservar as amostras de OCT e de congelamento num congelador de -80 °C e armazenar as amostras de formalina num frigorífico a 4 °C utilizando um recipiente devidamente selado.
      NOTA: As amostras de biópsia são coradas pela coloração de hematoxilina-eosina para examinar a histopatologia da lesão pulmonar, incluindo edema intersticial, inflamação alveolar e intersticial, infiltrados neutrofílicos intersticiais e perivasculares e hemorragia¹⁵.
5. Abra o pericárdio. Tenda do pericárdio com pinça e incisão na linha média do pericárdio com tesoura de Metzenbaum.
   1. Continuar esta incisão cranialmente até a raiz da aorta, depois lateralmente para expor a veia cava superior (VCS). Completar a pericardiotomia caudal e fora da incisão esquerda e direita ao nível do ápice cardíaco.
6. Eutanásia do porco por exsanguinação. Incisar a VCS e inserir uma sucção com ponta de Poole (ver Tabela de Materiais) no lúmen, avançando a ponta de sucção para a veia cava inferior (VCI).
   OBS: É feita uma incisão na parede anterior do átrio esquerdo (AE) para agilizar a exsanguinação.
   1. Levante o ápice cardíaco e incida o AE 1 cm abaixo do seio coronariano usando tesoura de Metzenbaum. Na exsanguinação, mude de 100% O₂ para ar ambiente.
7. Coletar sangue total: a sucção da ponta de Poole é conectada a um dispositivo de economia de células para coletar 1200 mL de sangue total, que é girado para produzir 500 mL de concentrado de hemácias (CH).
   NOTA: Configuração do Protocolo de Economia de Células: Fluxo de Preenchimento: 300 mL/min, Fluxo de Lavagem: 100 mL/min, Fluxo Vazio: 150 mL/min, Fluxo de Retorno: 150 mL/min, Volume de Lavagem: 300 mL, Fluxo de Concentração: 200 mL/min. Isso levará ~5 min.

5. Cardiectomia

1. Realizar a cardiectomia: elevar o ápice cardíaco cranialmente e continuar a incisão prévia do AE lateralmente para transeccionar o seio coronariano onde a veia hemi-ázigótica esquerda se une.
2. Divida o AE cortando medialmente a superfície anterior da bifurcação do PA.
3. Transeccionar a VCI 1 cm acima do diafragma. Conecte esta incisão ao AE cortando medialmente.
4. Completar a divisão do AE cortando ao longo do topo da artéria pulmonar direita em direção à bifurcação do PA.
   NOTA: Este passo exclui a veia pulmonar superior direita do AE posterior.
5. Levantar a VCI cranialmente e dividir a veia pulmonar superior direita. Divida as reflexões pericárdicas que coalescem entre a AP principal e o átrio direito (AD)/CVL.
6. Coloque o coração para baixo e transeccione o SVC. Divida a VCS da camada de tecido conjuntivo posteriormente e transeccione a veia ázigótica.
7. Levante o coração cranialmente, divida o PA ao nível da válvula pulmonar. Dissecar parcialmente a Aorta do AP com tesoura de Metzenbaum e, em seguida, transeccionar a Aorta ascendente.
   NOTA: Isso completa a cardiectomia.

6. Pneumonectomia

1. Realizar a pneumonectomia: verificar se o volume corrente expiratório (VCe) é de aproximadamente 10 mL/kg. Mude para a relação inspiratória: expiratória de 2:1 para atingir esse alvo. Se o VC permanecer < 6mL/kg, aumente as pressões de pico e/ou a PEEP para atingir a meta de 8-10 mL/kg para o recrutamento alveolar máximo.
2. Abra a pleura do lado esquerdo do porco. Faça uma incisão horizontal ao longo da mesa posterior do esterno com uma tesoura de Metzenbaum. Realizar duas incisões verticais na pleura até o nervo frênico nas bordas superior e inferior do mediastino.
   1. Excisar a pleura cortando ao longo do nervo frênico. Repita esta etapa no lado direito. Abrir e remover a pleura diafragmática de forma semelhante, utilizando o manguito posterior do AE como borda inferior, de forma semelhante ao nervo frênico.
3. Divida os anexos pleurais do diafragma em direção ao lobo pulmonar inferior esquerdo. Use um afastador Deaver (consulte Tabela de Materiais) para manter o diafragma para cima. Divida o ligamento pulmonar inferior à esquerda e continue até o hilo.
4. Tente uma "técnica sem toque" em relação ao próprio tecido pulmonar.
   OBS: Ou seja, tentar mínima manipulação manual do pulmão para evitar trauma.
5. Do lado direito, divida a VCI e os anexos pleurais do diafragma. Retrair o diafragma para cima usando o afastador Deaver. Divida o ligamento pulmonar inferior do lado direito e continue até o hilo.
6. Divida a veia inominada e os vasos do arco para expor a traqueia.
7. Dissecar o tecido ao redor da traqueia. Com volumes correntes expiratórios (VCe) em torno de 10 mL/kg, pinçar a traqueia usando uma pinça tubular na inspiração máxima.
8. Transeccionar a traqueia e levantar a porção pinçada para cima para os passos restantes para fornecer tração cirúrgica.
9. Dissecar a traqueia posterior do esôfago usando dissecção romba com tesoura pesada de Metzenbaum e mão livre. Divida quaisquer anexos pleurais restantes, transeccione a Aorta acima e abaixo do brônquio esquerdo e remova os pulmões do tórax com um segmento de Aorta descendente.
10. Pese os pulmões com a braçadeira e guarde-os rapidamente em um refrigerador cheio de gelo. O ganho de peso durante a corrida de PSL é um indicador da formação de edema.
    NOTA: Isso completa a pneumonectomia.

7. Colocação dos pulmões no aparelho ESLP

1. Adicionar 500 mL de CH ao circuito de perfusão (previamente preparado com 1L de CHIP, passo 1.8) para atingir um volume final de 1,5 L de perfusato.
   NOTA: A concentração de hemoglobina é direcionada para aproximadamente 50 g/L ou um hematócrito de 15%.
2. Tire fotografias dos pulmões para registros de dados.
3. Biópsia do lobo pulmonar médio direito. Circundar uma porção de 1cm³ com 0-seda, amarrar e excisar essa porção do pulmão usando tesoura para análise tecidual, conforme descrito anteriormente (passo 4.4).
4. Fixe o adaptador de tubo de 3/8, 1/2 polegada na artéria pulmonar principal (mPA). Segure lados opostos do mPA usando snaps. Insira o adaptador com a porção de 1/2 polegada no mPA e mantenha-o no lugar enquanto um assistente prende o adaptador na posição usando laços de seda 0.
   NOTA: O adaptador deve ficar 2-3 cm acima da bifurcação do PA (se o PA tiver comprimento inadequado, um segmento da Aorta descendente do porco doador pode ser costurado de ponta a ponta no mPA para comprimento adicional).
5. Coloque os pulmões em decúbito dorsal sobre a membrana de suporte de silicone e conecte-os ao dispositivo ESLP.
6. Coloque uma segunda pinça de tubulação na traqueia perto da localização do brônquio traqueal. Retirar a pinça mais distal e intubar a traqueia com o tubo endotraqueal (TET).
   1. Fixe o ETT na posição usando dois zip-ties. Aperte a linha de ventilação com uma pinça tubular e solte a pinça proximal da traqueia.
      NOTA: Os pulmões ficam inflados se isso for feito corretamente e não houver vazamentos de ar.
7. Conecte o adaptador PA à linha PA e remova o mPA. Inicie o temporizador para perfusão.
   NOTA: Consulte a Figura 5 para obter uma representação fotográfica das etapas.

8. Início da perfusão e ventilação

1. Na página Configurações , clique em Iniciar aquecedor e defina a temperatura para 38 °C. Insira o peso do porco também para calcular o débito cardíaco (fluxo).
2. Na página Principal , defina o CPAP como 20 cm H₂O e clique em Iniciar CPAP. Quando a ventilação começar, desaperte a linha de ventilação.
3. Zerar o sensor de pressão arterial. Aperte a linha PA acima do sensor de pressão com uma braçadeira de tubulação. Abra o sensor para o ar ambiente, clique em ZERO PAP e Zero Bld Flow na página Configurações e confirme se as leituras estão zeradas na página principal .
   1. Feche a torneira do sensor de pressão para ler a pressão da linha, abra a linha para a cânula PA, selecione 10% de débito cardíaco na página principal, clique em Retornar ao Manual do PA (o botão fica verde) e desaperte a linha PA.
      NOTA: A linha agora está adequadamente zerada e a bomba agora está fluindo 10% do débito cardíaco calculado.
4. Extrair 10 mL de perfusato para análise centrífuga e desenhar uma gasometria de tempo zero (T0).
5. Uma vez perfundidos os pulmões por 10 min, aumente o fluxo para 20% do débito cardíaco.
6. Quando a temperatura do perfusato atingir 32 °C, prenda a tampa da câmara no lugar com grampos para criar uma vedação hermética. Posicione os pulmões de forma ideal antes de colocar a pálpebra. Repare quaisquer fugas de ar com prolene tamanho 6-0 em agulhas BV-1.
7. Com a tampa segura, prenda a tubulação de ventilação e desligue o CPAP. Na página Configurações , clique em Zero ITP, Zero Paw, Zero Air Flow e confirme se as leituras estão zeradas na página Principal .
   1. Clique em Iniciar CPAP a 20 cm H₂O e desaperte a tubulação de ventilação. Em seguida, defina a meta EEP para 0 cm H2 O, EIP para 1 cm H₂0, RR 10, relação I:E 1:1 e clique em Pressionar para iniciar ventilação para ativar a ventilação com pressão negativa.
   2. Ouça o respiradouro mudar sua função e, em seguida, conecte a tubulação de ventilação da porta lateral à câmara.
      OBS: O ventilador inicia seu ciclo respiratório em expiração. Os pulmões comprimirão ligeiramente se a porta lateral estiver ligada durante uma expiração. É preferível esperar e ouvir a inalação e, em seguida, conectar a porta lateral para maximizar o recrutamento.
8. Nas próximas respirações, diminua o CPAP para 12 cm H2 O e, simultaneamente, aumente a PIE para -9 cm H 2 O. Mantenha esses parâmetros ventilatórios durante a primeira hora, depois reduza o CPAP para 8-10 cm H 2 O dependendo do recrutamento alveolar e aumente a EIP para -12 a -13 cm H₂O.
9. Ajuste as pressões de pico para 20-21 cm H₂O.
   NOTA: Se pressões mais altas foram necessárias no momento da pneumonectomia, então isso se torna a pressão de pico alvo.
10. Quando a temperatura do perfusato atingir 35 °C, aumente o fluxo para 30% do débito cardíaco.
    OBS: Estes são os cenários para preservação de órgãos (Tabela 2).
11. Às 3, 5, 7, 9, 11 h, avaliar com fluxos de 50% do débito cardíaco e a adição de gás de varredura mista (89% N 2, 8% CO 2, 3% O₂) adicionado ao desoxigenador a 0,125 L/min para simular a utilização sistêmica de oxigênio (Tabela 3).
12. A cada hora ímpar durante o modo de preservação, retirar uma amostra de 10 mL de perfusato para análise futura. Extrair uma amostra de 1 ml de gasometria arterial pré-desoxigenador de hora em hora.
13. Após 5 min do modo de avaliação, extrair as gasometrias gasométricas dos orifícios pré e pós-desoxigenador (Tabela 4).
    NOTA: Isso completa a colocação dos pulmões na ESLP e o início da perfusão e ventilação. Ver Tabela 2 para início do protocolo. A Tabela 3 detalha os dois modos de VPN-ESLP empregados.

9. Suporte Metabólico do Pulmão

1. Verificar o nível de glicose do perfusato a cada hora através da análise da gasometria arterial. Meta de glicose em 3-6 mmol/L e titular de acordo com as taxas de consumo usando uma bomba de infusão padrão para infusão contínua de glicose e doses em bolus, conforme necessário.
   NOTA: Outra bomba de infusão fornece uma infusão contínua de 2 U/h de insulina. O CHIP, juntamente com a maioria das outras soluções de perfusão de órgãos, contém glicose como substrato energético primário.

10. Heparina, agentes antimicrobianos e anti-inflamatórios

1. Adicionar 10.000 unidades de heparina ao perfusato no início da perfusão antes da adição de CH.
2. Adicionar 3,375 g de piperacilina-tazobactam ao perfusato no início da perfusão antes de adicionar CH.
3. Adicionar 500 mg de metilprednisolona ao perfusato no início da perfusão antes de adicionar CH.

11. Avaliação da função pulmonar

1. Empregar os dois modos distintos de ventilação e perfusão durante uma corrida de ESLP: preservação e avaliação.
   NOTA: Consulte Preservação e Avaliação (Tabela 3). Modo de Preservação: Débito cardíaco 30%, PEEP 8-12, EEP 0, PIE -10 a -12, Pressão de Pico 20-22 cm H₂O, FR 6-10 e relação I:E 1:1-1,5. As corridas ESLP são tipicamente de 12 h de duração, embora possam ser estendidas até 24 h.
2. Ajuste a pressão de pico para corresponder à pressão de pico da pneumonectomia e atingir um VC alvo de 10 mL/kg.
   NOTA: Embora TVe de 10mL/kg seja alvo, geralmente 6-8mL/kg é alcançado.
3. A cada 30 min durante a preservação, realize o recrutamento por 30 min ou menos.
   NOTA: A duração e a extensão do recrutamento dependem da TVe atingida. Se os TVe forem 8-10 mL/kg, não é necessário recrutamento adicional.
4. Para o recrutamento, aumentar a PEEP para 10-12 cm H2 O, diminuir a FR para 6 ciclos/min, aumentar as pressões de pico em 2-4 cm H 2 0 sem exceder 30 cm H₂O (raramente excedemos 25cm H2O) e alterar a relação I:E para 1:0,5.
   NOTA: Geralmente, apenas uma ou duas dessas alterações são feitas para cada intervalo de 30 min, sendo o aumento da PEEP e da Pressão de Pico os mais efetivos.
5. Às 3, 5, 7, 9, 11 h, avaliar a função do órgão.
   NOTA: O principal parâmetro de interesse é o índice de PF; no entanto, a complacência dinâmica e as pressões de PA são monitoradas de perto (Figura 6).
6. Durante a avaliação, aumenta o débito cardíaco para 50% enquanto um gás de varredura misto (89% N 2, 8% CO 2, 3% O₂) é adicionado ao circuito a uma taxa de fluxo de 0,125 L/min através do desoxigenador.
   NOTA: Isso replica a depleção sistêmica de oxigênio e ocorre ao longo de 5 min. Durante esse tempo, diminua a PEEP para 5 cm H₂O mantendo as pressões de pico, aumentando a EIP de acordo. Mantenha a FR em 10 bpm e defina I:E como 1 ou 1,5, dependendo se os pulmões parecem estar aprisionando ar ou não.
7. Realizar os cálculos funcionais da resistência vascular pulmonar, ventilação minuto, complacência dinâmica e relação P/F.
   NOTA: A Resistência Vascular Pulmonar pode ser calculada por: [(PAP - LAP)/CO] x 80, onde a PAE (pressão atrial esquerda) é de 0 mmHg devido ao desenho de um sistema de drenagem do AE aberto.
   A Ventilação Minuto é calculada por: VCexpiratória x FR
   A Conformidade Dinâmica é calculada por: TVexpiratory/EIP
   A relação P/F é calculada por: PaO2/Fi02, onde a FiO2 é de 21%.
   O software ESLP calcula e registra automaticamente a ventilação e os índices funcionais continuamente.

12. Avaliação metabólica dos pulmões perfundidos ex situ

1. Avaliar o estado metabólico do perfusato a cada hora através de gasometrias gasosas, que atuam como um marcador substituto do estado dos pulmões. Coletar 10 mL do perfusato na porta do pré-desoxigenador para análise futura.
   NOTA: A gasometria também serve para monitorar o gás e o estado iônico do perfusato.
2. Utilizar a PaO2 como marcador da função pulmonar global.
   NOTA: Isto é particularmente verdadeiro durante as fases de avaliação, quando gás de varredura mista é adicionado ao circuito para simular a desoxigenação sistêmica. Os gases pré versus pós-desoxigenador são comparados para avaliar o aumento do oxigênio pelos pulmões.
3. Atingir uma acidose normal (7,35-7,45) correta com bolus de tampão tris-hidroximetilaminometano (THAM) (ver Tabela de Materiais).
   NOTA: A alcalose geralmente não é corrigida e não excede 7,55. A varredura de CO₂ pode ser adicionada ao circuito para corrigir isso para normal ou se a alcalose exceder este limite.
4. Tratar a PaCO₂ de forma permissiva e geralmente está na faixa de 10-20 mmHg.
   NOTA: Estes valores são interpretados como um sinal de ventilação satisfatória. Os eletrólitos não são ajustados durante a PSLV, mas são monitorados como parte da análise padrão da gasometria arterial. O lactato subirá durante o aumento da duração da ESLP, assim como o potássio. O sódio permanece estável (135-145 mmol/L), e o cálcio é tipicamente baixo. A Tabela 4 contém os resultados representativos da amostra da análise do perfusato da gasometria arterial durante uma corrida de 12 horas de VPN-ESLP em normotermia e 30% de débito cardíaco usando um perfusato celular (sangue + CHIP).

13. Terminando a perfusão, ventilação e desconexão dos pulmões do dispositivo de ESLP

1. Na página Configuração , clique em Servidor de Desligamento.
2. Retire a tampa da câmara. Desconecte o adaptador PA da cânula PA.
3. Extubar a traqueia. Para determinar a quantidade de formação de edema, pesar os pulmões.
4. Faça uma biópsia tecidual de 1 cm³ do lobo acessório e divida em três partes, conforme descrito anteriormente.
5. Executar as análises gasosas finais, centrifugar as amostras de perfusato e armazenar as biópsias teciduais conforme descrito anteriormente (passo 4.4).
   NOTA: Configurações de centrifugação: Velocidade, 112 x g; aceleração, 9; desaceleração, 9; temperatura, 4 °C, e tempo, 15 min de duração.
6. Feche o programa; Todos os dados gravados serão salvos.
7. Seguindo os protocolos institucionais, descartar os demais tecidos, sangue e materiais bioativos.
8. Limpe o carrinho ESLP usando um limpador de superfícies rígidas sanitizante (por exemplo, etanol 70%) e coloque todos os componentes reutilizáveis em um freezer de -20 °C para reduzir o crescimento de bactérias.

Resultados

No início da perfusão e ventilação pulmonar (modo de preservação), os pulmões geralmente terão baixa pressão arterial pulmonar (< 10 mmHg) e baixa complacência dinâmica (< 10 mL/mmHg) à medida que o perfusato se aquece para normotermia. Porcos Yorkshire pesando 35-50 kg normalmente resulta em pulmões pesando 350-500 g. Durante a primeira hora de VPN-PSL, os volumes correntes expiratórios (VCe) medidos são de 0-2 mL/kg e os volumes correntes inspiratórios (VCo) são de 100-200 mL. TVe geralmente atinge 4-6...

Discussão

Há várias etapas cirúrgicas críticas, juntamente com a solução de problemas, necessárias para garantir uma execução ESLP bem-sucedida. Os pulmões suínos juvenis são extremamente delicados em comparação com os pulmões humanos adultos, por isso o cirurgião comprador deve ser cauteloso ao manusear pulmões suínos. É fundamental tentar uma técnica "no-touch" para evitar causar trauma e atelectasia ao dissecar os pulmões. "Sem toque", a utilização da mínima quantidade de manipulação manual dos pulmõe...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
0 ETHIBOND Green 1 x 36" Endo Loop 0	ETHICON	D8573
2-0 SILK Black 12" x 18" Strands	ETHICON	SA77G
ABL 800 FLEX Blood Gas Analyzer	Radiometer	989-963
Adult-Pediatric Electrostatic Filter HME - Small	Covidien	352/5877
Arterial Filter	SORIN GROUP	01706/03
Backhaus Towel Clamp	Pilling	454300
Biomedicus Pump	Maquet	BPX-80
Cable Ties – White 12”	HUASU International	HS4830001
Calcium Chloride	Fisher Scientific	C69-500G
Cooley Sternal Retractor	Pilling	341162
CUSHING Gutschdressing Forceps	Pilling	466200
D-glucose	Sigma-Aldrich	G5767-500G
Deep Deaver Retractor	Pilling	481826
Debakey Straight Vascular Tissue Forceps	Pilling	351808
Debakey-Metzenbaum Dissecting	Pilling	342202
Scissors	Pilling	342202
Endotracheal Tube 9.0mm CUFD	Mallinckrodt	9590E	Cuff removed for ESLP apparatus
Flow Transducer	BIO-PROBE	TX 40
Human Albumin Serum	Grifols Therapeutics	2223708
Infusion Pump	Baxter	AS50
Inspire 7 M Hollow Fiber Membrane Oxygenator	SORIN GROUP	K190690
Intercept Tubing 1/4" x 1/16" x 8'	Medtronic	3108
Intercept Tubing 3/8" x 3/32" x 6'	Medtronic	3506
Intercept Tubing Connector 3/8" x 1/2"	Medtronic	6013
MAYO Dissecting Scissors	Pilling	460420
Medical Carbon Dioxide Tank	Praxair	5823115
Medical Nitrogen Tank	Praxair	NI M-K
Medical Oxygen Tank	Praxair	2014408
Organ Chamber	Tevosol
PlasmaLyte A	Baxter	TB2544
Poole Suction Tube	Pilling	162212
Potassium Phosphate	Fischer Scientific	P285-500G
Scale	TANITA	KD4063611
Silicon Support Membrane	Tevosol
Sodium Bicarbonate	Sigma-Aldrich	792519-1KG
Sodium Chloride 0.9%	Baxter	JB1324
Sorin XTRA Cell Saver	SORIN GROUP	75221
Sternal Saw	Stryker	6207
Surgical Electrocautery Device	Kls Martin	ME411
Temperature Sensor probe	Omniacell Tertia Srl	1777288F
THAM Buffer	Thermo Fisher Scientific	15504020	made from UltraPureTM Tris
TruWave Pressure Transducer	Edwards	VSYPX272
Two-Lumen Central Venous Catheter 7fr	Arrowg+ard	CS-12702-E
Vorse Tubing Clamp	Pilling	351377
Willauer-Deaver Retractor	Pilling	341720
Yankauer Suction Tube	Pilling	162300