Perfusione polmonare ex situ di ventilazione a pressione negativa normothermica: valutazione della funzione polmonare e del metabolismo

Riepilogo

Questo documento descrive un modello suino di perfusione polmonare ex situ di ventilazione a pressione negativa, incluso l'approvvigionamento, l'attacco e la gestione sulla piattaforma personalizzata. L'attenzione è rivolta alle tecniche anestetiche e chirurgiche, nonché alla risoluzione dei problemi.

Abstract

Il trapianto di polmone (LTx) rimane lo standard di cura per la malattia polmonare allo stadio terminale. La carenza di organi donatori idonei e le preoccupazioni sulla qualità degli organi dei donatori, esacerbate dall'eccessiva distanza geografica di trasporto e dai rigorosi criteri di accettazione degli organi dei donatori, pongono limiti agli attuali sforzi di LTx. La perfusione polmonare ex situ (ESLP) è una tecnologia innovativa che si è dimostrata promettente nell'attenuare queste limitazioni. La ventilazione fisiologica e la perfusione dei polmoni al di fuori dell'ambiente infiammatorio del corpo donatore offrono all'ESLP diversi vantaggi rispetto alla tradizionale conservazione statica a freddo (CSP). Ci sono prove che la ventilazione a pressione negativa (NPV) ESLP è superiore alla ventilazione a pressione positiva (PPV) ESLP, con PPV che induce lesioni polmonari indotte da ventilatori più significative, produzione di citochine pro-infiammatorie, edema polmonare e formazione di bolle. Il vantaggio NPV è forse dovuto alla distribuzione omogenea della pressione intratoracica su tutta la superficie polmonare. La sicurezza clinica e la fattibilità di un dispositivo NPV-ESLP personalizzato sono state dimostrate in un recente studio clinico che ha coinvolto polmoni umani con donatori di criteri di estensione (ECD). Qui, l'uso di questo dispositivo personalizzato è descritto in un modello suino giovanile di NPV-ESLP normotermico della durata di 12 ore, prestando particolare attenzione alle tecniche di gestione. Viene specificata la preparazione pre-chirurgica, compresa l'inizializzazione del software ESLP, il priming e la de-airing del circuito ESLP e l'aggiunta di agenti antitrombotici, antimicrobici e antinfiammatori. Vengono descritte le tecniche intraoperatorie di inserimento della linea centrale, biopsia polmonare, dissanguamento, raccolta di sangue, cardiectomia e pneumonectomia. Inoltre, particolare attenzione è rivolta alle considerazioni anestetiche, con l'induzione dell'anestesia, il mantenimento e le modifiche dinamiche delineate. Il protocollo specifica inoltre l'inizializzazione, la manutenzione e la terminazione della perfusione e della ventilazione del dispositivo personalizzato. Le tecniche di gestione dinamica degli organi, comprese le alterazioni della ventilazione e dei parametri metabolici per ottimizzare la funzione degli organi, sono descritte in modo approfondito. Infine, la valutazione fisiologica e metabolica della funzione polmonare è caratterizzata e rappresentata nei risultati rappresentativi.

Introduzione

Il trapianto di polmone (LTx) rimane lo standard di cura per la malattia polmonare allo stadio terminale¹; tuttavia, LTx ha limitazioni significative tra cui un utilizzo inadeguato degli organi del donatore² e una mortalità in lista d'attesa del 40%³, che è superiore a qualsiasi altro trapianto di organi solidi ^4,5. I tassi di utilizzo degli organi dei donatori sono bassi (20-30%) a causa di problemi di qualità degli organi. L'eccessiva distanza geografica di trasporto, aggravata da rigorosi criteri di accettazione degli organi donatori, aggrava questi problemi di qualità. LTx segue anche altri trapianti di organi solidi in termini di innesto a lungo termine e risultati del paziente². La disfunzione primaria del trapianto (PGD), più spesso causata da danno da riperfusione ischemica (IRI), rappresenta la principale causa di mortalità e morbilità a 30 giorni post-LTx e aumenta il rischio di disfunzione cronica del trapianto ^6,7. Gli sforzi per ridurre l'IRI e prolungare i tempi di trasporto sicuri sono fondamentali per migliorare i risultati dei pazienti.

La perfusione polmonare ex situ (ESLP) è una tecnologia innovativa che si è dimostrata promettente nell'attenuare queste limitazioni. L'ESLP facilita la conservazione, la valutazione e il ricondizionamento dei polmoni del donatore prima del trapianto. Ha mostrato risultati soddisfacenti a breve e lungo termine dopo il trapianto di polmoni donatori a criteri estesi (ECD), contribuendo ad aumentare il numero di polmoni donatori idonei per LTx, con tassi di utilizzo degli organi in aumento del 20% in alcuni centri ^8,9,10. Rispetto all'attuale standard clinico per LTx, la conservazione statica a freddo (CSP), la ESLP offre diversi vantaggi: il tempo di conservazione degli organi non è limitato a 6 ore, la valutazione della funzione dell'organo è possibile prima dell'impianto e, grazie alla perfusione continua d'organo, è possibile apportare modifiche al perfusato che ottimizza la funzione d'organo¹¹.

La stragrande maggioranza degli attuali dispositivi ESLP progettati per l'uso umano utilizza la ventilazione a pressione positiva (PPV); tuttavia, la letteratura recente ha indicato che questa strategia di ventilazione è inferiore alla ventilazione a pressione negativa (NPV) ESLP, con PPV che induce lesioni polmonari indotte da ventilazione più significative^12,13,14,15. Sia nei polmoni umani che suini, NPV-ESLP mostra una funzione d'organo superiore rispetto alla perfusione polmonare ex situ a pressione positiva (PPV-ESLP) in vari domini fisiologici, tra cui la produzione di citochine pro-infiammatorie, l'edema polmonare e la formazione di bolle¹⁵. La distribuzione omogenea della pressione intratoracica su tutta la superficie polmonare in NPV-ESLP è stata suggerita come un fattore significativo alla base di questo vantaggio^15,16. Oltre ai suoi benefici pre-clinici, la sicurezza clinica e la fattibilità di NPV-ESLP sono state dimostrate in un recente studio clinico¹⁷. Utilizzando un nuovo dispositivo NPV-ESLP, dodici polmoni umani donatori con criteri estesi sono stati conservati, valutati e successivamente trapiantati con successo con una sopravvivenza al 100% di 30 giorni e 1 anno.

L'obiettivo del presente manoscritto è quello di dimostrare un protocollo di lavoro del dispositivo NPV-ESLP del nostro laboratorio utilizzando polmoni suini giovanili in condizioni normotermiche per 12 ore di durata. Il prelievo chirurgico è trattato in dettaglio e vengono descritti anche l'avvio, la gestione e la cessazione della nostra piattaforma software personalizzata. Viene inoltre spiegata la strategia per la raccolta dei tessuti e la gestione dei campioni.

Protocollo

Le procedure eseguite in questo manoscritto sono conformi alle linee guida del Canadian Council on Animal Care e alla guida per la cura e l'uso degli animali da laboratorio. Il comitato istituzionale per la cura degli animali dell'Università di Alberta ha approvato i protocolli. Sono stati utilizzati esclusivamente maiali femmine dello Yorkshire giovani tra i 35 e i 50 kg. Tutte le persone coinvolte nelle procedure ESLP richiedevano un'adeguata formazione in materia di biosicurezza. Una panoramica schematica dell'intero esperimento NPV-ESLP è rappresentata nella Figura 1.

1. Preparazioni pre-chirurgiche

1. Posizionare la camera dell'organo sul carrello ESLP e montare la membrana di supporto in silicio (vedere la tabella dei materiali) sui ganci della camera per la sospensione.
2. Montare il tubo ESLP, il deossigenatore, il filtro arterioso e la pompa centrifuga.
3. Collegare le tubazioni dell'acqua dello scambiatore di calore al deossigenatore e al tubo del gas di spazzamento.
4. Inserire la sonda del sensore di temperatura (vedere Tabella dei materiali) nel deossigenatore.
5. Fissare il trasduttore di flusso dell'arteria polmonare (PA) (vedere la tabella dei materiali) sul tubo PA.
   NOTA: Il trasduttore di flusso utilizza gli ultrasuoni per misurare il flusso e ritrasmetterlo alla pompa centrifuga.
6. Utilizzare un rubinetto di arresto a tre vie per fissare il trasduttore di pressione PA alla cannula PA.
7. Fissare saldamente tutte le connessioni dei tubi per evitare perdite e chiudere tutti i rubinetti e le serrature Luer prima di aggiungere il perfusato.
8. Innesca il circuito con 1000 ml di perfusato di ingrediente ospedaliero comune modificato (CHIP).
   NOTA: CHIP è un perfusato a basso costo su misura con una misura oncotica di 35 mmHg, paragonabile alle soluzioni proprietarie di perfusato¹⁸.
9. Avviare il software dopo che il circuito è stato innescato per facilitare la de-aerazione della pompa e delle linee.
   Nota : questi passaggi sono associati alla Figura 2 e alla Figura 3.

2. Inizializzazione, regolazioni e circuito di de-airing del software ESLP

1. Fare clic sul collegamento del programma sul monitor per avviare il programma ESLP. Selezionare Scansione, Carrello 3, Connetti, quindi Programma NPV seguito da Avvia software.
2. Nella pagina principale, una volta innescato il circuito, aumentare i giri di flusso a 900 per spingere l'aria fuori dal circuito e dimostrare il flusso di perfusato attraverso la cannula PA con un flusso costante di fluido.
3. Aggiungere 3,375 g di piperacillina-tazobactam, 10.000 unità di eparina (10.000 U/1,5L perfusato = 6,66 U/L) e 500 mg di metilprednisone al circuito.
4. Prelevare un campione di gas del sangue arterioso (ABG) del perfusato a scopo di riferimento.
5. Nella pagina principale , ruotare CPAP fino a 20 cm H₂O (max) e accenderlo per controllare la funzione. Spegnere una volta confermata l'operazione.
6. Nella pagina principale , ruotare EIP a -5 cm H₂0 e accenderlo per controllare la funzione. Disattiva una volta confermato il processo.
7. Nella pagina Impostazioni , accendere il riscaldatore (fare clic su Avvia riscaldatore) e confermare la funzione. Modificare il set point della temperatura sui monitor e confermare una variazione congruente sul monitor del riscaldatore sul carrello. Spegnere una volta assicurata l'operazione.
   NOTA: L'apparecchio ESLP qui utilizzato è dotato di un programma software personalizzato (Figura 4). Il programma consente il controllo della velocità della pompa e dei parametri di ventilazione per raggiungere e mantenere il flusso PA desiderato, la pressione positiva continua delle vie aeree (CPAP), la pressione espiratoria (EEP), la pressione inspiratoria finale (EIP), il rapporto respiratorio (RR) e il rapporto inspiratorio: espiratorio (I:E). Il software calcola i parametri funzionali e i loop pressione-volume. La tabella 1 elenca tutti i parametri di monitoraggio forniti dal software.

3. Preparativi per l'anestesia

1. Somministrare ketamina (20 mg/kg) e atropina (0,05 mg/kg) (iniezioni intramuscolari) in sala operatoria come premedicazione per il suino donatore.
2. Posizionare il maiale supino su un tavolo operatorio riscaldato. Mantenere la normotermia e procedere con l'induzione della maschera.
3. Titolare il flusso di ossigeno in base al peso dell'animale, tipicamente 20-40 ml/kg.
4. Somministrare inizialmente isoflurano al 4-5%. Quindi ridurre al 3% dopo 1-2 minuti.
5. Valutare la profondità dell'anestesia ogni 5 minuti. Assicurarsi che il maiale non abbia riflessi di astinenza in risposta a uno stimolo nocivo.
6. Una volta confermata la corretta profondità dell'anestesia, intubare il maiale.
7. Puntare a una saturazione di ossigeno superiore al 90% posizionando una sonda pulsossimetrica sulla lingua (preferita) o sull'orecchio.
8. Regolare il flusso di ossigeno (20-40 ml/kg) e il gas inalante (1-3%) per mantenere il livello di anestesia.
9. Mantenere le impostazioni del ventilatore a un televisore 6-10 mL/kg, frequenza respiratoria di 12-30 respiri / min, PEEP 5 cm H 2 O,pressione di picco 20 cm H₂O.
10. Rasare e lavare con iodio per preparare il sito di incisione.

4. Biopsia polmonare, dissanguamento e raccolta del sangue

1. Inserire una linea centrale per la somministrazione di liquidi ed eparina.
   1. Fare un'incisione della linea mediana di 5-8 cm con elettrocauterizzazione centrata sulla trachea e che si estende cranialmente dalla tacca sternale.
   2. Usando il cauterizzazione, dividere la pelle e il grasso sottocutaneo.
   3. Per identificare il fascio intravascolare carotideo sinistro o destro laterale alla trachea, dividere il piano della linea mediana tra i muscoli della cinghia e separare gli strati del tessuto connettivo.
   4. Utilizzando cravatte di seta 2-0 come anelli di vaso, ottenere il controllo distale e prossimale della vena giugulare.
   5. Per controllare il flusso sanguigno, legare la cravatta cranica che circonda e ritrarre verso l'alto sulla cravatta prossimale.
   6. Per accogliere una linea centrale di 7 Fr, praticare una piccola incisione nella vena usando le forbici Metzenbaum (~1/3 della circonferenza della nave).
   7. Rilasciare la tensione sul vaso prossimale contemporaneamente cannulare la vena. Legare la seta per fissare la cannula nella vena ad una profondità di 10 cm.
   8. Collegare a una linea IV di soluzione salina normale allo 0,9% dopo aver lavato la linea con eparina (1 unità / ml). Se il maiale è impoverito per via intravascolare dalla disidratazione, somministrare il liquido. Hep-lock tutte le porte inutilizzate.
2. Eseguire una sternotomia mediana
   1. Identificare la tacca sternale e i processi xifoidi come punti di riferimento incisionali.
   2. Utilizzare l'elettrocauterizzazione per eseguire un'incisione della linea mediana che si estende su tutto lo sterno (circa 40-50 cm) e collega l'incisione precedente alla tacca sternale allo xifoide.
   3. Dividere il tessuto sottocutaneo e la fascia tra le fibre del muscolo pettorale maggiore. Cauterizzare eventuali vasi sanguinanti per mantenere l'emostasi.
   4. Utilizzare l'elettrocauterizzazione per contrassegnare la linea mediana lungo l'osso sternale. Usa pesanti forbici per tagliare lo xifoide e usa un dito per sezionare senza mezzi termini il pericardio dal tavolo posteriore dello sterno per creare uno spazio palpabile per ospitare la sega sternale.
   5. Applicare due fermagli per asciugamano sui lati opposti dello sterno a livello delle 4 costole laterali alla giunzione costocondrale. Acquista il tessuto sovrastante e lo strato di fascia all'interno delle clip per asciugamano e solleva lo sterno verticalmente lontano dal cuore durante la sternotomia.
   6. Eseguire la sternotomia con una sega elettrica o pneumatica, denti in alto, partendo dallo xifoide verso la tacca sternale. Per evitare lesioni alle strutture sottostanti (ad es. pericardio e vena brachiocefalica e arteria innominata), procedere gradualmente con la sega e ritrarre verticalmente utilizzando clip per asciugamani.
      NOTA: Lo sterno si immerge in profondità posteriormente alla tacca sternale e la sega deve essere diretta posteriormente per completare la sternotomia a quel livello.
   7. Utilizzare cauterizzazione per ottenere l'emostasi dello sterno sanguinante.
      NOTA: La cera ossea può anche essere impiegata per questo scopo.
   8. Erogare 1.000 U/kg di eparina per via endovenosa. Prelevare un campione di sangue in vivo 5 minuti dopo la somministrazione di eparina.
   9. Usa un dito per sezionare senza mezzi termini la pleura dallo sterno interno per creare spazio per il divaricatore sternale.
   10. Inserire un divaricatore sternale con una maniglia verso l'addome e ritrarre gradualmente per esporre completamente il mediastino.
3. Rimuovere il timo dal pericardio usando una combinazione di dissezione smussata con un dito ed elettrocauterizzazione.
   NOTA: è meglio rimuovere il timo come un unico pezzo grande piuttosto che piccoli pezzi.
4. Fai una biopsia del lobo polmonare superiore destro per l'analisi dei tessuti: apri la pleura destra per esporre il lobo superiore destro. Circondare una porzione di 1 cm³ con 0-seta, legare e asportare questa porzione del polmone usando le forbici Metzenbaum.
   1. Dividere la biopsia in tre porzioni di uguali dimensioni e posizionare una di ciascuna in gel di temperatura di taglio ottimale (OCT), formalina e azoto liquido (congelamento a scatto).
   2. Conservare i campioni di PTOM e congelati a scatto in un congelatore a -80 °C e conservare i campioni di formalina in frigorifero a 4 °C utilizzando un contenitore adeguatamente sigillato.
      NOTA: I campioni di biopsia sono colorati con colorazione dell'ematossilina-eosina per esaminare l'istopatologia del danno polmonare, tra cui edema interstiziale, infiammazione alveolare e interstiziale, infiltrati neutrofili interstiziali e perivascolari ed emorragia¹⁵.
5. Apri il pericardio. Tenda il pericardio usando una pinza e fai un'incisione nella linea mediana del pericardio con le forbici Metzenbaum.
   1. Continuare questa incisione cranialmente alla radice aortica, quindi lateralmente per esporre la vena cava superiore (SVC). Completare la pericardiotomia caudalmente e T-off l'incisione sinistra e destra a livello dell'apice cardiaco.
6. Eutanasia del maiale per dissanguamento. Incidere l'SVC e inserire un'aspirazione con punta Poole (vedi Tabella dei materiali) nel lume, facendo avanzare la punta di aspirazione verso la vena cava inferiore (IVC).
   NOTA: Viene praticata un'incisione nella parete anteriore dell'atrio sinistro (LA) per accelerare il dissanguamento.
   1. Sollevare l'apice del cuore e incidere il LA 1 cm sotto il seno coronarico usando le forbici Metzenbaum. Al dissanguamento, passare dal 100% O₂ all'aria ambiente.
7. Raccogliere sangue intero: l'aspirazione della punta di Poole è collegata a un dispositivo di risparmio cellulare per raccogliere 1200 ml di sangue intero, che viene ruotato per produrre 500 ml di globuli rossi imballati (pRBC).
   NOTA: Impostazione del protocollo Cell Saver: Flusso di riempimento: 300 mL/min, Flusso di lavaggio: 100 mL/min, Flusso vuoto: 150 mL/min, Flusso di ritorno: 150 mL/min, Volume di lavaggio: 300 mL, Flusso di concentrazione: 200 mL/min. Ci vorranno ~ 5 minuti.

5. Cardiectomia

1. Eseguire la cardiectomia: sollevare l'apice cardiaco cranialmente e continuare la precedente incisione LA lateralmente per transettare il seno coronarico dove la vena emi-zigote sinistra si unisce ad esso.
2. Dividere il LA tagliando medialmente attraverso la superficie anteriore della biforcazione PA.
3. Transetto l'IVC 1 cm sopra il diaframma. Collegare questa incisione al LA tagliando medialmente.
4. Completa la divisione del LA tagliando lungo la parte superiore dell'arteria polmonare destra in direzione della biforcazione PA.
   NOTA: Questo passaggio esclude la vena polmonare superiore destra dalla LA posteriore.
5. Sollevare l'IVC cranialmente e dividere la vena polmonare superiore destra. Dividere le riflessioni pericardiche che si fondono tra la PA principale e l'atrio destro (RA)/SVC.
6. Metti giù il cuore e transetta lo SVC. Dividere posteriormente l'SVC dallo strato di tessuto connettivo e transettare la vena azygous.
7. Sollevare il cuore cranialmente, dividere il PA a livello della valvola polmonare. Sezionare parzialmente l'Aorta dal PA usando le forbici Metzenbaum, quindi transettare l'Aorta ascendente.
   NOTA: Questo completa la cardiectomia.

6. Pneumonectomia

1. Eseguire la pneumonectomia: verificare che il volume corrente espiratorio (TVe) sia di circa 10 ml/kg. Passa a 2:1 inspiratorio: rapporto espiratorio per raggiungere questo obiettivo. Se il televisore rimane < 6 ml / kg, aumentare le pressioni di picco e / o PEEP per raggiungere l'obiettivo di 8-10 ml / kg per il massimo reclutamento alveolare.
2. Apri la pleura sul lato sinistro del maiale. Fai un'incisione orizzontale lungo la tavola posteriore dello sterno usando le forbici Metzenbaum. Fai due incisioni verticali lungo la pleura fino al nervo frenico ai bordi superiori e inferiori del mediastino.
   1. Asportare la pleura tagliando lungo il nervo frenico. Ripeti questo passaggio sul lato destro. Aprire e rimuovere la pleura diaframmatica in modo simile, usando la cuffia posteriore LA come bordo inferiore, in modo simile al nervo frenico.
3. Dividere gli attacchi pleurici dal diaframma verso il lobo polmonare inferiore sinistro. Utilizzare un divaricatore Deaver (vedere la tabella dei materiali) per tenere il diaframma verso l'alto. Dividere il legamento polmonare inferiore a sinistra e proseguire verso l'ilo.
4. Tentare una "tecnica no-touch" per quanto riguarda il tessuto polmonare stesso.
   NOTA: Cioè, tentare una manipolazione manuale minima del polmone per prevenire traumi.
5. Sul lato destro, dividere gli attacchi IVC e pleurici dal diaframma. Ritrarre il diaframma verso l'alto usando il divaricatore Deaver. Dividere il legamento polmonare inferiore sul lato destro e continuare verso l'ilo.
6. Dividere la vena innominata e i vasi ad arco per esporre la trachea.
7. Sezionare senza mezzi termini il tessuto che circonda la trachea. Con volumi correnti espiratori (TVe) a circa 10 ml/kg, bloccare la trachea utilizzando un morsetto per tubi alla massima inspirazione.
8. Transetto la trachea e sollevare la parte bloccata verso l'alto per i passaggi rimanenti per fornire trazione chirurgica.
9. Sezionare la trachea posteriore dall'esofago usando la dissezione smussata con pesanti forbici Metzenbaum e una mano libera. Dividere eventuali attaccamenti pleurici rimanenti, transettare l'aorta sopra e sotto il bronco sinistro e rimuovere i polmoni dal torace con un segmento di aorta discendente.
10. Pesare i polmoni con il morsetto e conservarli rapidamente in un refrigeratore pieno di ghiaccio. L'aumento di peso durante la corsa ESLP è un indicatore della formazione di edema.
    NOTA: Questo completa la pneumonectomia.

7. Posizionamento dei polmoni sull'apparecchio ESLP

1. Aggiungere 500 mL di pRBC al circuito di perfusione (precedentemente innescato con 1L di CHIP, passo 1.8) per raggiungere un volume finale di 1,5 L di perfuffato.
   NOTA: La concentrazione di emoglobina è mirata a circa 50 g / L o un ematocrito del 15%.
2. Scatta fotografie dei polmoni per i record di dati.
3. Biopsia del lobo polmonare medio destro. Circondare una porzione di 1 cm³ con 0-seta, legare e asportare questa porzione del polmone usando le forbici per l'analisi dei tessuti come descritto in precedenza (passo 4.4).
4. Fissare l'adattatore per tubi da 3/8, 1/2 pollice all'arteria polmonare principale (mPA). Afferrare i lati opposti dell'mPA usando gli snap. Inserire l'adattatore con la porzione da 1/2 pollice nell'mPA e tenerlo in posizione mentre un assistente fissa l'adattatore in posizione utilizzando fascette di seta 0.
   NOTA: L'adattatore deve trovarsi 2-3 cm sopra la biforcazione PA (se il PA ha una lunghezza inadeguata, un segmento dell'aorta discendente del maiale donatore può essere cucito da un capo all'altro sull'mPA per una lunghezza aggiuntiva).
5. Posizionare i polmoni supini sulla membrana di supporto in silicone e collegarli al dispositivo ESLP.
6. Posizionare un secondo morsetto per tubi sulla trachea vicino alla posizione del bronco tracheale. Rimuovere il morsetto più distale e intubare la trachea con il tubo endotracheale (ETT).
   1. Fissare l'ETT in posizione utilizzando due fascette. Bloccare la linea di ventilazione utilizzando un morsetto per tubi e rilasciare il morsetto prossimale dalla trachea.
      NOTA: I polmoni rimangono gonfiati se questo viene fatto correttamente e non ci sono perdite d'aria.
7. Collegare l'adattatore PA alla linea PA e de-airare l'mPA. Avviare il timer per la perfusione.
   NOTA: vedere la Figura 5 per una rappresentazione fotografica dei passaggi.

8. Inizio della perfusione e della ventilazione

1. Nella pagina Impostazioni , fare clic su Avvia riscaldatore e impostare la temperatura su 38 °C. Inserisci anche il peso del maiale per calcolare la gittata cardiaca (flusso).
2. Nella pagina principale , impostare CPAP su 20 cm H₂O e fare clic su Avvia CPAP. Quando inizia la ventilazione, sbloccare la linea di ventilazione.
3. Zero il sensore di pressione arteriosa. Bloccare la linea PA sopra il sensore di pressione con un morsetto per tubi. Aprire il sensore per l'aria ambiente, fare clic su ZERO PAP e Zero Bld Flow nella pagina Impostazioni , quindi verificare che le letture siano azzerate nella pagina principale .
   1. Chiudere il rubinetto del sensore di pressione per leggere la pressione di linea, aprire la linea alla cannula PA, selezionare 10% di gittata cardiaca nella pagina principale, fare clic su Torna al manuale PA (il pulsante diventa verde), quindi sbloccare la linea PA.
      NOTA: la linea è ora azzerata in modo appropriato e la pompa scorre ora al 10% della gittata cardiaca calcolata.
4. Aspirare 10 ml di perfufato per l'analisi centrifuga e aspirare un ABG a tempo zero (T0).
5. Una volta che i polmoni sono stati perfusi per 10 minuti, aumentare il flusso al 20% della gittata cardiaca.
6. Quando la temperatura del perfusato raggiunge i 32 °C, fissare il coperchio della camera in posizione con morsetti per creare una tenuta ermetica. Posizionare in modo ottimale i polmoni prima di posizionare il coperchio. Riparare eventuali perdite d'aria con prolene taglia 6-0 su aghi BV-1.
7. Con il coperchio chiuso, bloccare il tubo di ventilazione e spegnere CPAP. Nella pagina Impostazioni fare clic su Zero ITP, Zero Paw, Zero Air Flow, quindi verificare che le letture siano azzerate nella pagina principale .
   1. Fare clic su Start CPAP a 20 cm H₂O e sbloccare il tubo di ventilazione. Quindi, impostare EEP target su 0 cm H 2O, EIP su 1 cm H₂0, RR 10, I:E ratio 1:1 e fare clic su Press to Start Vent (Premere per avviare lo sfiato) per attivare la ventilazione a pressione negativa.
   2. Ascoltare lo sfiato cambiare la sua funzione, quindi collegare il tubo di ventilazione della porta laterale alla camera.
      NOTA: Il ventilatore inizia il suo ciclo respiratorio in espirazione. I polmoni si comprimono leggermente se la porta laterale è attaccata durante un'espirazione. È preferibile attendere e ascoltare l'inalazione, quindi collegare la porta laterale per massimizzare il reclutamento.
8. Nei prossimi respiri, diminuire la CPAP a 12 cm H 2O aumentando contemporaneamente l'EIP a -9 cm H 2 O. Mantenere questi parametri di ventilazione per la prima ora, quindi ridurre la CPAP a 8-10 cm H 2 O a seconda del reclutamento alveolare e aumentare l'EIP a -12 a -13 cm H₂O.
9. Impostare le pressioni di picco a 20-21 cm H₂O.
   NOTA: Se sono state richieste pressioni più elevate al momento della pneumonectomia, allora quella diventa la pressione di picco target.
10. Quando la temperatura del perfusato raggiunge i 35 °C, aumentare il flusso al 30% della gittata cardiaca.
    NOTA: Queste sono le impostazioni per la conservazione degli organi (Tabella 2).
11. A 3, 5, 7, 9, 11 h, valutare con flussi del 50% della gittata cardiaca e l'aggiunta di gas di sweep misto (89% N 2, 8% CO 2, 3% O₂) aggiunto al deossigenatore a 0,125 L/min per simulare l'utilizzo sistemico di ossigeno (Tabella 3).
12. Ad ogni ora dispari durante la modalità di conservazione, prelevare un campione di 10 ml di perfufato per analisi future. Prelevare un pre-deossigenatore da 1 ml di ABG ogni ora.
13. Dopo 5 minuti di modalità di valutazione, prelevare gli ABG dalle porte pre e post deossigenatore (Tabella 4).
    NOTA: Questo completa il posizionamento dei polmoni su ESLP e l'inizio della perfusione e della ventilazione. Cfr. tabella 2 per l'avvio del protocollo. La tabella 3 descrive in dettaglio le due modalità di VAN-ESLP impiegate.

9. Supporto metabolico del polmone

1. Controllare il livello di glucosio perfusato ogni ora tramite analisi ABG. Obiettivo di glucosio a 3-6 mmol/L e titolare in base ai tassi di consumo utilizzando una pompa per infusione standard per infusione continua di glucosio e dosi in bolo, se necessario.
   NOTA: Un'altra pompa per infusione eroga un'infusione continua di 2 U/h di insulina. CHIP, insieme alla maggior parte delle altre soluzioni di perfusione d'organo, contiene glucosio come substrato energetico primario.

10. Eparina, agenti antimicrobici e antinfiammatori

1. Aggiungere 10.000 unità di eparina al perfusato all'inizio della perfusione prima dell'aggiunta di pRBC.
2. Aggiungere 3,375 g di piperacillina-tazobactam al perfusato all'inizio della perfusione prima di aggiungere pRBC.
3. Aggiungere 500 mg di metilprednisolone al perfusato all'inizio della perfusione prima di aggiungere pRBC.

11. Valutazione della funzione polmonare

1. Utilizzare le due distinte modalità di ventilazione e perfusione durante una corsa ESLP: conservazione e valutazione.
   NOTA: Vedere Conservazione e valutazione (Tabella 3). Modalità di conservazione: gittata cardiaca 30%, PEEP 8-12, EEP 0, EIP da -10 a -12, pressione di picco 20-22 cm H₂O, RR 6-10 e rapporto I: E 1: 1-1,5. Le corse ESLP durano in genere 12 ore, anche se possono essere estese a 24 ore.
2. Impostare la pressione di picco in modo che corrisponda alla pressione di picco della pneumonectomia e raggiungere un obiettivo TV di 10 ml / kg.
   NOTA: Sebbene sia mirato un TVe di 10 ml / kg, generalmente si raggiungono 6-8 ml / kg.
3. Ogni 30 minuti durante la conservazione, eseguire il reclutamento per 30 minuti o meno.
   NOTA: La durata e l'entità del reclutamento dipendono dalla TVe raggiunta. Se le TVe sono 8-10 ml/kg, non è necessario un ulteriore reclutamento.
4. Per il reclutamento, aumentare il PEEP a 10-12 cm H 2 O, diminuire RR a 6 respiri / min, aumentare le pressioni di picco di 2-4 cm H 2 0 senzasuperare i 30 cm H₂O (raramente superiamo i 25 cm H2O) e modificare il rapporto I: E a 1: 0,5.
   NOTA: Generalmente, solo una o due di queste modifiche vengono apportate per ogni intervallo di 30 minuti, con l'aumento della PEEP e della pressione di picco che è il più efficace.
5. A 3, 5, 7, 9, 11 h, valutare la funzione dell'organo.
   NOTA: Il principale parametro di interesse è il rapporto PF; tuttavia, la conformità dinamica e le pressioni PA sono strettamente monitorate (Figura 6).
6. Durante la valutazione, aumentare la gittata cardiaca al 50% mentre un gas di sweep misto (89% N 2, 8% CO 2, 3% O₂) viene aggiunto al circuito ad una portata di 0,125 L/min tramite il deossigenatore.
   NOTA: Questo replica l'esaurimento sistemico dell'ossigeno e si verifica nell'arco di 5 minuti. Durante questo periodo, ridurre il PEEP a 5 cm H₂O mantenendo le pressioni di picco, aumentando di conseguenza l'EIP. Mantenere RR a 10 bpm e impostare I: E su 1 o 1,5 a seconda che i polmoni sembrino intrappolare l'aria o meno.
7. Eseguire i calcoli funzionali per la resistenza vascolare polmonare, la ventilazione minuta, la compliance dinamica e il rapporto P / F.
   NOTA: La resistenza vascolare polmonare può essere calcolata da: [(PAP - LAP)/CO] x 80, dove LAP (pressione atriale sinistra) è 0 mmHg a causa della progettazione di un sistema di drenaggio LA aperto.
   La ventilazione al minuto è calcolata da: TVespiratorio x RR
   La conformità dinamica viene calcolata da: TVexpiratory/EIP
   Il rapporto P/F è calcolato da: PaO2/Fi02, dove FiO2 è del 21%.
   Il software ESLP calcola e registra automaticamente e continuamente gli indici di ventilazione e funzionali.

12. Valutazione metabolica dei polmoni perfusi ex situ

1. Valutare lo stato metabolico del perfufato ogni ora tramite ABG, che fungono da marcatore surrogato dello stato dei polmoni. Raccogliere 10 ml di perfusato dalla porta del pre-deossigenatore per analisi future.
   NOTA: L'emogasanalisi serve anche a monitorare lo stato gassoso e ionico del perfuffato.
2. Utilizzare PaO2 come marker della funzione polmonare complessiva.
   NOTA: Ciò è particolarmente vero durante le fasi di valutazione quando il gas di spazzamento misto viene aggiunto al circuito per simulare la deossigenazione sistemica. I gas pre e post deossigenatore vengono confrontati per valutare l'aumento dell'ossigeno da parte dei polmoni.
3. Colpire un'acidosi corretta a pH normale (7,35-7,45) con boli di tampone tris-idrossimetil amminometano (THAM) (vedere Tabella dei materiali).
   NOTA: L'alcalosi non viene generalmente corretta e non supera 7,55. Lo sweep di CO₂ può essere aggiunto al circuito per correggere questo alla normalità o se l'alcalosi supera questa soglia.
4. Trattare PaCO₂ in modo permissivo ed è generalmente nell'intervallo di 10-20 mmHg.
   NOTA: questi valori sono interpretati come un segno di ventilazione soddisfacente. Gli elettroliti non vengono regolati durante l'ESLP, ma vengono monitorati come parte dell'analisi ABG standard. Il lattato salirà durante l'aumento della durata dell'ESLP, così come il potassio. Il sodio rimane stabile (135-145 mmol / L) e il calcio è tipicamente basso. La Tabella 4 contiene i risultati rappresentativi del campione di analisi del perfusato di ABG durante una corsa di 12 ore di NPV-ESLP alla normotermia e al 30% della gittata cardiaca utilizzando un perfuso cellulare (sangue + CHIP).

13. Terminazione della perfusione, ventilazione e disconnessione dei polmoni dal dispositivo ESLP

1. Nella pagina Impostazioni fare clic su Arresta server.
2. Rimuovere il coperchio dalla camera. Scollegare l'adattatore PA dalla cannula PA.
3. Estubare la trachea. Per determinare la quantità di formazione di edema, pesare i polmoni.
4. Prendere una biopsia tissutale di 1 cm³ del lobo accessorio e dividerlo in tre pezzi come descritto in precedenza.
5. Eseguire le analisi finali dei gas, centrifugare i campioni di perfulato e conservare le biopsie tissutali come descritto in precedenza (fase 4.4).
   NOTA: Impostazioni di centrifugazione: Velocità, 112 x g; accelerazione, 9; decelerazione, 9; temperatura, 4 °C, e tempo, durata 15 min.
6. Chiudere il programma; Tutti i dati registrati verranno salvati.
7. Seguendo i protocolli istituzionali, scartare i tessuti, il sangue e i materiali bioattivi rimanenti.
8. Pulire il carrello ESLP utilizzando un detergente igienizzante per superfici dure (ad esempio, etanolo al 70%) e posizionare tutti i componenti riutilizzabili in un congelatore a -20 °C per ridurre la crescita dei batteri.

Risultati

All'inizio della perfusione polmonare e della ventilazione (modalità di conservazione), i polmoni avranno generalmente una bassa pressione dell'arteria polmonare (< 10 mmHg) e una bassa compliance dinamica (< 10 ml / mmHg) mentre il perfusato si riscalda alla normotermia. I maiali dello Yorkshire che pesano 35-50 kg in genere si traducono in polmoni del peso di 350-500 g. Durante la prima ora di NPV-ESLP, i volumi correnti espiratori misurati (TVe) sono 0-2 ml / kg e i volumi correnti inspiratori (TVi) sono 100-200 ml. ...

Discussione

Ci sono diversi passaggi chirurgici critici insieme alla risoluzione dei problemi necessari per garantire una corretta esecuzione ESLP. I polmoni suini giovanili sono estremamente delicati rispetto ai polmoni umani adulti, quindi il chirurgo procuratore deve essere cauto quando maneggia i polmoni suini. È fondamentale tentare una tecnica "no-touch" per evitare di causare traumi e atelettasia quando si sezionano i polmoni. "No-touch" significa utilizzare la quantità minima di manipolazione manuale dei polmoni durante l'...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
0 ETHIBOND Green 1 x 36" Endo Loop 0	ETHICON	D8573
2-0 SILK Black 12" x 18" Strands	ETHICON	SA77G
ABL 800 FLEX Blood Gas Analyzer	Radiometer	989-963
Adult-Pediatric Electrostatic Filter HME - Small	Covidien	352/5877
Arterial Filter	SORIN GROUP	01706/03
Backhaus Towel Clamp	Pilling	454300
Biomedicus Pump	Maquet	BPX-80
Cable Ties – White 12”	HUASU International	HS4830001
Calcium Chloride	Fisher Scientific	C69-500G
Cooley Sternal Retractor	Pilling	341162
CUSHING Gutschdressing Forceps	Pilling	466200
D-glucose	Sigma-Aldrich	G5767-500G
Deep Deaver Retractor	Pilling	481826
Debakey Straight Vascular Tissue Forceps	Pilling	351808
Debakey-Metzenbaum Dissecting	Pilling	342202
Scissors	Pilling	342202
Endotracheal Tube 9.0mm CUFD	Mallinckrodt	9590E	Cuff removed for ESLP apparatus
Flow Transducer	BIO-PROBE	TX 40
Human Albumin Serum	Grifols Therapeutics	2223708
Infusion Pump	Baxter	AS50
Inspire 7 M Hollow Fiber Membrane Oxygenator	SORIN GROUP	K190690
Intercept Tubing 1/4" x 1/16" x 8'	Medtronic	3108
Intercept Tubing 3/8" x 3/32" x 6'	Medtronic	3506
Intercept Tubing Connector 3/8" x 1/2"	Medtronic	6013
MAYO Dissecting Scissors	Pilling	460420
Medical Carbon Dioxide Tank	Praxair	5823115
Medical Nitrogen Tank	Praxair	NI M-K
Medical Oxygen Tank	Praxair	2014408
Organ Chamber	Tevosol
PlasmaLyte A	Baxter	TB2544
Poole Suction Tube	Pilling	162212
Potassium Phosphate	Fischer Scientific	P285-500G
Scale	TANITA	KD4063611
Silicon Support Membrane	Tevosol
Sodium Bicarbonate	Sigma-Aldrich	792519-1KG
Sodium Chloride 0.9%	Baxter	JB1324
Sorin XTRA Cell Saver	SORIN GROUP	75221
Sternal Saw	Stryker	6207
Surgical Electrocautery Device	Kls Martin	ME411
Temperature Sensor probe	Omniacell Tertia Srl	1777288F
THAM Buffer	Thermo Fisher Scientific	15504020	made from UltraPureTM Tris
TruWave Pressure Transducer	Edwards	VSYPX272
Two-Lumen Central Venous Catheter 7fr	Arrowg+ard	CS-12702-E
Vorse Tubing Clamp	Pilling	351377
Willauer-Deaver Retractor	Pilling	341720
Yankauer Suction Tube	Pilling	162300