Sezieren, Fixieren und Visualisieren der Drosophila pupal notum

Zusammenfassung

Das vorliegende Protokoll beschreibt die Präparation und Visualisierung von festsitzendem Gewebe des Drosophila pupal notum. Es kann entweder für intaktes oder verwundetes Gewebe verwendet werden, und die ursprüngliche Architektur des Gewebes bleibt erhalten. Die Verfahren zum Sezieren, Fixieren und Färben werden alle in diesem Artikel beschrieben.

Zusammenfassung

Die Puppen von Drosophila melanogaster sind während der Metamorphose mehrere Tage lang unbeweglich, während der sie einen neuen Körper mit einem dünnen transparenten erwachsenen Integument entwickeln. Ihre Unbeweglichkeit und Transparenz machen sie ideal für In-vivo-Live-Imaging-Experimente . Viele Studien haben sich auf die dorsale epitheliale Monoschicht des Puppennotums wegen ihrer Zugänglichkeit und relativ großen Größe konzentriert. Zusätzlich zu den Studien der Epithelmechanik und -entwicklung war das Notum ein ideales Gewebe, um die Wundheilung zu untersuchen. Nach einer Verletzung kann der gesamte epitheliale Reparaturprozess durch Live-Bildgebung über 6-12 h erfasst werden. Trotz der Beliebtheit des Notums für die Live-Bildgebung haben nur sehr wenige veröffentlichte Studien feste Notum-Proben verwendet. Fixierung und Färbung sind gängige Ansätze für fast alle anderen Drosophila-Gewebe und nutzen das große Repertoire an einfachen zellulären Färbungen und Antikörpern. Das Puppennotum ist jedoch zerbrechlich und anfällig für Locken und Verzerrungen nach der Entfernung aus dem Körper, was es schwierig macht, die Live-Bildgebung zu ergänzen. Dieses Protokoll bietet eine einfache Methode zur Fixierung und Färbung des Puppennotums, sowohl intakt als auch nach der Laserverwundung. Bei dieser Technik wird die ventrale Seite der Puppe auf ein Deckglas geklebt, um die Puppe zu immobilisieren, und das Notum wird vorsichtig entfernt, fixiert und gefärbt. Das Notumepithel ist auf einem Objektträger oder zwischen zwei Deckgläsern montiert, um die Bildgebung von der dorsalen oder ventralen Seite des Gewebes zu erleichtern.

Einleitung

Das Puppennotum von Drosophila melanogaster wurde in den letzten zehn Jahren zunehmend für Lebendbildgebungsstudien verwendet, da das Tier sowohl unbeweglich ist als auch in diesem Stadium eine transparente Kutikula hat^{1,2,3,4,5,6,7}. Das Puppennotum ist jedoch schwierig zu sezieren und zu fixieren, was es schwierig macht, Live-Bildgebungsstudien mit Antikörper- und Zellfärbung zu ergänzen. Das übergeordnete Ziel dieser Arbeit ist es, ein reproduzierbares Protokoll für die Sezierung und Fixierung des Puppennotums für Antikörper- und Zellfärbungen auf neuen oder zuvor live abgebildeten Proben zu erstellen.

Wenn Larven mit der Metamorphose beginnen, zieht sich die Epidermis von der Larvenkutikula weg und bildet einen harten Puppenfall⁸. Der Larvenkörperplan wird aufgeschlüsselt und der neue Körperplan für Erwachsene wird entwickelt. Während dieser Zeit sind Puppen unbeweglich, was sie ideal für die Live-Bildgebung macht. Ein häufig abgebildetes Gewebe ist das Pupal Notum, ein erwachsenes Monolayer-Epithel, das sich im dorsalen Thorax bildet. Das Notum ist nach einer einfachen Dissektion visuell zugänglich, um den Puppenfall⁹ zu entfernen. Das ganze Tier kann dann montiert werden, und das Notum kann stunden- oder tagelang live abgebildet werden, was es zu einem idealen Gewebe macht, um das Verhalten von Epithelzellen während der Entwicklung, der Homöostase und der folgenden Verwundung^{zu untersuchen 10,11,12,13,14}. Das Notum ist jedoch schwierig zu sezieren und zu fixieren, da es zerbrechlich ist und mit einer dünnen transparenten erwachsenen Kutikula bedeckt ist, die hydrophob ist. Diese hydrophobe Kutikula macht sie anfällig für das Kräuseln in wässrigen Lösungen, wenn sie aus dem Rest des Körpers entfernt wird. So wurde nur selten über eine Notumdissektion und -fixierung berichtet und die Dissektion wird oft nicht beschrieben^15,16,17,18. Ohne ein detailliertes Protokoll in der Literatur ist es für einen Drosophila-Forscher unerschwinglich, die Live-Bildgebung durch die Färbung von Puppen zu ergänzen.

Diese Technik zielt darauf ab, Proben, die zuvor live aufgenommen wurden, einschließlich solcher, die laserverwundet wurden, reproduzierbar zu sezieren und zu fixieren. Da die Live-Bildgebung die Entfernung des Puppenkoffers erfordert, beginnt diese Dissektionstechnik mit der Entfernung des vorderen Puppenfalls, im Gegensatz zu früheren Protokollen, die Puppen innerhalb des Puppenfalls ^4,19,20 festnageln oder halbieren. Das Notum ist ein zerbrechliches Gewebe, und Wunden können seine Zerbrechlichkeit verschlimmern. Um dieses empfindliche Gewebe zu unterstützen, werden das Integument (das Epithel und die befestigte transparente erwachsene Kutikula) des Notums und ein Teil des Kopfes und des Abdomens vom Rest der Puppe weggeschnitten, während sie immer in eine wässrige Umgebung eingetaucht sind. Diese Methode reduziert die Wahrscheinlichkeit, dass sich das Gewebe kräuselt und unbrauchbar ist. Diese Technik hat verletztes Notumgewebe bereits 30 Minuten nach der Wunde (Abbildung 1E-H) und bei 3 h nach der Wunde (Abbildung 1I-L) erfolgreich gefärbt. Es wird erwartet, dass dieses Protokoll für die Dauer der Notumentwicklung oder Wundreparatur wirksam ist. Die aktuelle Technik wird für Forscher hilfreich sein, die die Live-Imaging-Fähigkeiten des Puppennotums mit der Fülle verfügbarer immunhistochemischer Reagenzien vereinen möchten.

Protokoll

Drosophila melanogaster (Fruchtfliegen) wurden bei 25 °C auf einem Standard-Maismehl-Melasse-Medium gehalten. Die Studien wurden an EGFP-markierten Histon-H2A-Puppen (w[*]; P{w+mC=His2Av-EGFP.C}2/SM6a). Die Fliegen wurden aus einem öffentlichen Lagerzentrum bezogen (siehe Materialtabelle).

1. Immobilisierung der Puppen

1. Tragen Sie einen 2-Zoll-Streifen doppelseitiges Klebeband auf einen Objektträger auf.
2. Identifizieren Sie weiße Prepuppen in Fläschchen, die bei 25 ° C angehoben werden, und verwenden Sie einen Marker, um ihre Position außerhalb der Durchstechflasche anzugeben. Die Durchstechflaschen werden auf 25 °C zurückgesetzt.
   HINWEIS: Weiße Prepuppen zeichnen sich durch ihre Unbeweglichkeit, weiße Farbe und veretete Spiralen aus. Diese bilden 0-1 h nach der Pupariumbildung (APF) oder Stadium P1⁸.
3. Entfernen Sie 12-15 Stunden später vorsichtig 3-4 der angegebenen Puppen (ohne sie zu knallen) mit einem Dissektionsfernrohr und sammeln Sie sie auf dem Objektträger neben dem Band.
   HINWEIS: Die Puppen befinden sich nun in der Stufe P5 mit einem Everted-Kopfsack, der am vorderen Ende⁸ der Puppen sichtbar ist.
4. Legen Sie die Puppen mindestens eine Puppenbreite auseinander auf das Band mit ihren Bauchseiten nach unten.
5. Tragen Sie einen Tropfen Klebekleber auf eine Paraffinfolie (siehe Materialtabelle) oder in einen Zentrifugenrohrdeckel auf. Tauchen Sie das Ende einer 0,1-10 μL Pipettenspitze (keine Pipette) in den Tropfen Klebstoff. Klopfen Sie die Pipettenspitze zweimal auf ein 24 mm x 60 mm (1,5 Dicke) Abdeckglas, 1 cm x 1 cm von einer Ecke entfernt, wodurch eine Linie aus Klebekleber ~ 1/2 der Länge der Puppe entsteht.
6. Stellen Sie eine 0,2-2 μL (P2) Pipette auf 2 μL und eine 200 μL (P200) Pipette auf 200 μL vor und bestücken Sie sie mit Spitzen, so dass sie bereit sind, mit 1x PBS + 0,1 mM Ca²⁺ gefüllt zu werden, wodurch der Klebekleber bei Kontakt schnell verfestigt wird.
7. Setzen Sie eine Pinzette (siehe Materialtabelle) in der Nähe der Seite des Kopfes ein und entfernen Sie das Gehäuse vorsichtig von der Vorderseite bis zur Hinterseite⁹. Entfernen Sie so viel wie möglich von der Hülle. Greifen Sie die sich entwickelnden Beine der Puppe mit einer stumpfen Pinzette und ziehen Sie die Puppe vorsichtig aus ihrem Koffer.
   HINWEIS: Eine kleine Ruptur am ventralen Teil der Puppen ist für dieses Verfahren nicht schädlich.
8. Legen Sie die Puppe in die Ecke des Deckglases.
9. Greifen Sie die Puppe am hinteren Bauch oder am sich entwickelnden Flügel mit stumpfen Pinzetten, heben Sie sie an und legen Sie die ventrale Seite der Puppen in die Linie des Klebeklebers.
10. Füllen Sie die P2-Pipette schnell mit 2 μL 1x PBS + 0,1 mM Ca^{2 +} , und halten Sie sie in der Luft, stoßen Sie gerade genug aus, um eine kleine Blase an der Spitze (0,25-0,5 μL) zu bilden.
11. Berühren Sie die kleine Blase der Lösung auf einer Seite der Puppen an der Basis des Thorax und wiederholen Sie sie dann auf der anderen Seite.
    HINWEIS: Dadurch wird eine kleine Menge des Klebeklebers verfestigt, um die Puppe an Ort und Stelle zu halten. Im Allgemeinen werden nicht alle Lösungen verwendet.
12. Füllen Sie die P200-Pipette mit 200 μL 1x PBS + 0,1 mM Ca²⁺, legen Sie dann die Spitze der Pipette über den Thorax und stoßen Sie den Inhalt aus, um die Puppen vollständig zu tauchen. Der Rest des Klebeklebers verfestigt sich sofort.
13. Entfernen Sie ~ 100 μL der PBS-Lösung, so dass die Puppe kaum eingetaucht ist, bevor Sie sofort mit dem nächsten Schritt fortfahren.
    HINWEIS: Für unverwundete Proben beginnen Sie mit Schritt 1.1. Bei verwundeten, teilweise sezierten Proben beginnen Sie mit Schritt 1.5. Die Wunde durch Laserablation wurde zuvor^{beschrieben 14,21}. Immobilisierungs-, Dissektions- und Montageschritte müssen mit einem Dissektionsmikroskop durchgeführt werden.

2. Sezieren des Notums

1. Greifen Sie eine Mikrodissektionsschere, die eine Seite des Griffs gegen den Zeigefinger und den Mittelfinger der dominanten Hand stützt, so dass der Daumen der dominanten Hand die Schnittkraft ausübt (Abbildung 2A, B).
2. Stabilisieren Sie den Hals der Schere gegen den Mittelfinger der nicht dominanten Hand, während Sie den Decklack mit dem Ringfinger der nicht dominanten Hand abstützen.
3. Schnippeln Sie an der Mitte des dorsalen Abdomens, um ein kleines Loch zu erzeugen, ~ 0, 2-0, 5 mm. Etwas Hämolymphe wird normalerweise auslaufen und ist ein guter Indikator für die Verletzung.
4. Machen Sie kleine 0,5-0,75 mm Schnitte durch das Integument von der Hinterseite nach der Vorderseite und umschließen Sie das Rückengewebe, um es zu isolieren. Um ein möglichst flaches Gewebe zu schaffen, vermeiden Sie es, zu ventral zu schneiden. Nur die dorsale "Kuppel" des Thorax sollte zusammen mit kleinen Abschnitten des Kopfes und des Abdomens entfernt werden.
5. Wiederholen Sie hintere bis vordere Schnitte auf der anderen Seite der Puppen.
6. Drehen Sie die Sezierstufe, um bei Bedarf einen sauberen Schnitt durch den Kopf zu ermöglichen.
   HINWEIS: In diesem Stadium wird das dorsale Integument oder Notum vom Rest der Puppe getrennt. Wenn es getrennt erscheint, aber nicht leicht bewegt werden kann, können ein paar Schnitte unterhalb des Notums helfen, es zu entfernen.
7. Fügen Sie ~ 200 μL von 1x PBS in die Mitte des Deckglases hinzu und machen Sie einen Kanal, der es mit dem ursprünglichen Dissektionstropfen verbindet, indem Sie die Pipettenspitze vorsichtig über das Deckglas vom neuen Tröpfchen zum Original ziehen.
8. Drücken oder ziehen Sie mit einer stumpfen Pinzette das isolierte Notum vorsichtig in die Mitte des Deckglases und drehen Sie es, so dass die Innenseite nach oben zeigt. Entfernen Sie niemals das Gewebe aus dem Tröpfchen.
   HINWEIS: Es ist wichtig, das Notum von der ursprünglichen Sezierstelle wegzubewegen, um zu vermeiden, dass Reste des Klebstoffs die Probe während der späteren Bildgebung verschließen.
9. Halten Sie das Notum mit der stumpfen Pinzette fest, indem Sie in die Bauch- oder Kopfabschnitte drücken. Entfernen Sie mit einer scharfen Pinzette und / oder sanften Austreibungen von 1x PBS aus einer 200-μL-Pipette alle verbleibenden Fettkörper, Muskelbänder oder Hämolymphe (falls vorhanden), um das Monolayer-Epithel vollständig freizulegen und die eventuelle Färbung gleichmäßiger zu machen. Das sezierte Notum sollte wie in Abbildung 3A dargestellt werden.
10. Sobald das Gewebe sauber ist, verwenden Sie eine 200-μL-Pipette, um so viel wie möglich von der PBS-Lösung (zusammen mit Ablagerungen und dem ventralen Teil der Puppen) zu entfernen, wobei Sie mit einem Dissektionsbereich überwachen, um eine Aspiration des Notums zu vermeiden.
11. Sobald der größte Teil der Flüssigkeit entfernt wurde, verwenden Sie ein saugfähiges Gewebe, um den Rest des Klebeklebers und der Puppe sowie alle anderen Ablagerungen, die auf dem Deckglas verweilen, vorsichtig abzuwischen.
    HINWEIS: Wenn etwas Klebekleber auf dem Deckglas verbleibt, verursacht dies kein Problem, solange es dünner ist als das Rückengewebe selbst.
12. Fügen Sie 150-200 μL 4% PFA (in 1x PBS) hinzu und fixieren Sie für 20 Minuten bei Raumtemperatur. Abhängig von der Seziergeschwindigkeit können 1 oder mehr Puppen während der Fixierung der ersten Puppe seziert werden.
13. Entfernen Sie die PFA und ersetzen Sie sie durch 1x PBS, um das Notum einmal für 30 s zu waschen.
14. Wenn Sie mit der Antikörperfärbung fortfahren, führen Sie 5-minütige Waschungen (3 mal) in 1x PBS oder 1x PBST (Supplementary File 1) durch, um das Gewebe zu permeabilisieren, wenn das Antigen intrazellulär ist.
15. Lagern Sie die Probe in 1x PBS + 0,02_{% NaN 3} über Nacht in einer befeuchteten Kammer oder, wenn Sie planen, das Gewebe zu färben, über Nacht in Blockierlösung (Zusatzdatei 1) inkubieren.

3. Färben des Notums

HINWEIS: Führen Sie für die Färbung mit Antikörpern oder Zellflecken die folgenden Schritte aus. -Das Notum darf nicht aus der Lösung entfernt werden, da dies wahrscheinlich dazu führt, dass sich das Gewebe kräuselt. Passen Sie daher die Färbeprotokolle so an, dass sie vollständig auf dem Deckglas durchgeführt werden, und bewahren Sie sie in einer befeuchteten Kammer für alle Schritte länger als 5 Minuten auf. Die Überwachung der Proben unter einem Dissektionsmikroskop kann dazu beitragen, eine versehentliche Aspiration des Gewebes während des Waschens zu verhindern.

1. Um die Zellränder sichtbar zu machen, inkubieren Sie in 200 μL primärem Anti-FasIII-Maus-IgG2a-Antikörper (siehe Materialtabelle) bei einer Konzentration von 1:8, verdünnt in Blocking Buffer + 0,02%_NaN3 über Nacht bei 4 °C.
2. Auswaschen Sie überschüssigen primären Antikörper (3 mal) mit 200 μL von 1x PBS + 0,02% NaN₃ für 1 h pro Waschgang bei Raumtemperatur.
3. Sekundäre Antikörperinkubation mit 200 μL 1:200 Konzentration Anti-Maus-IgGa2 in Cy3 im Blockierpuffer + 0,02_{% NaN3} für 2 h bei Raumtemperatur durchführen.
4. Überschüssige sekundäre Antikörper (3 mal) mit 200 μL 1x PBS + 0,02% NaN₃ für 1 h pro Waschgang bei Raumtemperatur auswaschen.
5. Um die Kerne zu visualisieren, inkubieren Sie Proben in 1 μg / ml DAPI für 45 Minuten, um genügend Zeit für den Fleck zu haben, durch Muskelbänder zu dringen; Die Befestigung in einem DAPI-haltigen Befestigungsmedium ist bei diesem Gewebe nicht wirksam.
6. Überschüssiges DAPI (3 mal) mit 200 μL 1x PBS + 0,02% NaN 3 für 5 min pro Waschgang bei Raumtemperatur auswaschen, dann 200 μL 1x PBS + 0,02_% NaN₃ über Nacht bei 4 °C einwirken lassen oder sofort montieren.

4. Montage und Visualisierung des Notums

1. Bereiten Sie nach dem Färben ein neues 24 × 60 Deckglas (Topper) mit Stützen vor.
   HINWEIS: Da das Notum kuppelförmig ist, führt das Abflachen vollständig zu verzerrtem faltigem Gewebe. Durch das Erzeugen einer Lücke zwischen den beiden Deckgläsern behält das Notum seine normale Form.
2. Erzeugen Sie einen Spalt von ~200 μm, indem Sie Abstandshalter aus 22 x 22 Deckgläsern (Nr. 0 Dicke, ~100 μm dick) verwenden, die mit Nagellack in der Mitte des Toppers im Abstand von ~ 1 cm aufgeklebt sind.
3. Um zu kleben, legen Sie die Abstandshalter auf den Topper und lackieren Sie die distalen Kanten der Abstandshalter mit einer dünnen Schicht Nagellack. Trocknen lassen.
   HINWEIS: Verwenden Sie nur einen Nagellack, der dünn und flüssig ist. Dicker Nagellack fügt unnötigen zusätzlichen Platz zwischen dem Deckglas und dem Topper hinzu.
4. Entfernen Sie so viel wie möglich von der wässrigen Lösung aus der Probe.
5. Tragen Sie sofort zwei Tropfen (~100 μL) Anti-Fade-Montagemedium (siehe Materialtabelle) auf die Probe auf.
6. Verwenden Sie bei Bedarf eine saubere, scharfe Pinzette, um das Notum in der Mitte des Anti-Fade-Montagemedium-Tröpfchens zu positionieren.
7. Legen Sie das Deckglas mit dem Notum auf eine ~ 10 x 40 mm große Stütze, z. B. ein Stück dünnen Schaumstoff (aus dem Verpackungsmaterial in Deckglasschachteln geschnitten), um die Probe so anzuheben, dass sie nicht an der Arbeitsfläche haftet.
8. Lassen Sie den Topper unter einem Sezierfernrohr langsam auf die Probe ab. Sobald das Anti-Fade-Montagemedium auf den Topper trifft, lassen Sie ihn vorsichtig los und lassen Sie die Kapillarwirkung zu, um den Topper nach unten zu ziehen.
   HINWEIS: Innerhalb der ersten Sekunden können kleinere Anpassungen an der Deckglasposition vorgenommen werden, ohne das Notum zu beschädigen.
9. Legen Sie ein weiteres Stück Schaumstoff auf den Topper und verwenden Sie einen Standard-Objektträger als Gewicht, um das Anti-Fade-Montagemedium vorsichtig zwischen dem Probendeckel, dem Topper und den Abstandshaltern zu entlocken.
10. Verwenden Sie nach 5-10 min ein saugfähiges Gewebe, um überschüssiges Anti-Fade-Montagemedium abzuleiten, indem Sie die Kanten des Deckglases vorsichtig berühren.
11. Tragen Sie vorsichtig Nagellack auf jede Ecke der Deckgläser auf, um sie zusammenzukleben. Nach dem Trocknen lackieren Sie alle Kanten der Deckgläser, um sie zu versiegeln. Vermeiden Sie es, zuerst alle Kanten zu beschichten, da dies oft das Deckglas verschieben und das Rückengewebe beschädigen kann.
12. Visualisieren Sie das Notum unter Fluoreszenzmikroskopie (siehe Materialtabelle) durch die dorsale und/oder ventrale Seite.

Ergebnisse

Die vorgestellte Technik funktioniert gut am unverwundeten Notum (Abbildung 1A-D) und ermöglicht die Untersuchung der Entwicklung und Homöostase des Gewebes, z. B. der Bildung der polyploiden mechanosensorischen Borstenzellen 18 oder des vorderen zum hinteren Fluss von Epithelzellen¹⁰. Dieses Protokoll ist auch auf ein laserablatiertes Notum anwendbar (Abbildung 1E-L), wo die zelluläre Reaktion auf Verletzungen live mit endogenen Fluorophoren wie Histon2-EGFP analysiert werden kann (Abbildung 1B, F, J). Die Nachfärbung mit der Immunhistochemie (Schritt 3) kann viele Merkmale aufdecken, wie z.B. Fasciclin III, das Zellränder markiert (Abbildung 1C, G, K). Darüber hinaus können quantitative Färbungen wie DAPI (Abbildung 1A, E, I) verwendet werden, um DNA-Inhaltsänderungen zu beurteilen, einschließlich der wundinduzierten Polyploidie²².

Das aktuelle Protokoll ist besonders vorteilhaft, da es nach Langzeit-Live-Imaging-Experimenten verwendet werden kann. Da Puppen unbeweglich sind, können sie stundenlang abgebildet werden (Abbildung 4A, B). Wichtig ist, dass dieses Protokoll nach der Dissektion keine wesentlichen Veränderungen an der Gesamtarchitektur oder Morphologie des Wundepithels verursacht (Abbildung 4B, C). So konnten Merkmale innerhalb des Gewebes langfristig abgebildet und dann mit Immunhistochemie oder zellulären Färbungen weiter untersucht werden.

Die Bildgebung tief im Gewebe ist aufgrund ihrer Opazität komplex, und Drosophila sind in einer wachsartigen Kutikula^{8 beschichtet,} was die Tiefenbildgebung noch schwieriger macht. Bei dieser Technik kann jedoch ein seziertes Notum zwischen zwei Deckgläsern platziert werden, so dass die epitheliale Monoschicht von beiden Seiten abgebildet werden kann: die apikale Seite durch die Kutikula (Abbildung 5A-D) und / oder die basale Seite des Epithels, die der Körperhöhle zugewandt ist (Abbildung 5E-H). Diese verschiedenen Ansichten sind ideal geeignet, um verschiedene Strukturen innerhalb des Gewebes sichtbar zu machen. Zum Beispiel ist die apikale Ansicht ideal für die Visualisierung von Epithelzellgrenzen und Kernen, die direkt unter der Kutikula liegen (Abbildung 5A-D). Bei der basalen Betrachtung sind diese apikalen Signale weniger sichtbar (Abbildung 5E-H). Am Wundrand werden jedoch basale Strukturen beobachtet (Abbildung 5J, L gelb, weiße Pfeile). Diese basalen Strukturen sind viel heller, da es in der basalen Ansicht weniger Okklusion gibt als in der apikalen Ansicht.

Abbildung 1: Sezierte, fixierte und gefärbte Drosophila pupal nota. (A-D) Unwounded notum. (E-H), Verwundeter Notum 30 min nach Laserablation. (I-L) Verwundet notum 3 h nach Laserablation. (A,E,I) DAPI-Fleck zeigt Kerne. (B,F,J) Transgenes Histon2-EGFP, das in der Live-Bildgebung verwendet wird, ist nach dem Fixieren und Färben sichtbar. (C,G,K) Der Anti-FasIII-Antikörper zeigt, dass Antikörperfärbungen auf dem fixierten Notum gut wirken. (D,H,L) Zusammengeführtes Bild. Die Bilder werden mit 40-fachem Objektiv mittels Spinning-Disc-Mikroskopie aufgenommen, maximale Intensität Projektionen von Z-Stacks werden mit 0,3 μm Z-Slices gezeigt. A-D repräsentiert 263 Z-Slices. E-H repräsentiert 195 Slices. I-L steht für 53 Z-Slices. Die orange gestrichelte Linie kennzeichnet den Wundrand. Der Maßstab in L beträgt 25 μm, anwendbar auf A-L. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Abbildung 2: Handplatzierung für die Notumdissektion. (A-B) Linke und rechte Ansicht der Handplatzierung zum Halten der Mikrodissektionsschere. Um ein Händeschütteln zu verhindern, wird der Hals der Schere gegen den Mittelfinger der nicht dominanten Hand gelegt. Die Schere muss parallel zum Objektträger sein, um eine Verformung des Notumgewebes zu vermeiden. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Abbildung 3: Korrekt seziertes Notum vs. gekräuseltes Notum . (A) Pupal notum nach der Dissektion und Reinigung ungekräuselt und bereit zur Fixierung. (B) Pupal notum rollte sich nach dem Entfernen aus 1x PBS auf sich selbst und machte es so unbrauchbar. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Abbildung 4: Pre- und Post-Fixed-Bilder sind weitgehend ähnlich. Ein Puppennotum, das Histon2-EGFP in den Kernen exprimiert, wurde (A) vor der Ablation lebend und (B) 3 h nach der Laserablation aufgenommen. (C) Das Notum wurde wie im Protokoll erwähnt abgerufen, seziert und fixiert und nach der Fixierung erneut abgebildet. Die Wundstelle ist mit einem roten Stern gekennzeichnet. Die Bilder wurden mit 40-fachem Objektiv mittels Spinning-Disc-Mikroskopie aufgenommen, Z-Scheiben wurden alle 0,3 μm aufgenommen. Es werden maximale Intensitätsprojektionen von 34 Z-Scheiben vor der Wicklung (A), 48 Z-Scheiben 3 h nach der Wundung (B) und 103 Z-Scheiben nach der Sezierung, Fixierung und Färbung (C) gezeigt. Der Skalenbalken in C beträgt 25 μm, anwendbar auf A-C. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Abbildung 5: Abbildung apikaler und basaler Seiten eines verwundeten Notums. Das gleiche verwundete Puppennotum ist in allen Tafeln dargestellt. Die Wunde ist mit einem roten Stern markiert. Die orange gepunktete Linie zeigt den Wundrand an. (A-D) Das Notum ist von der apikalen Seite durch die Kutikula abgebildet. (E-H) Das Notum ist von der basalen Innenseite aus abgebildet. (I-L) Die oberen Tafeln zeigen ein X-Z-Bild des Notums, apikal mit der Seite nach oben, wobei das Epithelblatt durch ein weißes Dreieck gekennzeichnet ist. Die orangefarbene Linie kennzeichnet die apikal-basale Ebene der X-Y-Scheibe, die in den unteren Feldern dargestellt ist. Innerhalb der unteren Felder zeigt die orangefarbene Linie die Ebene des obigen X-Z-Bildes. (I) Apisch abgebildetes Notum - apikale Scheibe. Die obere X-Z-Ansicht zeigt eine präzise Abbildung des apikalen Epithelblattes (weißes Dreieck). Diese Ansicht entspricht einer Livebildansicht. (J) Apisch abgebildetes Notum - Basalschnitt, teilweise durch apikales Gewebe verstopft. Andere Gewebe, die durch einen gelben Pfeil (mögliches Muskelband) und weiße Pfeile (mögliche Blutzellen) gekennzeichnet sind, sind auf der Basalseite sichtbar. (K) Basal abgebildetes Notum - apikaler Schnitt, teilweise durch Basalgewebe und Wundschorf (dunkler zentraler Bereich) verstopft. (L) Basal abgebildetes Notum - Basalschnitt. Diese Ansicht zeigt am besten die Basalgewebe, die mit gelben und weißen Pfeilen gekennzeichnet sind. A,E: DAPI-Färbung, B,F: Histon-EGFP, C,G: FasIII-Färbung. Die Bilder wurden mit 20-fachem Objektiv mit Spinning-Disc-Mikroskopie aufgenommen. Alle 0,9 μm wurden Z-Scheiben entnommen. A-D zeigt die maximale Intensitätsprojektion von 19 Slices. E-H stellt die maximale Intensitätsprojektion von 17 Scheiben dar. 25 μm Skalenstäbe in D,H,L gelten für A-D, E-H, I-L. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Ergänzungsdatei 1: Vorbereitung von Lösungen und Puffern. Rezepte für die folgenden Lösungen sind detailliert: 1xPBS, 1x PBST, Blockierlösung und Paraformaldehydfixiermittel. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Diskussion

Kritische Schritte
Die Optimierung von drei Schritten wird den Erfolg dieses Protokolls dramatisch steigern. Erstens, in Schritt 1.5, schonen Sie mit dem Klebekleber, der auf das Deckglas aufgetragen wird. Wenn zu viel Klebekleber hinzugefügt wird, können die Puppen in einer dicken Schicht aus erstarrtem Klebstoff begraben werden, was eine Dissektion unmöglich macht, und wenn sie das Notum selbst bedeckt, wird der Klebstoffkleber das Licht aus der Probe verschließen. Zweitens, stellen Sie während der Schritte 2.3-2.6 sicher, dass nur die obere Kuppel des Notums entfernt wird, wobei so viel wie möglich vom lateralen Gewebe ausgeschlossen wird. Wenn es eingeschlossen ist, wird das laterale Gewebe während der Montage komprimiert und führt dazu, dass die Mitte des Notums nach innen knickt, wodurch es oft außerhalb des Arbeitsabstands von Objektiven mit hoher numerischer Apertur liegt. Drittens muss während des Reinigungsschritts 2.9 äußerste Vorsicht geboten sein, um das einschichtige Epithel nicht zu beschädigen. Wenn dem Gewebe große Teile fehlen oder kein Signal erkannt werden kann, ist dieser Schritt wahrscheinlich schuld.

Fehlerbehebung
Problem 1: Nach der Montage löst sich die Puppe während der Dissektion vom doppelseitigen Klebeband. Dies ist ein häufiges Problem, besonders für Anfänger. Das beste Mittel besteht darin, sicherzustellen, dass die Außenseite des Puppenkoffers vollständig trocken / frei von Speiseresten ist. Das Entfernen von Lebensmitteln mit einer stumpfen Pinzette und das Trocknen des Gehäuses für 10-15 Minuten an der Luft hilft, am Band zu haften. Alternativ können Sie die nicht dominante Hand und eine stumpfe Pinzette verwenden, um die Puppen während der Dissektion gegen das Band zu halten. Wenn das Problem weiterhin besteht, bietet das Auftragen eines kleinen, 5-10 μL Tropfens Nagellack auf die Basis des hinteren Endes des Gehäuses und das Aushärten im Allgemeinen eine ausreichende Haftung selbst für die widerspenstigsten Puppen.

Problem 2: Notum bricht während Schritt 2.3 zusammen, oder der anfängliche Verstoß durch das Integument ist nicht reibungslos. Wenn das Integument schwer zu durchbrechen ist, kann es zu viel Klebekleber von den Immobilisierungsschritten geben. Das Einsetzen der sezierten Puppen in weniger Klebekleber wird dieses Problem verbessern. Stellen Sie außerdem sicher, dass die Mikrodissektionsschere scharf ist. Stumpfe Schere wird nicht in der Lage sein, in das Integument zu schneiden und dazu zu neigen, es nach innen kollabieren zu lassen. Sobald die Hämolymphe aus den Puppen austritt, stellen Sie sicher, dass eine der Schneidklingen in die Puppe eindringen kann, ohne dass sich das Notum verformt. Wenn das Notum kollabiert und die Klinge nicht in die Puppe eindringt, fahren Sie mit dem Schneiden fort, bis eine Klinge in die Puppe eindringt.

Problem 3: Während Schritt 2.4 fängt oder zieht die Schere das Integument. Wenn die Schere beginnt, das Integument zu fangen oder zu ziehen, hilft es oft, auf die gegenüberliegende Seite der Puppen zu wechseln und das Integument zu "lockern". Eine weitere stumpfe Mikrodissektionsschere wird es schwierig machen, saubere Schnitte durch das Integument zu erzielen, und es muss eine geschärfte Schere verwendet werden.

Problem 4: Die Probe wird während der Färbung versehentlich abgesaugt (Schritte 3.1-3.6). Das sezierte Notum ist schwierig zu sehen, weil es transparent ist. Es kann hilfreich sein, ein dunkelblaues oder schwarzes Blatt unter dem Deckglas zu platzieren, um Kontrast zu schaffen (ein altes Pipettenspitzenhaltergestell funktioniert gut). Zusätzlich können alle Lösungswechsel unter einem Dissektionsmikroskop durchgeführt werden.

Problem 5: Es wird kein Signal erkannt / ein lückenhaftes Signal wird erkannt. Nach dem Ausschließen von fleckenspezifischen Problemen, wenn kein Signal erkannt wird oder es lückenhaft ist, ist Schritt 2.9 (Reinigung) wahrscheinlich der Schuldige. Ein fehlendes oder lückenhaftes Signal kann durch Schädigung und Entfernung des Epithelgewebes während der Reinigung entstehen. Umgekehrt kann ein schlechtes Signal durch Okklusion aus den Muskelbändern / Fettkörperzellen verursacht werden, wenn sie nicht entfernt werden, da sie die Diffusion von Flecken und Antikörpern in das Notum relativ zum umgebenden Gewebe begrenzen können. Wenn das Gewebe beschädigt ist, ist es die beste Lösung, während der Reinigung sanfter zu sein. Wenn der Fleck stattdessen sichtbar, aber fleckig ist, wird empfohlen, die Kraft / Zeit, die dem Reinigungsschritt gewidmet ist, zu erhöhen, um so viel Muskel- und Fettkörper wie möglich zu entfernen. Darüber hinaus kann die Erhöhung der Fleckendauer dazu beitragen, dieses Problem mit einer besseren Reinigung zu lösen.

Problem 6: Das Notumgewebe hat während der Bildgebung ein verzerrtes / faltiges Aussehen. Verzug und Falten des Gewebes stammen aus zwei Quellen. Erstens führt das Komprimieren des Notums während der Montage dazu, dass es knickt und sich verzieht. Die beste Lösung besteht darin, so viel wie möglich von den lateralen Geweben zu entfernen, damit die Kuppel so kurz wie möglich ist und zwischen die Abstandshalter passt. Zweitens, wenn das Notum während der Dissektion gebogen wird, wird sich diese Biegung während der Montage nicht ausrichten, so dass besonders darauf geachtet werden muss, das Notum während der Dissektion nicht zu verziehen. Versehentliches Biegen des Notums ist am häufigsten, wenn das Integument vom Rest der Puppen weggeschnitten wird. Es ist verlockend, die Sezierschere in einem Winkel relativ zu den Puppen zu haben, anstatt sie als Puppen in der Probenebene zu halten. Eine abgewinkelte Schere führt jedoch dazu, dass die Integument beim Schneiden nach oben knickt, anstatt flach zu bleiben.

Bestehende Methoden, Einschränkungen und zukünftige Anwendungen
Wang et ^al.20 berichteten über ein vergleichbares Dissektionsprotokoll zur Isolierung von Puppenepithel. Diese Technik erfordert, dass die Puppe in ihrem Gehäuse bleibt und schnell mit einem Skalpell halbiert wird. Dieses Protokoll ist nicht kompatibel mit zuvor live abgebildeten Proben, da Live-Imaging das Entfernen eines großen Teils des Puppengehäuses erfordert. Da es den Puppen an Steifigkeit mangelte, verstümmelte die Puppenbisektion außerhalb des Gehäuses das Gewebe und inspirierte die Erstellung dieses Protokolls. Die hier beschriebene Technik ermöglicht die Isolierung und Fixierung des Notums und könnte als erster Schritt für eine Vielzahl anderer Methoden wie Kryosektionierung, In-situ-Hybridisierung oder Elektronenmikroskopie verwendet werden.

Diese Technik hat einige Einschränkungen. Erstens ist das Sezieren, Fixieren und Färben des Notums zeitaufwendiger als die Live-Bildgebung fluoreszierend markierter Proteine im Notum, die nur eine einfache Dissektion erfordert, um den Puppenfall ^9,23 zu entfernen. Zweitens ist diese Dissektion im Vergleich zu Dissektionen anderer Drosophila-Gewebe aufgrund des dünnen, zerbrechlichen Gewebes und der hydrophoben Kutikula schwieriger. Für die einfache Visualisierung von Proteinen in Drosophila-Epithelien ist die Immunhistochemie an fixierten Embryonen, Larvenflügelscheiben oder Eierstöcken einfacher. Diese Technik ermöglicht es jedoch, die Kraft der Live-Bildgebung mit Fixierung und Färbung zu kombinieren, was sie zu einem leistungsstarken Werkzeug macht, sobald sie gemeistert wurde.

Eine Dissektions- / Fixationstechnik hat einige Vorteile gegenüber der Live-Bildgebung. Basale (innere) Strukturen können mit einer basalen Ansicht besser aufgelöst werden (Abbildung 5L,J). Am wichtigsten ist, dass die Live-Bildgebung auf Fluorophore beschränkt ist, die genetisch versorgt werden müssen, was oft langwierige genetische Kreuzungsschemata erfordert. Im Gegensatz dazu erlaubt das vorliegende Protokoll die Anwendung von Flecken, Immunhistochemie und anderen Techniken, die eine Dissektion und Fixierung erfordern. Dies erhöht die Anzahl der im Gewebe untersuchten Signale dramatisch und verkürzt möglicherweise die Zeit bis zu den experimentellen Ergebnissen.

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
½” Scotch Permanent Double-Sided tape	Scotch 3M	665
0.1-10 µL uTIP pipette tip	Biotix	M-0011-9FC
22 x 22 mm No. 0 thickness coverslips	Thomas Scientific	1207Z28
24 x 60 mm coverslip	Corning	2980-246
3M VetBond	3M	1469SB	Called "adhesive glue" in protocol
Anti-FasIII primary Mouse IgG2a	Developmental Studies Hybridoma Bank	7G10
Calcium Chloride	Fisher Chemical	c79-500
Cy3-conjugated AffiniPure Goat Anti-Mouse IgG2a	Jackson ImmunoResearch	115-165-206
DAPI	Sigma Aldrich	D9542-1mg
Dumont #5 Fine Tip Forceps	Fine Science Tools	No. 11254-20
Dumont #5 Fine Tip Forceps: Blunt	Fine Science Tools	No. 11254-20	Heavily used and unsharpened forceps, or dulled with a whetstone
Fisherbrand Double frosted microscope slides	Fisher Scientific	22-034-486
Fluorescent Light Source	Lumencor	Celesta 90-10512
Fly Stock: EGFP-tagged Histone H2A	Bloomington Drosophila Stock Center	24163
Fly Vial Foam Plugs "Flugs"	Genesee Scientific	49-101
Humidified Chamber: Foil-wrapped small container lined with filter paper saturated with water	Cole-Parmer	759075D	A great humidified chamber can be made from the styrofoam box containing Cole-Parmer cuvettes, 759075D, filled with 50 ml water.
KimWipe	KimTech	34155	Called "Absorbent Tissue" in protocol
Nikon Ti2 Eclipse	Nikon	Eclipse Ti2-E
NIS Elements Software	Nikon	AR
Parafilm	Pechiney Plastic Packaging	PM-996
Paraformaldehyde (PFA) 16%	Ted Pella, Inc	18505
Plastic Vials	Genesee Scientific	32-114
Sodium Azide (NaN3)	Fisher Scientific	19038-1000
Stereo Microdissection Scope	Carl Zeiss	STEMI 2000
Vannas Spring Scissors	Fine Science Tools	15000-00	New or freshly sharpened scissors
Vecta Shield	Vector Laboratories	H-1000	Called " antifade mounting medium" in protocol
Vecta Shield with DAPI	Vector Laboratories	H-1200	Not ideal for pupal notum.
X-Light V2 Spinning Disc	Crest Optics	V2 L-FOV