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In diesem Artikel

  • Zusammenfassung
  • Zusammenfassung
  • Einleitung
  • Protokoll
  • Ergebnisse
  • Diskussion
  • Offenlegungen
  • Danksagungen
  • Materialien
  • Referenzen
  • Nachdrucke und Genehmigungen

Zusammenfassung

Wir stellen ein Protokoll zur Verfügung, das im Allgemeinen auf die Auswahl von Aptameren angewendet werden kann, die nur an infektiöse Viren binden und nicht an Viren, die durch eine Desinfektionsmethode nicht infektiös gemacht wurden, oder an andere ähnliche Viren. Dies eröffnet die Möglichkeit, den Infektiositätsstatus in tragbaren und Schnelltests zu bestimmen.

Zusammenfassung

Virusinfektionen haben große Auswirkungen auf die Gesellschaft; Die meisten Nachweismethoden haben Schwierigkeiten bei der Feststellung, ob ein nachgewiesenes Virus infektiös ist, was zu Verzögerungen bei der Behandlung und einer weiteren Ausbreitung des Virus führt. Die Entwicklung neuer Sensoren, die Aufschluss über die Infektierbarkeit von klinischen oder Umweltproben geben können, wird diese ungelöste Herausforderung meistern. Es gibt jedoch nur sehr wenige Methoden, die Sensormoleküle erhalten, die ein intaktes infektiöses Virus erkennen und es von demselben Virus unterscheiden können, das durch Desinfektionsmethoden nicht infektiös gemacht wurde. In dieser Arbeit beschreiben wir ein Protokoll zur Auswahl von Aptameren, das infektiöse Viren von nicht-infektiösen Viren unterscheiden kann, indem wir systematische Evolution von Liganden durch exponentielle Anreicherung (SELEX) verwenden. Wir machen uns zwei Funktionen von SELEX zunutze. Erstens kann SELEX maßgeschneidert werden, um konkurrierende Ziele, wie z. B. nicht-infektiöse Viren oder andere ähnliche Viren, durch Counter-Selektion zu entfernen. Darüber hinaus kann das gesamte Virus als Ziel für SELEX verwendet werden, anstatt beispielsweise ein virales Oberflächenprotein. SELEX ermöglicht die Auswahl von Aptameren, die spezifisch an den nativen Zustand des Virus binden, ohne dass das Virus gestört werden muss. Diese Methode ermöglicht es somit, Erkennungsmittel auf der Grundlage funktioneller Unterschiede in der Oberfläche von Krankheitserregern zu erhalten, die nicht im Voraus bekannt sein müssen.

Einleitung

Virusinfektionen haben weltweit enorme wirtschaftliche und gesellschaftliche Auswirkungen, wie die jüngste COVID-19-Pandemie immer deutlicher wurde. Eine rechtzeitige und genaue Diagnose ist von größter Bedeutung, um Virusinfektionen zu behandeln und gleichzeitig die Ausbreitung von Viren auf gesunde Menschen zu verhindern. Obwohl viele Virusnachweismethoden entwickelt wurden, wie z. B. PCR-Tests1,2 und Inmunoassays3, sind die meisten der derzeit verwendeten Methoden nicht in der Lage, festzustellen, ob das nachgewiesene Virus tatsächlich infektiös ist oder nicht. Dies liegt daran, dass das Vorhandensein von Bestandteilen des Virus allein, wie z. B. virale Nukleinsäure oder Proteine, nicht darauf hinweist, dass das intakte, infektiöse Virus vorhanden ist, und die Konzentrationen dieser Biomarker eine schlechte Korrelation mit der Infektiosität gezeigt haben 4,5,6. So weist beispielsweise die virale RNA, die üblicherweise für die aktuellen PCR-basierten COVID-19-Tests verwendet wird, in den frühen Stadien der Infektion sehr niedrige Werte auf, wenn der Patient ansteckend ist, während der RNA-Spiegel oft noch sehr hoch ist, wenn sich die Patienten von der Infektion erholt haben und nicht mehr ansteckend sind 7,8. Die viralen Protein- oder Antigen-Biomarker folgen einem ähnlichen Trend, treten aber in der Regel noch später als die virale RNA auf und sind daher noch weniger prädiktiv für die Infektiosität 6,9. Um dieser Einschränkung entgegenzuwirken, wurden einige Methoden entwickelt, die Aufschluss über den Infektiositätsstatus des Virus geben können, aber auf mikrobiologischen Techniken der Zellkultur basieren, die eine lange Zeit (Tage oder Wochen) benötigen, um Ergebnisse zu erhalten 4,10. So kann die Entwicklung neuer Sensoren, die Aufschluss über die Infektierbarkeit von klinischen oder Umweltproben geben können, Verzögerungen bei der Behandlung und eine weitere Ausbreitung des Virus vermeiden. Es gibt jedoch nur sehr wenige Methoden, die Sensormoleküle erhalten, die ein intaktes infektiöses Virion erkennen und es von demselben Virus unterscheiden können, das nicht infektiös geworden ist.

In diesem Zusammenhang eignen sich Aptamere besonders gut als einzigartiges biomolekulares Werkzeug 11,12,13,14. Aptamere sind kurze, einzelsträngige DNA- oder RNA-Moleküle mit einer spezifischen Nukleotidsequenz, die es ihnen ermöglicht, eine spezifische 3D-Konformation zu bilden, um ein Ziel mit hoher Affinität und Selektivität zu erkennen15,16. Sie werden durch einen kombinatorischen Selektionsprozess erhalten, der als systematische Evolution von Liganden durch exponentielle Anreicherung (SELEX) bezeichnet wird, auch bekannt als In-vitro-Selektion, der in Reagenzgläsern mit einer großen zufälligen DNA-Probenbibliothek von 10 14-10 15 Sequenzen durchgeführt wird17,18,19. In jeder Runde dieses iterativen Prozesses wird der DNA-Pool zunächst durch Inkubation mit dem Target unter den gewünschten Bedingungen einem Selektionsdruck ausgesetzt. Alle Sequenzen, die nicht an das Ziel gebunden sind, werden dann entfernt, so dass nur die wenigen Sequenzen übrig bleiben, die unter den gegebenen Bedingungen binden können. Schließlich werden die im vorherigen Schritt ausgewählten Sequenzen durch PCR amplifiziert, wodurch die Population des Pools mit den gewünschten funktionellen Sequenzen für die nächste Selektionsrunde angereichert wird, und der Vorgang wird wiederholt. Wenn die Aktivität des Selektionspools ein Plateau erreicht (in der Regel nach 8-15 Runden), wird die Bibliothek durch DNA-Sequenzierung analysiert, um die Gewinnsequenzen mit der höchsten Affinität zu identifizieren.

SELEX hat einzigartige Vorteile, die genutzt werden können, um eine erhöhte Selektivität gegen andere ähnliche Zielmoleküle 20,21 zu erreichen, z. B. für den Infektiositätsstatus des Virus22. Erstens kann eine Vielzahl unterschiedlicher Arten von Targets für die Selektion verwendet werden, von kleinen Molekülen und Proteinen bis hin zu ganzen Krankheitserregern und Zellen16. Um ein Aptamer zu erhalten, das an ein infektiöses Virus bindet, kann daher ein intaktes Virus anstelle eines viralen Oberflächenproteins als Ziel verwendet werden19. SELEX ermöglicht die Auswahl von Aptameren, die spezifisch an den nativen Zustand des Virus binden, ohne dass das Virus gestört werden muss. Zweitens kann SELEX so maßgeschneidert werden, dass konkurrierende Zielmoleküle 21,23, wie z. B. andere ähnliche Viren oder nicht-infektiöse inaktivierte Viren, unter Verwendung von Gegenauswahlschritten in jeder Auswahlrunde22 entfernt werden. Während der Zählerauswahlschritte wird der DNA-Pool Zielen ausgesetzt, für die eine Bindung nicht erwünscht ist, und alle Sequenzen, die binden, werden verworfen.

In dieser Arbeit stellen wir ein Protokoll zur Verfügung, das allgemein für die Auswahl von Aptameren verwendet werden kann, die an ein infektiöses Virus binden, aber nicht an dasselbe Virus, das durch eine bestimmte Desinfektionsmethode nicht infektiös gemacht wurde, oder an andere verwandte Viren. Diese Methode ermöglicht es, Erkennungsmittel auf der Grundlage funktioneller Unterschiede der Virusoberfläche zu erhalten, die nicht im Voraus bekannt sein müssen, und bietet so einen zusätzlichen Vorteil für den Nachweis neu aufgetretener Erreger oder für wenig erforschte Krankheiten.

Protokoll

1. Herstellung von Reagenzien und Puffern

  1. Bereiten Sie 10x Trisborat-EDTA (10x TBE) zu, indem Sie 0,9 M Tris-Base, 0,9 M Borsäure, 20 mM EDTA (Dinatriumsalz) und deionisiertes Wasser zu einem Endvolumen von 1 l hinzufügen. Mischen, bis sich alle Komponenten aufgelöst haben.
  2. Bereiten Sie eine 10%ige denaturierende Polyacrylamid-Stammlösung wie folgt vor. In eine 250-ml-Glasflasche werden 120 g Harnstoff (8 m), 25 ml 10-facher FSME, 62,5 ml 40%ige Acrylamid/Bisacrylamid-Lösung (29:1) und genügend destilliertes Wasser gegeben, um das Endvolumen von 250 ml zu erreichen. Mischen, bis sich alle Komponenten aufgelöst haben.
  3. Bereiten Sie 2x Ladepuffer wie folgt vor. In ein 50-ml-Röhrchen werden 21,636 g Harnstoff (8 m), 1,675 g EDTA (1 m) und 4,5 ml 10-fache FSME gegeben. Auf 45 ml mit destilliertem Wasser auffüllen und mischen, bis sich alle Bestandteile aufgelöst haben.
  4. Bereiten Sie den Extraktionspuffer durch Zugabe von 100 mM Natriumacetat und 1 mM EDTA (Dinatriumsalz) vor. Stellen Sie den endgültigen pH-Wert auf 5 ein.
  5. Bereiten Sie Ethanol-Fällungslösungen wie folgt vor. 3 M Natriumacetat vorbereiten, auf pH 5,2 einstellen und bei 4 °C lagern. 70% Ethanol v/v zubereiten und bei -20 °C lagern. 100% Ethanol zubereiten und bei -20 °C lagern.
  6. Bereiten Sie 500 ml SELEX-Puffer vor, der 1x PBS, 2,5 mM MgCl 2 und 0,5 mM CaCl2 enthält. Auf pH 7,4 einstellen. 100 ml SELEX-Puffer mit 8 M Harnstoff werden durch Zugabe von 1x PBS, 2,5 mM MgCl 2, 0,5 mM CaCl2 und 8 M Harnstoff hergestellt. Auf pH 7,4 einstellen.
    HINWEIS: Die Wahl des SELEX-Puffers ist entscheidend, um sicherzustellen, dass das ausgewählte Aptamer in der endgültigen Probe, in der das Aptamer aufgetragen wird, funktioniert. So werden beispielsweise SARS-CoV-2-spezifische Aptamere in biologischen Proben (z. B. Speichel- oder Nasopharynge-Abstrichen) verwendet. Daher ist es wichtig, Ionenkonzentrationen, pH-Wert und Puffer zu wählen, die diese Bedingungen in den vorgesehenen biologischen Proben genau nachahmen.
  7. Bereiten Sie den Binde- und Waschpuffer wie folgt vor. In einem 50-ml-Röhrchen werden 5 mM Tris, 0,5 mM EDTA (Dinatriumsalz) und 2 M NaCl hergestellt. Auf pH 7,5 einstellen.

2. Design und Synthese von DNA-Bibliotheken und Primern

  1. Entwerfen Sie die anfängliche ssDNA-Bibliothek und die Primer mit den folgenden Kriterien (siehe Tabelle 1 für ein Beispiel für eine ssDNA-Bibliothek und einen Satz von Primern, wobei N eine zufällige Nukleotidposition angibt).
    1. Stellen Sie sicher, dass die Bibliothek eine zentrale zufällige Region von 35 bis 60 Nukleotiden enthält, die von zwei konstanten Sequenzen an den 3'- und 5'-Enden flankiert werden, die als Primerregionen für die Amplifikation dienen. Eine typische Bibliothekslänge beträgt 45 zufällige Nukleotide.
    2. Stellen Sie sicher, dass der Reverse-Primer eine Biotin-Modifikation enthält, um ssDNA aus amplifizierten doppelsträngigen PCR-Produkten unter Verwendung von Streptavidin-beschichteten Beads während des In-vitro-Auswahlprozesses zu trennen.
  2. Kaufen Sie die DNA-Oligos aus kommerziellen Quellen mit Standard-Entsalzungsreinigung. Reinigen Sie die ssDNA-Bibliothek und die Primer durch 10%ige denaturierende Polyacrylamid-Gelelektrophorese (dPAGE), gefolgt von Ethanolfällung gemäß den Standardverfahren24.
    VORSICHT: Acrylamidmonomer und Ethidiumbromid sind gefährliche Chemikalien (Karzinogene für den Menschen), daher verwenden Sie während der Durchführung von PAGE geeignete persönliche Schutzausrüstung (Laborkittel, Handschuhe und Augenschutz). Vermeiden Sie nach Möglichkeit die Verwendung von Ethidiumbromid und ersetzen Sie es durch einen sichereren Farbstoff.
    HINWEIS: Es ist möglich, die Oligos mit HPLC-Aufreinigung zu bestellen, um die Durchführung dieses Aufreinigungsschritts zu vermeiden, obwohl dadurch kurze Oligonukleotide nicht so effektiv entfernt werden.
  3. Fügen Sie nukleasefreies Wasser hinzu, um die ssDNA nach der Ethanolfällung bis zur gewünschten Konzentration (100 μM) zu resuspendieren. Bestimmung der Konzentration der ssDNA-Bibliothek und der Primer durch UV-Absorption bei λ = 260 nm. Bei -20 °C lagern.
  4. Kaufen Sie einen unmodifizierten Reverse-Primer für die Hochdurchsatz-Sequenzierung, die Bibliotheksvorbereitung und die qPCR-Quantifizierung.

3. Infektiöse und nicht-infektiöse Virusproben

VORSICHT: Bei den infektiösen und nicht-infektiösen Virusproben handelt es sich um Proben der Biosicherheitsstufe 2 (BSL2), die besondere Sorgfalt erfordern, um sie sicher und angemessen zu handhaben. Alle Verfahrensschritte, die diese Proben umfassen, müssen in einer Biosicherheitswerkbank durchgeführt werden, oder die Viruslösung muss sich in einem versiegelten Behälter (z. B. verschlossene Kunststoffröhrchen) befinden.

  1. Besorgen Sie sich eine Stammlösung infektiöser Viren oder bereiten Sie sie zu, indem Sie das entsprechende Protokoll für jedes Virus befolgen. Die hier verwendeten SARS-CoV-2-, SARS-CoV-1- und H5N1-Pseudoviren wurden vom Labor von Prof. Lijun Rong (UIC) in PBS-Puffer bereitgestellt und nach den berichteten Protokollen22,25,26 hergestellt.
    HINWEIS: Bei Viren, die Einrichtungen der Biosicherheitsstufe 3 benötigen, um mit dem intakten infektiösen Virus umgehen zu können, ist es möglich, mit Pseudoviren zu arbeiten. Ein pseudotypisiertes Virus wird aus einem Lentivirus (HIV) erzeugt, das die Oberflächenproteine des Virus innerhalb der Virushülle aufweist und somit die Oberfläche und den Eintrittsmechanismus des Virus genau nachahmt, aber bei der kontinuierlichen Virusreplikation defekt ist.
  2. Besorgen Sie sich eine nicht-infektiöse Virusstammlösung oder bereiten Sie sie zu, indem Sie das Desinfektionsverfahren befolgen. Der hier verwendete UV-inaktivierte SARS-CoV-2-Pseudovirus-Bestand (p-SARS-CoV-2) wurde vom Labor Prof. Rong (UIC) in PBS-Puffer bereitgestellt, und das zuvor beschriebene Protokoll wurde für die UV-Inaktivierungverwendet 22.
    Anmerkungen: Führen Sie nach Möglichkeit einen Test durch, um die Infektiosität des Virus zu testen, um sicherzustellen, dass das Virus vollständig inaktiviert wurde.
  3. Quantifizieren Sie die Virusbestände
    1. Quantifizieren Sie das Virus mit einem Plaque-Assay gemäß den Standardverfahren27,28,29. Dieser Assay ermöglicht nicht nur die Quantifizierung des Virus, sondern zeigt auch den Infektiositätsstatus des Virus an und bestätigt die Konzentration des infektiösen Virus.
    2. Bei Pseudoviren oder Viren, für die kein Plaque-Assay verfügbar ist, quantifizieren Sie das Virus mit einem kommerziell erhältlichen quantitativen Lentivirus-ELISA-Kit.
    3. Bereiten Sie 1 x 108 Kopien /ml Stammlösung für p-SARS-CoV-2, p-SARS-CoV-1 und p-H5N1 vor. Jede Stammlösung in Aliquoten mit je 50 μl trennen und bei -80 °C aufbewahren. Tauen Sie vor jedem Experiment ein neues Aliquot auf.

4. In-vitro-Selektion oder SELEX-Verfahren: erste Runde

Anmerkungen: Arbeiten Sie für alle Schritte mit dem infektiösen Virus in einem BSL2-Schrank.

  1. Denaturieren Sie die ssDNA-Bibliothek. Man nehme 10 μl von 100 μM der ssDNA-Bibliothek (1 nmol) und mische sie mit 240 μl SELEX-Puffer. 15 Minuten im Trockenbad bei 95 °C erhitzen und dann 15 Minuten auf Eis legen.
  2. Inkubieren Sie die ssDNA-Bibliothek mit dem infektiösen Virus (positiver Selektionsschritt) wie folgt. Mischen Sie 250 μl ssDNA-Bibliothek in SELEX-Puffer aus Schritt 4.1 mit 50 μl infektiösem Virus (1 x 108 Kopien/ml). 2 h bei Raumtemperatur inkubieren.
  3. Blockieren Sie die unspezifischen Stellen in Zentrifugenfiltern wie folgt. Während Sie auf Schritt 4.2 warten, bereiten Sie die Zentrifugenfilter für die nächsten Schritte vor.
    1. Fügen Sie 400 μl der T20-Sequenz von 1 mM (Tabelle 1) zu jedem zu verwendenden 0,5-ml-Zentrifugenfilter hinzu - einen Zentrifugenfilter mit einem Cut-off von 100 kDa und einen mit einem Cut-off von 10 kDa.
    2. 30 min bei Raumtemperatur inkubieren und 10 min bei 14.000 x g zentrifugieren, um die T20-Lösung aus dem Filter zu entfernen. 3x mit SELEX-Puffer waschen, um überschüssige T20-Sequenzen zu entfernen.
  4. Waschen Sie ungebundene Sequenzen wie folgt. Das in Schritt 4.2 inkubierte Gemisch in den verstopften 100 kDa Zentrifugenfilter geben und bei 14.000 x g 10 min zentrifugieren. 3x waschen, 400 μl SELEX-Puffer zugeben und 10 min bei 14.000 x g zentrifugieren. Lassen Sie die Fraktion im Filter und verwerfen Sie den Durchfluss.
  5. Elute gebundene Sequenzen wie unten beschrieben.
    1. Wechseln Sie das Auffangröhrchen des Zentrifugenfilters und geben Sie in Schritt 4.4 300 μl SELEX-Puffer mit 8 M Harnstoff in den Zentrifugenfilter. Erhitzen Sie den Zentrifugenfilter bei 95 °C für 15 min in einem Trockenbad und zentrifugieren Sie dann bei 14.000 x g für 10 min.
    2. Sammeln Sie die Fraktion, die durch den Filter mit den eluierten Sequenzen geflossen ist. Wiederholen Sie den Vorgang noch dreimal. Arbeiten Sie in einem BSL2-Schrank und waschen Sie alle Materialien mit 10% Bleichmittel, um das Virus zu inaktivieren, bevor Sie die Materialien entsorgen.
  6. Konzentrieren und entsalzen Sie wie folgt. Geben Sie die in 4,5 aufgefangene Lösung in einen verstopften 10 kDa Zentrifugenfilter. Zentrifugieren bei 14.000 x g für 15 min. Verwerfen Sie die Fraktion, die durch den Filter geflossen ist.
    HINWEIS: Da die Viren im vorherigen Schritt mit 8 M Harnstoff im Filter zurückgehalten und inaktiviert werden, müssen diese und die folgenden Schritte nicht in der Biosicherheitswerkbank durchgeführt werden. Dieser Vorgang muss wiederholt werden, wenn ein 0,5-ml-Zentrifugenröhrchen verwendet wird, bis die gesamte Lösung aufgefangen ist, wie in Schritt 4.5, 1,2 ml durch den Filter fließen.
  7. Waschen Sie 3x mit 300 μl SELEX-Puffer, um den Harnstoff zu entfernen, indem Sie ihn 15 Minuten lang bei 14.000 x g zentrifugieren. Verwerfen Sie die Fraktion, die durch den Filter geflossen ist. Gewinnen Sie die Lösung im Filter zurück, indem Sie sie in einem sauberen Auffangröhrchen auf den Kopf stellen und 5 Minuten lang zentrifugieren.
  8. Messen Sie das Endvolumen der gewonnenen Lösung aus 4.7 mit einer Pipette in einem Kunststoffröhrchen. Diese Lösung heißt R ia, wobei i der runden Zahl entspricht. Typischerweise werden Volumina zwischen 30 μl und 50 μl erhalten. Nehmen Sie 1 μl der eluierten ssDNA, um die DNA-Menge mittels qPCR zu quantifizieren.
    HINWEIS: Dies ist ein möglicher Pausenpunkt, an dem die R1a-Probe bei −20 °C gehalten werden kann, um zu einem anderen Zeitpunkt fortzufahren.
  9. Führen Sie die PCR-Amplifikation wie unten beschrieben durch.
    1. Entnehmen Sie in der ersten Runde 90 % der R1a-Probe als PCR-Template. In den folgenden Runden werden 60 % des Gesamtvolumens in Schritt 4.8 zur Durchführung der PCR entnommen und die andere Fraktion bei -20 °C gelagert.
    2. Richten Sie eine 50-μl-PCR-Reaktion mit den folgenden Elementen mit der angegebenen Endkonzentration ein: 1x PCR-Reaktionspuffer, 200 μM dNTPs, 10 μl DNA-Template (R1a-Probe), 200 nM pro Primer und 1,25 U-Polymerase (2,5 U/μl Material).
    3. Optimieren Sie die PCR-Bedingungen, einschließlich der Anzahl der Zyklen und der Annealing-Temperatur für jeden Satz von Primern und ssDNA-Bibliotheken. Vermeiden Sie es, zu viele Zyklen zu verwenden, da dadurch unerwünschte PCR-Unterprodukte wie Primer-Dimere entstehen. Testen Sie verschiedene Glühtemperaturen basierend auf der Schmelztemperatur der Primer.
    4. Führen Sie die PCR unter optimierten Bedingungen bei 95 °C für 5 min durch, gefolgt von 18 Zyklen von 1 min bei 95 °C, 30 s bei 52 °C und 1 min bei 72 °C, mit einem letzten Erweiterungsschritt bei 72 °C für 10 min, um den dsDNA-Pool zu erhalten.
      HINWEIS: Dies ist ein weiterer möglicher Pausenpunkt, an dem das PCR-Produkt bei −20 °C aufbewahrt werden kann, um zu einem anderen Zeitpunkt fortzufahren.
  10. Gewinnung von ssDNA mit Hilfe von Streptavidin-modifizierten magnetischen Beads.
    1. Nehmen Sie 80% des PCR-Produkts. Die restliche Fraktion bei -20 °C lagern.
    2. Das PCR-Produkt wird in Aliquoten von 50 μl aufgeteilt und in Mikrofugenröhrchen gegeben, die 50 μl Streptavidin-modifizierte magnetische Beads (MB) enthalten. 30 Minuten bei leichtem Rühren (z. B. rotierendes Schüttelgerät) bei Raumtemperatur inkubieren. Legen Sie dann das Mikrofugenröhrchen auf das magnetische Gestell, um das MB zu isolieren, und entfernen Sie den Überstand durch Pipettieren (es muss eine klare Lösung sein).
    3. Waschen Sie, indem Sie 200 μl Binde- und Waschpuffer in die Tube geben. Nehmen Sie das Röhrchen aus dem Magnetgestell, klopfen Sie auf das Röhrchen und resuspendieren Sie das MB durch Pipettieren zu einer homogenen Lösung. Setzen Sie das Mikrofugenröhrchen wieder auf das magnetische Gestell, um das MB zu isolieren und den Überstand durch Pipettieren zu entfernen. Wiederholen Sie diesen Waschschritt zweimal.
    4. Nach dem Waschen resuspendieren Sie den MB in insgesamt 100 μl SELEX-Puffer und erhitzen Sie die Lösung 10 Minuten lang auf 95 °C. Legen Sie das Röhrchen sofort in das Magnetgestell, bevor das Röhrchen abkühlt, und nehmen Sie den Überstand mit dem ssDNA-Pool. Wiederholen Sie diesen Wiederherstellungsschritt und fügen Sie 50 μl SELEX-Puffer hinzu.
  11. Messen Sie das Endvolumen der zurückgewonnenen Fraktion ab 4.10 mit einer Pipette. Dieser Bruch wird R i xgenannt, wobei i der runden Zahl entspricht. In der Regel werden Volumina zwischen 140 und 150 μL erhalten. Nehmen Sie 1 μl R1x ein, um die DNA-Menge durch qPCR zu quantifizieren.

5. Nachfolgende Auswahlrunden

  1. Denaturieren Sie den ssDNA-Pool. 60 % der Probe R1x entnehmen und mit 50 μl SELEX-Puffer mischen. Bei 95 °C 15 min im Trockenbad erhitzen. Legen Sie das Röhrchen für 15 Minuten auf Eis.
  2. Inkubation des ssDNA-Pools mit dem nicht-infektiösen Virus und anderen potentiell störenden Viren (Schritt der Gegenauswahl). Mischen Sie den denaturierten ssDNA-Pool in SELEX-Puffer ab 5.1 mit 50 μL jedes Virus (5 x 109 Kopien/ml; z. B. nicht-infektiöses p-SARS-CoV-2, p-SARS-CoV-1 und p-H5N1). 1 h bei Raumtemperatur inkubieren.
  3. Blockieren Sie unspezifische Stellen in Zentrifugenfiltern. Während Sie auf Schritt 5.2 warten, bereiten Sie die Zentrifugenfilter für die nächsten Schritte vor. Verwenden Sie in der Regel zwei Zentrifugenfilter, einen mit einer Abschaltung von 100 kDa und einen mit einer Abschaltung von 10 kDa. Gehen Sie wie in 4.3 vor.
  4. Waschen Sie die Sequenzen ab, die an Nicht-Zielviren gebunden sind. Das in Schritt 5.2 inkubierte Gemisch in einen verstopften 100 kDa Zentrifugenfilter geben. Zentrifugieren Sie 10 Minuten lang bei 14.000 x g und gewinnen Sie die Fraktion zurück, die durch den Zentrifugenfilter fließt. 2x waschen, 100 μl SELEX-Puffer zugeben und bei 14.000 x g 10 min zentrifugieren. Bewahren Sie die Fraktion auf, die durch den Filter geflossen ist.
  5. Inkubation des ssDNA-Pools mit dem infektiösen Virus (positiver Selektionsschritt). Nehmen Sie die 300 μl der Fraktion aus Schritt 5.4 und mischen Sie sie mit 50 μl des infektiösen Virus (1 x 10,8 Kopien/ml). 2 h bei Raumtemperatur inkubieren. Führen Sie die Schritte 4.4 bis 4.11 aus.

6. Überwachung des SELEX-Prozesses

HINWEIS: Um die Anreicherung des Pools zu überwachen, wird die qPCR auf zwei Arten verwendet. Zunächst ist es durch absolute Quantifizierung möglich, die Anreicherung der Pools (Elutionsausbeute) zu testen. Zweitens kann durch die Beobachtung der Schmelzkurve die Diversität der Pools (Konvergenz der Aptamer-Spezies) bewertet werden30.

  1. Führen Sie alle qPCR-Assays mit einem Reaktionsvolumen von 10 μl in 96-Well-Platten durch, die für die qPCR entwickelt wurden.
  2. Bereiten Sie eine Standard-qPCR-Mischung vor, die 5 μl Mastermix, 0,3 μl 500 nM jedes unmarkierten Primers, 3,4 μlH2O und 1 μl DNA-Template enthält.
    1. Bereiten Sie Verdünnungen der gereinigten ssDNA-Bibliothek vor (Schritt 2.3), um die Standardkurve zu durchlaufen.
    2. Verdünnen Sie die DNA-Proben, damit ihre Konzentration in die Standardkurve passt. Bei Ria-Proben wird 1 μl der Probe ohne Verdünnung und 1 μl 1:10 Verdünnung in die qPCR-Mischung gegeben. Bei Rix-Proben sind Verdünnungen von 1:10 oder 1:100 einzuschließen.
  3. Führen Sie qPCR aus, indem Sie das folgende Protokoll festlegen. Stellen Sie zunächst einen ersten Denaturierungsschritt auf 98 °C für 2 min ein. Stellen Sie dann 40 Zyklen der Denaturierung bei 98 °C für 5 s und des Glühens und Dehnens bei 52 °C für 10 s ein. Stellen Sie abschließend eine Schmelzkurvenanalyse von 65 bis 95 °C ein. Bestimmen Sie Schwellenzykluswerte (Ct) durch automatisierte Schwellenwertanalyse.
  4. Quantifizieren Sie anhand der Standardkurve die Menge an ssDNA in R ia- und Rix-Proben.
  5. Berechnen Sie die Elutionsausbeute als die Menge der gebundenen DNA (Anzahl der Mole in R i a) geteilt durch die Menge der ursprünglichen DNA (Anzahl der Mole in Ri 1x). Tragen Sie die Elutionsausbeute im Vergleich zur runden Zahl auf, um zu sehen, ob eine Anreicherung über die Runden beobachtet wird.
  6. Zeichnen Sie die Schmelzkurven für verschiedene Runden. Mit zunehmender Anzahl der Runden wird eine Verschiebung zu höheren Schmelztemperaturen in der Spitze bei 75/85 °C erwartet. Das bedeutet, dass die Vielfalt des Pools abnimmt.

7. Hochdurchsatz-Sequenzierung

  1. Wenden Sie sich an die Hochdurchsatz-Sequenzierungseinrichtung, um zu erfahren, welche Sequenzierungstypen und -skalen verfügbar sind, die die Vorbereitungsmethode der Bibliothek bestimmen.
    HINWEIS: Bei dieser Entscheidung werden sowohl die Länge der zu sequenzierenden Pools (einschließlich der Primer) als auch die Anzahl der einzureichenden Pools berücksichtigt (im Allgemeinen sollten mindestens 1 x 105-10 6 Sequenzen pro Pool angestrebt werden). Wenn eine bestimmte Sequenzierungsskala nicht die gesamte Länge des Pools lesen kann, kann die Paarendsequenz verwendet werden, um von beiden Enden der Sequenz zu lesen, im Gegensatz zu einer Single-End-Sequenz, die nur von einem Ende liest.
  2. Wählen Sie in Absprache mit der Sequenziereinrichtung ein geeignetes, kommerziell erhältliches Kit basierend auf der Art der Sequenzierung aus. Bereiten Sie mehrere Pools von Auswahlrunden vor, die eine hohe, mittlere und niedrige Anreicherung darstellen, sowie den endgültigen Pool, indem Sie für jeden Pool ein anderes Indexpaar in den Adaptern verwenden, das die Stichprobenanalyse aller Runden mit einer Lane ermöglicht.
    HINWEIS: Die PCR-Amplifikation kann auch verwendet werden, um die für die Hochdurchsatzsequenzierung erforderlichen Adapter und Indizes einzubinden, aber dies kostet in der Regel ähnlich wie die kommerziellen Kits und ist nicht besser.
    1. Führen Sie die Bibliotheksvorbereitung durch, indem Sie die folgenden Schritte ausführen: Endreparatur der fragmentierten DNA, Adaptorligatur und PCR-Amplifikation, um die endgültigen Bibliotheken herzustellen.
    2. Reinigen Sie das PCR-Produkt gemäß den Anweisungen des Herstellers mit magnetischen DNA-Reinigungskügelchen.
    3. Quantifizieren Sie die DNA mit einem fluoreszenzbasierten Quantifizierungskit. Vermeiden Sie die Verwendung weniger genauer Methoden, wie z. B. UV-Messungen in kleinen Mengen.
    4. Mischen Sie ungefähr gleiche Mengen (nach DNA-Menge, nicht nach Volumen) jeder Poolbibliothek, die bestimmte Indizes enthält.
    5. Überprüfen Sie die Qualität der endgültigen Bibliothek mit qPCR-Quantifizierung und einem DNA-Fragmentanalysator. Dieser Schritt wird häufig von der Sequenziereinrichtung durchgeführt.
      HINWEIS: Das Personal der Sequenzierungseinrichtung kann nützliche Informationen darüber geben, wie die Bibliothek vorzubereiten ist und welche Qualitätskontrollen vorgeschlagen werden. Vor der Vorbereitung der Bibliotheken ist eine Diskussion mit ihnen erforderlich.
  3. Senden Sie die vorbereitete endgültige Bibliothek entsprechend den Anforderungen an die Sequenzierungseinrichtung.

8. Sequenzierungsanalyse

  1. Die meiste Software, die für die Sequenzanalyse verfügbar ist, ist für die Ausführung über die Befehlszeile unter einem Linux-Betriebssystem konzipiert. Richten Sie bei kleinen Datensätzen das gewünschte Linux-Betriebssystem ein und installieren Sie die erforderlichen Programme auf einem PC. Bei größeren Datensätzen wird die HTS-Analyse auf High-Performance-Computing-Ressourcen oder Supercomputern (empfohlen) ausgeführt.
    HINWEIS: Für die Nutzung von High-Performance-Computing-Ressourcen sind Zugriff und Schulung erforderlich, was einige Zeit dauern kann. Darüber hinaus sind Grundkenntnisse in der Verwendung der UNIX-Befehlszeile erforderlich. Viele kostenlose Ressourcen zur grundlegenden Verwendung der Befehlszeile sind online verfügbar, und die Computerressourcen werden wahrscheinlich zusätzliche Informationen für die Verwendung ihrer Systeme bereitstellen.
  2. Greifen Sie auf die Sequenzierungsdateien zu, in der Regel in einem komprimierten FastQ-Dateiformat, indem Sie die von der Sequenzierungseinrichtung bereitgestellten Informationen verwenden.
    1. Verwenden Sie einen FTP-Client, um die Dateien auf Ihren eigenen Computer und/oder die High-Performance-Computing-Ressource zu übertragen. Viele Sequenzanalyseprogramme können komprimierte Dateien direkt verwenden, halten Sie die Dateien also nach Möglichkeit komprimiert, um ihre Dateigröße zu begrenzen (große Sequenzlesevorgänge von 50 M+ Sequenzen können 100 Gb+ Speicherplatz beanspruchen, wenn sie unkomprimiert sind).
    2. Wenn Sequenzdateien dekomprimiert werden müssen, verwenden Sie die gzip-Funktion, die bei den meisten Linux-Installationen Standard ist. Zusätzliche Informationen über gzip und seine Optionen erhalten Sie aus dem installierten Handbuch, indem Sie "man gzip" in die Befehlszeile eingeben.
  3. Bereinigen Sie die Sequenzen vor der Analyse durch Demultiplexing, Entfernen der Sequenzierungsadapter, Entfernen von Lesevorgängen mit geringer Qualität und Einschließen von Lesevorgängen in Vorwärts- und Rückwärtsrichtung.
    1. Verwenden Sie das FastQC-Programm31 nach jedem der folgenden Schritte, um grundlegende Informationen zur Qualitätskontrolle über die Sequenzen zu erhalten, um die Wirksamkeit der einzelnen Bereinigungsschritte zu bewerten.
    2. Demultiplexen Sie die Sequenzen, um alle Sequenzen aus einer einzelnen Lesedatei in die verschiedenen Pools zu trennen, basierend auf den Indizes, die in den Sequenzierungsadaptern enthalten sind. Dieser Schritt wird häufig von der Sequenziereinrichtung durchgeführt, die konsultiert werden sollte, da das genaue Verfahren von der verwendeten Sequenziermaschine abhängt.
    3. Entfernen Sie die Sequenzierungsadapter mit dem Befehlszeilenprogramm Cutadapt32. Verwenden Sie die Auswahlprimer (anstelle von Sequenzierungsadaptern) als Eingabe im Modus "Verknüpfter Adapter". Verwenden Sie die Option --discard-untrimmed, um alle Sequenzen zu verwerfen, die die Auswahlprimer nicht enthalten.
    4. Legen Sie Optionen für die maximale Fehlerrate fest, die den Adaptern entspricht, sowie für die minimale und maximale Länge der zu akzeptierenden Sequenzen. Wenn Sie gekoppelte Endlesevorgänge verwenden, geben Sie bestimmte verfügbare Parameter ein und geben Sie sowohl die Sequenzdateien Read 1 als auch Read 2 an. Stellen Sie bei Bedarf zusätzliche Parameter ein, indem Sie sich auf das Cutadapt-Handbuch32 beziehen.
      HINWEIS: Die Ligatur von Sequenzierungsadaptern an Pools ist richtungsunabhängig und umfasst etwa 50 % der Sequenzen in Vorwärtsrichtung und 50 % in Rückwärtsrichtung. Um zu vermeiden, dass die 50 % der Sequenzen in umgekehrter Richtung verloren gehen, kann Cutadapt ein zweites Mal ausgeführt werden, wobei das umgekehrte Komplement der Auswahlprimer als Eingaben verwendet wird.
    5. (Optional) Wenn Paired-End-Sequenzierung verwendet wird, führen Sie die Dateien Read 1 und Read 2 mit dem Programm PEAR33 zusammen.
    6. Verwenden Sie das FASTX-Toolkit-Programm34 , um Sequenzen von geringer Qualität zu entfernen, die bei jedem Nukleotid eine Qualität unterhalb eines bestimmten Schwellenwerts aufweisen. Ein Qualitäts-Cut-off-Score von 30 ist ein guter Ausgangspunkt. Wenn die Gesamtqualität im Allgemeinen gut ist, kann dieser Schritt übersprungen werden.
    7. Um die Sequenzdateien in umgekehrter Richtung mit denen in Vorwärtsrichtung zusammenzuführen, verwenden Sie das FASTX-Toolkit fastx_reverse_complement Funktion für die Dateien in umgekehrter Richtung. Verwenden Sie dann das eingebaute cat-Programm (Standard bei den meisten Linux-Installationen), um die Vorwärts- und Rückwärtskomplement-Rückwärtsdateien in einer einzigen Datei zusammenzuführen.
  4. Um die Anreicherung von Sequenzen über verschiedene Selektionspools hinweg zu analysieren, verwenden Sie das Analyse-Toolkit FASTAptamer35.
    1. Verwenden Sie FASTAptamer-Count, um zu zählen, wie oft jede Sequenz angezeigt wird. Ordnen und sortieren Sie dann die Sequenzen nach Häufigkeit. Die count-Ausgabedatei wird als Eingabe für alle anderen FASTAptamer-Programme benötigt.
    2. Verwenden Sie FASTAptamer-Clust, um alle Sequenzen in einer Datei in Clustern eng verwandter Sequenzen zu gruppieren. Verwenden Sie den Parameter "distance", um die Anzahl der Einzelnukleotidmutationen oder Indels zu definieren, die sich zu einem Cluster gruppieren dürfen.
      HINWEIS: Das FASTAptamer-Clust-Programm kann sehr rechenintensiv sein, wenn eine große Anzahl eindeutiger Sequenzen vorhanden ist (insbesondere für frühe Runden), was Tage oder sogar Wochen dauern kann, bis es vollständig abgeschlossen ist. Der Parameter Cut-Off-Filter kann verwendet werden, um Sequenzen mit geringer Häufigkeit von der Clusterbildung auszuschließen. Im Allgemeinen ist es gut, mit einem höheren Grenzwert zu beginnen, z. B. 10 oder 5 Lesevorgänge pro Million (RPM), und ihn zu verringern, wenn das Programm schnell beendet wird. Wenn die Pools sehr heterogen sind, ist es möglicherweise nicht möglich, die Sequenzen in einem angemessenen Zeitrahmen zu clustern.
    3. Verwenden Sie FASTAptamer-Enrich, um die Anreicherung jeder Sequenz zu berechnen, die in mehr als einer Runde der Auswahl vorhanden ist. Vergleichen Sie die Drehzahl der Sequenz aus einer Grundgesamtheit mit der Drehzahl in einer anderen. Verwenden Sie das Programm "Anreichern" entweder für die Count- oder die Cluster-Datei. Die Ausgabe ist eine tabulatorgetrennte Datei (.tsv), die zur weiteren Analyse und einfachen Sortierung in jeder Tabellenkalkulationssoftware geöffnet werden kann.
      HINWEIS: Das Programm FASTAptamer-Enrich kann auch sehr rechenintensiv sein, wenn eine große Anzahl eindeutiger Sequenzen vorhanden ist. Der Parameter Cut-Off-Filter kann verwendet werden, um Sequenzen mit geringer Häufigkeit von der Ausgabe auszuschließen, um Dateien zu vermeiden, die zu groß sind, um sie in einer Tabellenkalkulationssoftware zu öffnen.
    4. (Optional) Wenn viele Pools zu heterogen sind (viele eindeutige Sequenzen und wenige doppelte Sequenzen), ist es möglicherweise nicht möglich, die Programme Clust oder Enrich zu verwenden. Führen Sie in diesem Fall eine manuelle Anreicherungsprüfung mit der Count-Ausgabedatei durch, die Sequenzen nach Häufigkeit sortiert (am häufigsten oben genannt) und den Sequenzbezeichner umbenennt, um wichtige Informationen wie RPM einzuschließen.
      1. Verwenden Sie das Standard-Linux-Programm "head" für die Count-Dateien, um eine Liste der am häufigsten vorkommenden Sequenzen zu erhalten. Verwenden Sie dann das Standard-Linux-Programm "grep", um jede der am häufigsten vorkommenden Sequenzen in den Count-Dateien aller anderen relevanten Pools zu durchsuchen. Wenn Übereinstimmungen vorhanden sind, verwenden Sie den geänderten Sequenzbezeichner, um die RPM in diesem Pool zu bestimmen und die Anreicherungsinformationen manuell zu erstellen.
        HINWEIS: Skripte für alle Schritte der Sequenzierungsanalyse finden Sie in den ergänzenden Kodierungsdateien 1-11.

9. Validierung der Aptamer-Bindung und Assays

  1. Identifizieren Sie anhand der durch die Sequenzanalyse erhaltenen Anreicherungsinformationen Aptamer-Kandidatensequenzen auf der Grundlage von Sequenzen, die in den nachfolgenden Auswahlrunden die größte Anreicherung und/oder die am häufigsten vorkommenden Sequenzen in der letzten Auswahlrunde aufweisen. Wählen Sie mehrere verschiedene Kandidatensequenzen (mindestens 10-20) für weitere Tests aus, da die am stärksten angereicherten Aptamere nicht unbedingt die leistungsstärksten Aptamere sind.
  2. Führen Sie ein erstes Screening von Aptamerkandidaten mit einem Bindungsassay durch, der schnell für mehrere Proben durchgeführt werden kann. Ein säulenbasierter Ultrafiltrations-Bindungsassay36 oder ein Enzyme-linked Oligonukleotid-Assay (ELONA) sind gute Methoden für dieses erste Screening.
  3. Analysieren Sie die Spezifität und Affinität der Sequenzen, die die beste Bindungsaktivität aus dem ersten Screening zeigen, unter Verwendung von mindestens zwei unabhängigen Bindungsassays (z. B. MicroScale Thermophorese (MST)37,38, Enzyme-Linked Oligonucleotide Assay (ELONA)39, Oberflächenplasmonenresonanz 40 oder Bioschichtinterferometrie (BLI)41).

Ergebnisse

Da DNA-Aptamere unter Verwendung von SELEX in einem Reagenzglas15 gewonnen werden können, wurde diese SELEX-Strategie sorgfältig entwickelt, um sowohl positive Selektionsschritte in Richtung des intakten, vollständigen infektiösen Virus (d. h. die Beibehaltung der DNA-Moleküle, die an das infektiöse Virus binden) als auch Gegenauswahlschritte für dasselbe Virus zu umfassen, das durch eine bestimmte Desinfektionsmethode nicht infektiös gemacht wurde. insbesondere UV-Behandlung, indem die D...

Diskussion

SELEX ermöglicht nicht nur die Identifizierung von Aptameren mit hoher Affinität, im pM-nM-Bereich 22,43,44,45, sondern auch mit hoher und abstimmbarer Selektivität. Durch die Ausnutzung der Counter-Selektion können Aptamere mit anspruchsvoller Selektivität erhalten werden. So hat die Li-Gruppe beispielsweise gezeigt, dass sie in der Lage ist, Sequenzen zu erhalten, mit denen pathogene Ba...

Offenlegungen

Die Autoren haben nichts zu verraten.

Danksagungen

Wir danken Frau Laura M. Cooper und Dr. Lijun Rong von der University of Illinois in Chicago für die Bereitstellung der in diesem Protokoll verwendeten Pseudovirusproben (SARS-CoV-2, SARS-CoV-1, H5N1) sowie Dr. Alvaro Hernandez und Dr. Chris Wright von der DNA Services Facility des Roy J. Carver Biotechnology Center an der University of Illinois at Urbana-Champaign für ihre Unterstützung bei der Hochdurchsatz-Sequenzierung. und viele Mitglieder der Lu-Gruppe, die uns bei der In-vitro-Selektion und Aptamer-Charakterisierungstechniken geholfen haben. Diese Arbeit wurde durch einen RAPID-Zuschuss der National Science Foundation (CBET 20-29215) und einen Seed-Zuschuss des Institute for Sustainability, Energy, and Environment an der University of Illinois at Urbana-Champaign und des Illinois-JITRI Institute (JITRI 23965) unterstützt. A.S.P. dankt dem PEW Latin American Fellowship für die finanzielle Unterstützung. Wir danken auch der Robert A. Welch Foundation (Grant F-0020) für die Unterstützung des Forschungsprogramms der Lu-Gruppe an der University of Texas in Austin.

Materialien

NameCompanyCatalog NumberComments
10% Ammonium persulfate (APS)BioRad1610700
100% EthanolSigma-AldrichE7023
1x PBS without calcium & magnesiumCorning21-040-CM
40% acrylamide/bisacrylamide (29:1) solutionBioRad1610146
Agencourt AMPure XP BeadsBeckman CoulterA63880DNA clean-up beads - Section 7.2.2
Amicon Ultra-0.5 Centrifugal Filter UnitMerckUFC501024cut-off 10 kDa
Amicon Ultra-0.5 Centrifugal Filter UnitMerckUFC510024cut-off 100 kDa
Boric AcidSigma-Aldrich100165
C1000 Touch Thermal Cycler with Dual 48/48 Fast Reaction ModuleBioRad1851148
Calcium ChlorideSigma-AldrichC4901
CFX Connect Real-Time PCR Detection SystemBioRad1855201
Digital Dry Baths/Block HeatersThermo Scientific88870001
Dynabeads MyOne Streptavidin C1Thermo Fisher65001streptavidin-modified magnetic beads - Section 4.9
EDTA disodium saltSigma-Aldrich324503
Eppendorf Safe-Lock microcentrifuge tubesSigma-AldrichT96611.5 mL
Lenti-X p24 Rapid Titer KitTakara Bio USA, Inc.632200Lentivirus quantification kit - Section 3.3.2.1
MagJET Separation Rack, 12 x 1.5 mL tubeThermo ScientificMR02
Magnesium chlorideSigma-AldrichM8266
Microseal 'B' PCR Plate Sealing Film, adhesive, opticalBioRadMSB1001non-UV absorbing
Mini-PROTEAN Tetra Cell for Ready Gel Precast GelsBioRad1658004EDU
Mini-PROTEAN Short PlatesBioRad1653308
Mini-PROTEAN Spacer Plates with 0.75 mm Integrated SpacersBioRad1653310
Molecular Biology Grade WaterLonza51200
Multiplate 96-Well PCR Plates, high profile, unskirted, clearBioRadMLP9611
Nanodrop OneThermo ScientificND-ONE-W
OneTaq DNA PolymeraseNew England BioLabM0480S
Ovation Ultralow v2 + UDITecan0344NB-A01High-troughput sequencing library preparation kit - Section 7.2.
PIPETMAN G (100-1000 µL, 20-200 µL, 2-20 µL and 0.2-2 µL)GilsonF144059M, F144058M, F144056M, F144054M
Purifier Logic+ Class II, Type A2 Biosafety CabinetsLabconco4261
Qubit dsDNA BR Assay KitInvitrogenQ32850fluorescence-based  dsDNA quantification  kit - Section 7.2.3
SHARP Classic Low Retention Pipet Tips (10 uL, 200 uL, 1000 uL)Thomas Scientific1158U43, 1159M44, 1158U40
Sodium acetateSigma-AldrichS2889
Sodium chlorideSigma-AldrichS7653
Sorvall Legend Micro 17R MicrocentrifugeThermo Scientific75002440
SsoFast EvaGreen SupermixBioRad1725201qPCR mastermix - Section 6.2.
Tris(hydroxymethyl)aminomethaneSigma-AldrichT1503
Tubes and Ultra Clear Caps, strips of 8USA scientificAB1183PCR tubes
UreaSigma-AldrichU5128

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