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In questo articolo

  • Riepilogo
  • Abstract
  • Introduzione
  • Protocollo
  • Risultati
  • Discussione
  • Divulgazioni
  • Riconoscimenti
  • Materiali
  • Riferimenti
  • Ristampe e Autorizzazioni

Riepilogo

Forniamo un protocollo che può essere generalmente applicato a selezionare aptameri che si legano solo a virus infettivi e non a virus che sono stati resi non infettivi da un metodo di disinfezione o ad altri virus simili. Ciò apre la possibilità di determinare lo stato di infettività nei test portatili e rapidi.

Abstract

Le infezioni virali hanno un impatto importante sulla società; La maggior parte dei metodi di rilevamento ha difficoltà a determinare se un virus rilevato è infettivo, causando ritardi nel trattamento e ulteriore diffusione del virus. Lo sviluppo di nuovi sensori in grado di informare sull'infettività dei campioni clinici o ambientali soddisferà questa sfida insoddisfatta. Tuttavia, pochissimi metodi possono ottenere molecole sensibili in grado di riconoscere un virus infettivo intatto e differenziarlo dallo stesso virus che è stato reso non infettivo dai metodi di disinfezione. Qui, descriviamo un protocollo per selezionare gli aptameri in grado di distinguere i virus infettivi dai virus non infettivi utilizzando l'evoluzione sistematica dei ligandi mediante arricchimento esponenziale (SELEX). Sfruttiamo due caratteristiche di SELEX. In primo luogo, SELEX può essere personalizzato per rimuovere bersagli concorrenti, come virus non infettivi o altri virus simili, utilizzando la selezione dei contatori. Inoltre, l'intero virus può essere utilizzato come bersaglio per SELEX, anziché, ad esempio, di una proteina virale di superficie. L'intero virus SELEX consente la selezione di aptameri che si legano specificamente allo stato nativo del virus, senza la necessità di interrompere il virus. Questo metodo consente quindi di ottenere agenti di riconoscimento sulla base di differenze funzionali nella superficie dei patogeni, che non devono essere conosciute in anticipo.

Introduzione

Le infezioni da virus hanno enormi impatti economici e sociali in tutto il mondo, come è diventato sempre più evidente dalla recente pandemia di COVID-19. Una diagnosi tempestiva e accurata è fondamentale nel trattamento delle infezioni virali e nella prevenzione della diffusione di virus a persone sane. Mentre sono stati sviluppati molti metodi di rilevamento dei virus, come i test PCR1,2 e i saggi inmunoassays3, la maggior parte dei metodi attualmente utilizzati non sono in grado di determinare se il virus rilevato è effettivamente infettivo o meno. Questo perché la presenza di componenti del virus da solo, come l'acido nucleico virale o le proteine, non indica che il virus infettivo intatto sia presente e i livelli di questi biomarcatori hanno mostrato una scarsa correlazione con l'infettività 4,5,6. Ad esempio, l'RNA virale, comunemente usato per gli attuali test COVID-19 basati sulla PCR, ha livelli molto bassi nelle prime fasi dell'infezione quando il paziente è contagioso, mentre il livello di RNA è spesso ancora molto alto quando i pazienti sono guariti dall'infezione e non sono più contagiosi 7,8. I biomarcatori della proteina virale o dell'antigene seguono una tendenza simile, ma in genere appaiono anche più tardi dell'RNA virale e quindi sono ancora meno predittivi di infettività 6,9. Per ovviare a questa limitazione, sono stati sviluppati alcuni metodi che possono informare sullo stato di infettività del virus, ma si basano su tecniche di microbiologia di coltura cellulare che richiedono molto tempo (giorni o settimane) per ottenere risultati 4,10. Pertanto, lo sviluppo di nuovi sensori in grado di informare sull'infettività dei campioni clinici o ambientali può evitare ritardi nel trattamento e un'ulteriore diffusione del virus. Tuttavia, pochissimi metodi possono ottenere molecole di rilevamento in grado di riconoscere un virione infettivo intatto e differenziarlo dallo stesso virus che è stato reso non infettivo.

In questo contesto, gli aptameri sono particolarmente adatti come strumento biomolecolare unico11,12,13,14. Gli aptameri sono molecole corte di DNA o RNA a singolo filamento con una specifica sequenza nucleotidica che consente loro di formare una specifica conformazione 3D per riconoscere un bersaglio con elevata affinità e selettività15,16. Sono ottenuti mediante un processo di selezione combinatoria chiamato evoluzione sistematica dei ligandi mediante arricchimento esponenziale (SELEX), noto anche come selezione in vitro, che viene effettuato in provette con una grande libreria di campionamento casuale del DNA di 10 14-1015 sequenze17,18,19. In ogni ciclo di questo processo iterativo, il pool di DNA viene prima sottoposto a una pressione di selezione attraverso l'incubazione con il bersaglio nelle condizioni desiderate. Tutte le sequenze che non sono legate al bersaglio vengono quindi rimosse, lasciando dietro di sé solo quelle poche sequenze che sono in grado di legarsi nelle condizioni date. Infine, le sequenze che sono state selezionate nella fase precedente vengono amplificate dalla PCR, arricchendo la popolazione del pool con le sequenze funzionali desiderate per il prossimo round di selezione, e il processo viene ripetuto. Quando l'attività del pool di selezione raggiunge un plateau (tipicamente dopo 8-15 round), la biblioteca viene analizzata mediante sequenziamento del DNA per identificare le sequenze vincenti che mostrano la massima affinità.

SELEX ha vantaggi unici che possono essere sfruttati per ottenere una maggiore selettività contro altri bersagli simili20,21, come ad esempio per lo stato di infettività del virus 22. In primo luogo, un'ampia varietà di diversi tipi di bersagli può essere utilizzata per la selezione, da piccole molecole e proteine a interi patogeni e cellule16. Pertanto, per ottenere un aptamero che si lega a un virus infettivo, un virus intatto può essere utilizzato come bersaglio, invece di una proteina di superficie virale19. L'intero virus SELEX consente la selezione di aptameri che si legano specificamente allo stato nativo del virus, senza la necessità di interrompere il virus. In secondo luogo, SELEX può essere personalizzato per rimuovere bersagli concorrenti 21,23, come altri virus simili o virus inattivati non infettivi, utilizzando fasi di selezione del contatore in ogni round di selezione22. Durante le fasi di selezione del contatore, il pool di DNA viene esposto a bersagli per i quali non è desiderato il legame e tutte le sequenze che si legano vengono scartate.

In questo lavoro, forniamo un protocollo che può essere generalmente applicato per selezionare gli aptameri che si legano a un virus infettivo ma non allo stesso virus che è stato reso non infettivo da un particolare metodo di disinfezione o da un altro virus correlato. Questo metodo consente di ottenere agenti di riconoscimento in base alle differenze funzionali della superficie del virus, che non devono essere conosciute in anticipo, e offre quindi un ulteriore vantaggio per l'individuazione di agenti patogeni di recente emersione o per malattie poco studiate.

Protocollo

1. Preparazione di reagenti e tamponi

  1. Preparare 10x Tris-borate EDTA (10x TBE) aggiungendo 0,9 M Tris-base, 0,9 M acido borico, 20 mM EDTA (sale disodico) e acqua deionizzata ad un volume finale di 1 L. Mescolare fino a quando tutti i componenti sono sciolti.
  2. Preparare una soluzione madre di poliacrilammide denaturante al 10% come segue. In una bottiglia di vetro da 250 ml, aggiungere 120 g di urea (8 M), 25 ml di 10x TBE, 62,5 ml di soluzione al 40% di acrilammide/bisacrilammide (29:1) e abbastanza acqua distillata per raggiungere il volume finale di 250 ml. Mescolare fino a quando tutti i componenti sono sciolti.
  3. Preparare il buffer di caricamento 2x come segue. In una provetta da 50 ml, aggiungere 21,636 g di urea (8 M), 1,675 g di EDTA (1 mM) e 4,5 ml di 10x TBE. Riempire a 45 ml con acqua distillata e mescolare fino a quando tutti i componenti sono sciolti.
  4. Preparare il tampone di estrazione aggiungendo 100 mM di acetato di sodio e 1 mM di EDTA (sale disodico). Impostare il pH finale su 5.
  5. Preparare le soluzioni di precipitazione dell'etanolo come segue. Preparare l'acetato di sodio 3 M, regolare a pH 5,2 e conservare a 4 °C. Preparare etanolo al 70% v/v e conservare a -20 °C. Preparare etanolo al 100% e conservare a -20 °C.
  6. Preparare 500 mL di tampone SELEX contenente 1x PBS, 2,5 mM MgCl 2 e 0,5 mM CaCl2. Regolare a pH 7,4. Preparare 100 mL di tampone SELEX con 8 M di urea aggiungendo 1x PBS, 2,5 mM MgCl 2, 0,5 mM CaCl2 e 8 M urea. Regolare a pH 7,4.
    NOTA: La scelta del tampone SELEX è fondamentale per garantire che l'aptamero selezionato funzioni sul campione finale in cui verrà applicato l'aptamero. Ad esempio, gli aptameri specifici per SARS-CoV-2 saranno utilizzati in campioni biologici (ad esempio, tamponi di saliva o nasofaringe). Pertanto, è importante scegliere concentrazioni di ioni, pH e tampone che imitino da vicino tali condizioni nei campioni biologici previsti.
  7. Preparare il tampone di rilegatura e lavaggio come segue. In una provetta da 50 ml, preparare 5 mM Tris, 0,5 mM EDTA (sale disodico) e 2 M NaCl. Regolare a pH 7,5.

2. Progettazione e sintesi di librerie e primer del DNA

  1. Progettare la libreria iniziale di ssDNA e i primer con i seguenti criteri (vedere la Tabella 1 per un esempio di libreria di ssDNA e set di primer, dove N indica una posizione nucleotidica casuale).
    1. Assicurati che la libreria contenga una regione casuale centrale di 35-60 nucleotidi affiancata da due sequenze costanti alle estremità 3' e 5' che fungono da regioni di primer per l'amplificazione. Una lunghezza tipica della libreria è di 45 nucleotidi casuali.
    2. Assicurarsi che il primer inverso contenga una modifica della biotina per separare l'ssDNA dai prodotti PCR a doppio filamento amplificati utilizzando perline rivestite di streptavidina durante il processo di selezione in vitro .
  2. Acquistare gli oligo di DNA da fonti commerciali con purificazione di desalinizzazione standard. Purificare la libreria e i primer ssDNA mediante elettroforesi su gel di poliacrilammide denaturante al 10% (dPAGE), seguita da precipitazione dell'etanolo secondo le procedure standard24.
    ATTENZIONE: Il monomero di acrilammide e il bromuro di etidio sono sostanze chimiche pericolose (cancerogeni per l'uomo), quindi utilizzare dispositivi di protezione individuale appropriati (camici da laboratorio, guanti e protezione per gli occhi) durante l'esecuzione di PAGE. Quando possibile, evitare l'uso di bromuro di etidio e sostituirlo con un colorante più sicuro.
    NOTA: È possibile ordinare gli oligo con purificazione HPLC per evitare di eseguire questa fase di purificazione, sebbene ciò non rimuova gli oligonucleotidi corti in modo efficace.
  3. Aggiungere acqua priva di nucleasi per risospendere l'ssDNA dopo la precipitazione dell'etanolo fino alla concentrazione desiderata (100 μM). Determinare la concentrazione della libreria di ssDNA e dei primer mediante assorbimento UV a λ = 260 nm. Conservare a -20 °C.
  4. Acquistare un primer inverso non modificato da utilizzare per la preparazione della libreria di sequenziamento ad alto rendimento e la quantificazione qPCR.

3. Campioni di virus infettivi e non infettivi

ATTENZIONE: I campioni di virus infettivi e non infettivi sono campioni di livello di biosicurezza 2 (BSL2) che richiedono particolare attenzione per essere maneggiati in modo sicuro e appropriato. Tutte le fasi della procedura che includono questi campioni devono essere eseguite in un armadio di biosicurezza o la soluzione virale deve essere in un contenitore sigillato (ad esempio, tubi di plastica tappati).

  1. Ottenere una soluzione madre di virus infettivi o prepararli, seguendo il protocollo corrispondente per ciascun virus. Gli pseudovirus SARS-CoV-2, SARS-CoV-1 e H5N1 utilizzati qui sono stati forniti dal laboratorio del Prof. Lijun Rong (UIC) in tampone PBS e sono stati preparati seguendo i protocolli riportati22,25,26.
    NOTA: per i virus che richiedono strutture di livello 3 di biosicurezza per gestire il virus infettivo intatto, è possibile lavorare con pseudovirus. Un virus pseudotipizzato è generato da un lentivirus (HIV) che mostra le proteine di superficie del virus all'interno dell'involucro virale, e quindi imita da vicino la superficie e il meccanismo di ingresso del virus, ma è difettoso nella replicazione virale continua.
  2. Ottenere una soluzione madre di virus non infettiva o prepararla seguendo la procedura di disinfezione. Lo pseudovirus SARS-CoV-2 inattivato dai raggi UV (p-SARS-CoV-2) utilizzato qui è stato fornito dal laboratorio del Prof. Rong (UIC) nel buffer PBS e il protocollo precedentemente riportato è stato utilizzato per l'inattivazione UV22.
    NOTA: Se possibile, eseguire un test per testare l'infettività del virus per assicurarsi che il virus sia stato completamente inattivato.
  3. Quantificare le scorte di virus
    1. Quantificare il virus utilizzando un test della placca secondo le procedure standard27,28,29. Questo test non solo consente la quantificazione del virus ma indica anche lo stato di infettività del virus, confermando la concentrazione del virus infettivo.
    2. Per gli pseudovirus o i virus in cui non è disponibile un test della placca, quantificare il virus utilizzando un kit ELISA di lentivirus quantitativo disponibile in commercio.
    3. Preparare 1 x 108 copie/ml di soluzione madre per p-SARS-CoV-2, p-SARS-CoV-1 e p-H5N1. Separare ciascuna soluzione madre in aliquote contenenti 50 μL ciascuna e conservare a -80 °C. Scongelare una nuova aliquota prima di ogni esperimento.

4. Selezione in vitro o processo SELEX: ciclo iniziale

NOTA: per tutti i passaggi che utilizzano il virus infettivo, lavorare in un armadio BSL2.

  1. Denaturare la libreria ssDNA. Prelevare 10 μL di 100 μM della libreria ssDNA (1 nmol) e mescolare con 240 μL di tampone SELEX. Riscaldare a 95 °C per 15 minuti in un bagno asciutto, quindi posizionare il tubo sul ghiaccio per 15 minuti.
  2. Incubare la libreria ssDNA con il virus infettivo (fase di selezione positiva) come segue. Mescolare 250 μL di libreria di ssDNA nel tampone SELEX del punto 4.1 con 50 μL di virus infettivo (1 x 108 copie/ml). Incubare per 2 ore a temperatura ambiente.
  3. Bloccare i siti non specifici nei filtri centrifughi come segue. In attesa del passaggio 4.2, preparare i filtri centrifughi per i passaggi successivi.
    1. Aggiungere 400 μL di sequenza T20 da 1 mM (Tabella 1) a ciascun filtro centrifugo da 0,5 mL che verrà utilizzato: un filtro centrifugo con un cut-off di 100 kDa e uno con un cut-off di 10 kDa.
    2. Incubare per 30 minuti a temperatura ambiente e centrifugare a 14.000 x g per 10 minuti per rimuovere la soluzione T20 nel filtro. Lavare 3 volte con tampone SELEX per rimuovere le sequenze T20 in eccesso.
  4. Lavare le sequenze non legate come segue. Aggiungere la miscela incubata al punto 4.2 al filtro centrifugo da 100 kDa bloccato e centrifugare a 14.000 x g per 10 minuti. Lavare 3 volte, aggiungendo 400 μL di tampone SELEX e centrifugando a 14.000 x g per 10 minuti. Mantenere la frazione nel filtro ed eliminare il flusso passante.
  5. Sequenze legate all'eluizione come descritto di seguito.
    1. Cambiare il tubo di raccolta del filtro centrifugo e aggiungere 300 μL di tampone SELEX contenente 8 M urea al filtro centrifugo nella fase 4.4. Riscaldare il filtro della centrifuga a 95 °C per 15 minuti in un bagno asciutto e quindi centrifugare a 14.000 x g per 10 minuti.
    2. Raccogliere la frazione che scorre attraverso il filtro contenente le sequenze eluite. Ripeti altre tre volte. Lavorare in un armadio BSL2 e lavare tutti i materiali con candeggina al 10% per inattivare il virus prima di scartare i materiali.
  6. Concentrare e dissalare come segue. Aggiungere la soluzione raccolta in 4.5 ad un filtro centrifugo da 10 kDa bloccato. Centrifugare a 14.000 x g per 15 min. Scartare la frazione che fluiva attraverso il filtro.
    NOTA: Poiché i virus vengono trattenuti e inattivati con 8 M urea nel filtro nella fase precedente, questa e le seguenti fasi non devono essere eseguite nell'armadio di biosicurezza. Questa procedura deve essere ripetuta se si utilizza una provetta da centrifuga da 0,5 mL fino a quando tutta la soluzione viene raccolta come nella fase 4.5, 1,2 mL fluiscono attraverso il filtro.
  7. Lavare 3 volte con 300 μL di tampone SELEX per rimuovere l'urea centrifugando a 14.000 x g per 15 minuti. Scartare la frazione che fluiva attraverso il filtro. Recuperare la soluzione nel filtro capovolgendola in un tubo di raccolta pulito e centrifugando per 5 minuti.
  8. Misurare il volume finale della soluzione recuperata da 4.7 utilizzando una pipetta in un tubo di plastica. Questa soluzione è chiamata R ia, dove i corrisponde al numero tondo. Tipicamente, si ottengono volumi compresi tra 30 μL e 50 μL. Prendi 1 μL di ssDNA eluito per quantificare la quantità di DNA mediante qPCR.
    NOTA: Questo è un possibile punto di pausa, in cui il campione R1a può essere mantenuto a -20 °C per continuare in un altro momento.
  9. Eseguire l'amplificazione PCR come descritto di seguito.
    1. Nel primo round, prendi il 90% del campione R1come modello di PCR. Nei cicli successivi, prelevare il 60% del volume totale nella fase 4.8 per eseguire la PCR e conservare l'altra frazione a -20 °C.
    2. Impostare una reazione PCR da 50 μL con la concentrazione finale specificata: 1x tampone di reazione PCR, 200 μM dNTPs, 10 μL di modello di DNA (R 1 un campione), 200 nM ogni primer e1,25U polimerasi (2,5 U / μL stock).
    3. Ottimizzare le condizioni della PCR, incluso il numero di cicli e la temperatura di ricottura per ogni set di primer e libreria di ssDNA. Evitare di utilizzare troppi cicli, che produrranno sottoprodotti PCR indesiderati come i primer-dimeri. Testare diverse temperature di ricottura in base alla temperatura di fusione dei primer.
    4. Eseguire la PCR utilizzando condizioni ottimizzate a 95 °C per 5 minuti seguite da 18 cicli di 1 min a 95 °C, 30 s a 52 °C e 1 min a 72 °C, con una fase di estensione finale a 72 °C per 10 minuti, per ottenere il pool di dsDNA.
      NOTA: Questo è un altro possibile punto di pausa, in cui il prodotto PCR può essere mantenuto a -20 °C per continuare in un altro momento.
  10. Recupera ssDNA usando perline magnetiche modificate con streptavidina.
    1. Assumere l'80% del prodotto PCR. Conservare la frazione rimanente a -20 °C.
    2. Dividere il prodotto PCR in aliquote da 50 μL e aggiungerle a tubi microfuge contenenti 50 μL di sfere magnetiche (MB) modificate con streptavidina. Incubare per 30 minuti con lieve agitazione (ad esempio, utilizzare uno shaker rotante) a temperatura ambiente. Quindi, posizionare il tubo di microfuge sul rack magnetico per isolare il MB e rimuovere il surnatante mediante pipettaggio (deve essere una soluzione trasparente).
    3. Lavare aggiungendo 200 μL di tampone legante e di lavaggio al tubo. Rimuovere il tubo dal rack magnetico, picchiettarlo e risospendere il MB in una soluzione omogenea mediante pipettaggio. Riposizionare il tubo di microfuge sul rack magnetico per isolare il MB e rimuovere il surnatante mediante pipettaggio. Ripetere questo passaggio di lavaggio due volte.
    4. Una volta completato il lavaggio, risospendere il MB in un totale di 100 μL di tampone SELEX e riscaldare la soluzione a 95 °C per 10 minuti. Posizionare immediatamente il tubo nel rack magnetico prima che il tubo si raffreddi e prendere il surnatante contenente il pool di ssDNA. Ripetere questa fase di ripristino, aggiungendo 50 μL di tampone SELEX.
  11. Misurare il volume finale della frazione recuperata da 4.10 utilizzando una pipetta. Questa frazione è chiamata R i x, dove i corrisponde al numero tondo. In generale, si ottengono volumi compresi tra 140 e 150 μL. Prendi 1 μL di R1x per quantificare la quantità di DNA mediante qPCR.

5. Turni di selezione successivi

  1. Denaturare il pool di ssDNA. Prelevare il 60% del campione R1x e mescolarlo con 50 μL di tampone SELEX. Riscaldare a 95 °C per 15 minuti in bagno asciutto. Posizionare il tubo sul ghiaccio per 15 minuti.
  2. Incubare il pool di ssDNA con il virus non infettivo e altri potenziali virus interferenti (fase di selezione del contatore). Mescolare il pool di ssDNA denaturato nel tampone SELEX da 5,1 con 50 μL di ciascun virus (5 x 109 copie/ml; ad esempio, p-SARS-CoV-2, p-SARS-CoV-1 e p-H5N1 non infettivi). Incubare per 1 ora a temperatura ambiente.
  3. Bloccare siti non specifici nei filtri centrifughi. In attesa del punto 5.2., preparare i filtri della centrifuga per i passaggi successivi. In genere, utilizzare due filtri centrifughi, uno con un cut-off di 100 kDa e uno con un cut-off di 10 kDa. Seguire la stessa procedura del punto 4.3.
  4. Lavare via le sequenze legate a virus non bersaglio. Aggiungere la miscela incubata al punto 5.2 in un filtro centrifugo da 100 kDa bloccato. Centrifugare a 14.000 x g per 10 minuti e recuperare la frazione che scorre attraverso il filtro della centrifuga. Lavare 2 volte, aggiungendo 100 μL di tampone SELEX e centrifugando a 14.000 x g per 10 minuti. Mantieni la frazione che scorre attraverso il filtro.
  5. Incubare il pool di ssDNA con il virus infettivo (fase di selezione positiva). Prelevare i 300 μL di frazione del punto 5.4 e mescolarli con 50 μL del virus infettivo (1 x 108 copie/ml). Incubare per 2 ore a temperatura ambiente. Seguire i passaggi da 4.4 a 4.11.

6. Monitoraggio del processo SELEX

NOTA: per monitorare l'arricchimento del pool, la qPCR viene utilizzata in due modi. In primo luogo, con la quantificazione assoluta, è possibile testare l'arricchimento delle piscine (resa in eluizione). In secondo luogo, monitorando la curva di fusione, è possibile valutare la diversità dei pool (convergenza delle specie aptamere)30.

  1. Eseguire tutti i test qPCR con un volume di reazione di 10 μL in piastre a 96 pozzetti progettate per qPCR.
  2. Preparare una miscela qPCR standard contenente 5 μL di miscela madre, 0,3 μL di 500 nM di ciascun primer non marcato, 3,4 μL di H2O e 1 μL di modello di DNA.
    1. Preparare diluizioni della libreria di ssDNA purificato (passo 2.3) per eseguire la curva standard.
    2. Diluire i campioni di DNA per far sì che la loro concentrazione si adatti alla curva standard. Per i campioni di Ria, aggiungere 1 μL del campione senza diluizione e 1 μL di diluizione 1:10 alla miscela qPCR. Per i campioni Rix, includere diluizioni 1:10 o 1:100.
  3. Eseguire qPCR impostando il seguente protocollo. Innanzitutto, impostare una fase iniziale di denaturazione a 98 °C per 2 minuti. Quindi, impostare 40 cicli di denaturazione a 98 °C per 5 s e ricottura ed estensione a 52 °C per 10 s. Infine, impostare un'analisi della curva di fusione da 65 a 95 °C. Determinare i valori del ciclo di soglia (Ct) mediante l'analisi automatica delle soglie.
  4. Utilizzando la curva standard, quantificare la quantità di ssDNA nei campioni Ri a e Rix.
  5. Calcolare la resa di eluizione come quantità di DNA legato (numero di moli in R i a) diviso per la quantità di DNA iniziale (numero di moli in Ri-1x). Tracciare la resa di eluizione rispetto al numero tondo per vedere se si osserva un arricchimento sui round.
  6. Tracciate le curve di fusione per diversi arrotondamenti. Si prevede uno spostamento verso temperature di fusione più elevate nel picco vicino a 75/85 °C con l'aumentare del numero di round. Ciò significa che la diversità della piscina diminuisce.

7. Sequenziamento ad alta produttività

  1. Consultare la funzione di sequenziamento ad alta velocità effettiva su quali tipi di sequenziamento e scale sono disponibili, che determineranno il metodo di preparazione della libreria.
    NOTA: Questa decisione prenderà in considerazione sia la lunghezza dei pool da sequenziare (compresi i primer) sia il numero di pool da presentare (generalmente, mirare ad almeno 1 x 105-10 6 sequenze per pool). Se una particolare scala di sequenziazione non è in grado di leggere l'intera lunghezza del pool, è possibile utilizzare la sequenza a estremità accoppiata per leggere da entrambe le estremità della sequenza, a differenza di un'estremità singola che legge da una sola estremità.
  2. Selezionare un kit appropriato disponibile in commercio in base al tipo di sequenziamento, in consultazione con la struttura di sequenziamento. Preparare più pool di round di selezione che rappresentano l'arricchimento alto, medio e basso, nonché il pool finale, utilizzando una coppia diversa di indici negli adattatori per ciascun pool che consenta l'analisi del campione di tutti i round utilizzando una corsia.
    NOTA: l'amplificazione PCR può anche essere utilizzata per incorporare gli adattatori e gli indici richiesti per il sequenziamento ad alta produttività, ma questo generalmente costa simile ai kit commerciali e non funziona meglio.
    1. Eseguire la preparazione della libreria seguendo questi passaggi: riparazione finale del DNA frammentato, legatura dell'adattatore e amplificazione PCR per produrre le librerie finali.
    2. Purificare il prodotto PCR con perline magnetiche di pulizia del DNA seguendo le istruzioni del produttore.
    3. Quantificare il DNA utilizzando un kit di quantificazione basato sulla fluorescenza. Evitare di utilizzare metodi meno accurati, come misurazioni UV di piccoli volumi.
    4. Mescolare quantità approssimativamente uguali (per quantità di DNA, non per volume) di ogni libreria di pool contenente indici specifici.
    5. Controlla la qualità della libreria finale con la quantificazione qPCR e un analizzatore di frammenti di DNA. Questo passaggio viene spesso eseguito dalla struttura di sequenziamento.
      NOTA: Il personale della struttura di sequenziamento può fornire informazioni utili su come preparare la biblioteca e quali controlli di qualità sono suggeriti. È necessario discutere con loro prima di preparare le biblioteche.
  3. Invia la libreria finale preparata alla struttura di sequenziamento in base alle loro esigenze.

8. Analisi di sequenziamento

  1. La maggior parte del software disponibile per l'analisi delle sequenziazioni è progettato per essere eseguito sulla riga di comando su un sistema operativo Linux. Per piccoli set di dati, impostare il sistema operativo Linux desiderato e installare i programmi richiesti su un personal computer; per set di dati più grandi, l'analisi HTS viene eseguita su risorse di calcolo ad alte prestazioni o super computer (consigliato).
    NOTA: l'accesso e la formazione saranno necessari per utilizzare le risorse di calcolo ad alte prestazioni, che potrebbero richiedere del tempo per ottenere. Inoltre, sarà richiesta una conoscenza di base dell'utilizzo della riga di comando UNIX. Molte risorse gratuite sull'utilizzo di base della riga di comando sono disponibili online e le risorse di elaborazione forniranno probabilmente informazioni aggiuntive per l'utilizzo dei loro sistemi.
  2. Accedere ai file di sequenziamento, in genere in un formato di file FastQ compresso, utilizzando le informazioni fornite dalla funzione di sequenziamento.
    1. Utilizzare un client FTP per trasferire i file sul proprio computer e/o sulla risorsa di calcolo ad alte prestazioni. Molti programmi di analisi delle sequenze possono utilizzare direttamente i file compressi, quindi mantenere i file compressi, se possibile, per limitare le dimensioni dei file (letture di sequenze di grandi dimensioni di 50 M+ possono occupare fino a 100 Gb+ di spazio su file quando non compresse).
    2. Se i file di sequenza devono essere decompressi, utilizzare la funzione gzip che è standard sulla maggior parte delle installazioni Linux. Ottenere ulteriori informazioni su gzip e le sue opzioni dal manuale di installazione digitando "man gzip" sulla riga di comando.
  3. Pulisci le sequenze prima dell'analisi mediante demultiplexing, rimuovendo gli adattatori di sequenziazione, rimuovendo le letture di bassa qualità e includendo le letture in direzione diretta e inversa.
    1. Utilizzare il programma FastQC31 dopo ciascuno dei seguenti passaggi per ottenere informazioni di base sul controllo qualità sulle sequenze per valutare l'efficacia di ogni fase di pulizia.
    2. Demultiplex le sequenze per separare tutte le sequenze da un singolo file di lettura nei diversi pool in base agli indici inclusi negli adattatori di sequenziazione. Questo passaggio viene spesso eseguito dalla struttura di sequenziamento, che dovrebbe essere consultata poiché la procedura esatta dipenderà dalla macchina di sequenziamento utilizzata.
    3. Rimuovere gli adattatori di sequenziazione utilizzando il programma da riga di comando, Cutadapt32. Utilizzare i primer di selezione (anziché gli adattatori di sequenziazione) come input in modalità Adattatore collegato. Utilizzate l'opzione --discut-untrimmed per eliminare le sequenze che non contengono i primer di selezione.
    4. Impostare le opzioni per il tasso di errore massimo che corrisponde agli adattatori e la lunghezza minima e massima delle sequenze da accettare. Se si utilizzano letture finali accoppiate, immettere parametri specifici disponibili e fornire entrambi i file di sequenziazione Read 1 e Read 2. Impostare parametri aggiuntivi in base alle esigenze facendo riferimento al manuale Cutadapt32.
      NOTA: la legatura degli adattatori di sequenziazione ai pool è indipendente dalla direzione e incorporerà circa il 50% delle sequenze nella direzione di avanzamento e il 50% nella direzione opposta. Per evitare di perdere il 50% delle sequenze nella direzione inversa, Cutadapt può essere eseguito una seconda volta utilizzando il complemento inverso dei primer di selezione come input.
    5. (Facoltativo) Se si utilizza la sequenza paired-end, unire i file Read 1 e Read 2 con il programma PEAR33.
    6. Utilizzare il programma FASTX-Toolkit34 per rimuovere sequenze di bassa qualità che hanno una qualità inferiore a una certa soglia in qualsiasi nucleotide. Un punteggio limite di qualità di 30 è un buon punto di partenza. Se la qualità complessiva è generalmente buona, questo passaggio può essere saltato.
    7. Per unire i file di sequenza nella direzione opposta con quelli nella direzione di avanzamento, utilizzare la funzione di fastx_reverse_complement FASTX-Toolkit sui file di direzione inversa. Quindi utilizzare il programma cat integrato (standard sulla maggior parte delle installazioni Linux) per unire i file forward e reverse-complement - reverse in un singolo file.
  4. Per analizzare l'arricchimento delle sequenze tra diversi pool di selezione, utilizzare il toolkit di analisi FASTAptamer35.
    1. Utilizzare FASTAptamer-Count per contare il numero di volte in cui viene visualizzata ogni sequenza. Quindi, classifica e ordina le sequenze per abbondanza. Il file di output di conteggio è necessario come input per tutti gli altri programmi FASTAptamer.
    2. Utilizzare FASTAptamer-Clust per raggruppare tutte le sequenze di un file in cluster di sequenze strettamente correlate. Utilizzare il parametro "distanza" per definire il numero di mutazioni o indels a singolo nucleotide che possono essere raggruppate in un cluster.
      NOTA: Il programma FASTAptamer-Clust può essere molto costoso dal punto di vista computazionale se è presente un numero elevato di sequenze uniche (specialmente per i primi round), che potrebbe richiedere giorni o addirittura settimane per essere completato completamente. Il parametro del filtro di taglio può essere utilizzato per escludere le sequenze a bassa abbondanza dal clustering. In generale, è bene iniziare con un cut-off più alto, ad esempio 10 o 5 letture per milione (RPM) e diminuirlo se il programma termina rapidamente. Se i pool sono molto eterogenei, potrebbe non essere possibile raggruppare le sequenze in un lasso di tempo ragionevole.
    3. Utilizzare FASTAptamer-Enrich per calcolare l'arricchimento di ogni sequenza presente in più di un round della selezione. Confronta l'RPM della sequenza di una popolazione con l'RPM di un'altra. Utilizzare il programma Enrich sui file Count o Cluster. L'output è un file con valori separati da tabulazioni (.tsv) che può essere aperto in qualsiasi software per fogli di calcolo per ulteriori analisi e un facile ordinamento.
      NOTA: Il programma FASTAptamer-Enrich può anche essere molto costoso dal punto di vista computazionale se è presente un numero elevato di sequenze univoche. Il parametro del filtro di taglio può essere utilizzato per escludere sequenze a bassa abbondanza dall'output per evitare file troppo grandi per essere aperti nel software per fogli di calcolo.
    4. (Facoltativo) Se molti pool sono troppo eterogenei (molte sequenze univoche e poche sequenze duplicate), potrebbe non essere possibile utilizzare i programmi Clust o Enrich. In questo caso, eseguire un controllo manuale dell'arricchimento utilizzando il file di output Count che ordina le sequenze per abbondanza (più abbondante in alto) e rinomina l'identificatore della sequenza per includere informazioni importanti come RPM.
      1. Usa il programma standard Linux "head" sui file Count per ottenere un elenco delle sequenze più abbondanti. Quindi utilizzare il programma standard Linux "grep" per cercare ciascuna delle sequenze più abbondanti nei file Count di tutti gli altri pool rilevanti. Se sono presenti corrispondenze, utilizzare l'identificatore di sequenza modificato per determinare l'RPM in tale pool per costruire manualmente le informazioni di arricchimento.
        NOTA: gli script per tutte le fasi dell'analisi di sequenziazione sono disponibili nei file di codifica supplementari 1-11.

9. Validazione e saggi di legame dell'aptamero

  1. Dalle informazioni di arricchimento ottenute attraverso l'analisi delle sequenze, identificare le sequenze di aptamero candidate sulla base delle sequenze che hanno il maggior arricchimento nei cicli di selezione successivi e/o le sequenze più abbondanti nel turno di selezione finale. Selezionare diverse sequenze candidate (almeno 10-20) per ulteriori test poiché gli aptameri più altamente arricchiti potrebbero non essere necessariamente gli aptameri con le migliori prestazioni.
  2. Eseguire lo screening iniziale dei candidati aptameri utilizzando un test vincolante che può essere eseguito rapidamente per più campioni. Un saggio di legame per ultrafiltrazione basato su colonna36 o un saggio di oligonucleotidi enzimatici (ELONA) sono buoni metodi per questo screening iniziale.
  3. Analizzare la specificità e l'affinità delle sequenze che mostrano la migliore attività di legame dallo screening iniziale, utilizzando almeno due saggi di legame indipendenti (ad esempio, MicroScale Thermophoresis (MST)37,38, Enzyme-Linked Oligonucleotide Assay (ELONA)39, surface plasmon resonance 40 o biolayer interferometry (BLI)41).

Risultati

Poiché gli aptameri del DNA possono essere ottenuti utilizzando SELEX in una provetta15, questa strategia SELEX è stata attentamente progettata per includere sia le fasi di selezione positiva verso il virus infettivo intatto e intero (cioè, mantenere le molecole di DNA che si legano al virus infettivo), sia le fasi di controselezione per lo stesso virus che è stato reso non infettivo da un particolare metodo di disinfezione, in particolare il trattamento UV, scartando le sequenze di DNA che p...

Discussione

SELEX permette non solo l'identificazione di aptameri ad alta affinità, nell'intervallo pM-nM 22,43,44,45, ma anche con selettività elevata e sintonizzabile. Sfruttando la controselezione, è possibile ottenere aptameri con selettività impegnativa. Ad esempio, il gruppo Li ha dimostrato la capacità di ottenere sequenze in grado di differenziare i ceppi batterici patogeni dai ceppi non pato...

Divulgazioni

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Riconoscimenti

Desideriamo ringraziare la Sig.ra Laura M. Cooper e il Dr. Lijun Rong dell'Università dell'Illinois a Chicago per aver fornito i campioni di pseudovirus utilizzati in questo protocollo (SARS-CoV-2, SARS-CoV-1, H5N1), così come il Dr. Alvaro Hernandez e il Dr. Chris Wright della struttura DNA Services del Roy J. Carver Biotechnology Center presso l'Università dell'Illinois a Urbana-Champaign per la loro assistenza con il sequenziamento ad alto rendimento, e molti membri del gruppo Lu che ci hanno aiutato con la selezione in vitro e le tecniche di caratterizzazione degli aptameri . Questo lavoro è stato sostenuto da una sovvenzione RAPID della National Science Foundation (CBET 20-29215) e da una sovvenzione seed dell'Istituto per la sostenibilità, l'energia e l'ambiente presso l'Università dell'Illinois a Urbana-Champaign e l'Illinois-JITRI Institute (JITRI 23965). A.S.P. ringrazia la PEW Latin American Fellowship per il sostegno finanziario. Ringraziamo anche la Robert A. Welch Foundation (Grant F-0020) per il sostegno al programma di ricerca del gruppo Lu presso l'Università del Texas ad Austin.

Materiali

NameCompanyCatalog NumberComments
10% Ammonium persulfate (APS)BioRad1610700
100% EthanolSigma-AldrichE7023
1x PBS without calcium & magnesiumCorning21-040-CM
40% acrylamide/bisacrylamide (29:1) solutionBioRad1610146
Agencourt AMPure XP BeadsBeckman CoulterA63880DNA clean-up beads - Section 7.2.2
Amicon Ultra-0.5 Centrifugal Filter UnitMerckUFC501024cut-off 10 kDa
Amicon Ultra-0.5 Centrifugal Filter UnitMerckUFC510024cut-off 100 kDa
Boric AcidSigma-Aldrich100165
C1000 Touch Thermal Cycler with Dual 48/48 Fast Reaction ModuleBioRad1851148
Calcium ChlorideSigma-AldrichC4901
CFX Connect Real-Time PCR Detection SystemBioRad1855201
Digital Dry Baths/Block HeatersThermo Scientific88870001
Dynabeads MyOne Streptavidin C1Thermo Fisher65001streptavidin-modified magnetic beads - Section 4.9
EDTA disodium saltSigma-Aldrich324503
Eppendorf Safe-Lock microcentrifuge tubesSigma-AldrichT96611.5 mL
Lenti-X p24 Rapid Titer KitTakara Bio USA, Inc.632200Lentivirus quantification kit - Section 3.3.2.1
MagJET Separation Rack, 12 x 1.5 mL tubeThermo ScientificMR02
Magnesium chlorideSigma-AldrichM8266
Microseal 'B' PCR Plate Sealing Film, adhesive, opticalBioRadMSB1001non-UV absorbing
Mini-PROTEAN Tetra Cell for Ready Gel Precast GelsBioRad1658004EDU
Mini-PROTEAN Short PlatesBioRad1653308
Mini-PROTEAN Spacer Plates with 0.75 mm Integrated SpacersBioRad1653310
Molecular Biology Grade WaterLonza51200
Multiplate 96-Well PCR Plates, high profile, unskirted, clearBioRadMLP9611
Nanodrop OneThermo ScientificND-ONE-W
OneTaq DNA PolymeraseNew England BioLabM0480S
Ovation Ultralow v2 + UDITecan0344NB-A01High-troughput sequencing library preparation kit - Section 7.2.
PIPETMAN G (100-1000 µL, 20-200 µL, 2-20 µL and 0.2-2 µL)GilsonF144059M, F144058M, F144056M, F144054M
Purifier Logic+ Class II, Type A2 Biosafety CabinetsLabconco4261
Qubit dsDNA BR Assay KitInvitrogenQ32850fluorescence-based  dsDNA quantification  kit - Section 7.2.3
SHARP Classic Low Retention Pipet Tips (10 uL, 200 uL, 1000 uL)Thomas Scientific1158U43, 1159M44, 1158U40
Sodium acetateSigma-AldrichS2889
Sodium chlorideSigma-AldrichS7653
Sorvall Legend Micro 17R MicrocentrifugeThermo Scientific75002440
SsoFast EvaGreen SupermixBioRad1725201qPCR mastermix - Section 6.2.
Tris(hydroxymethyl)aminomethaneSigma-AldrichT1503
Tubes and Ultra Clear Caps, strips of 8USA scientificAB1183PCR tubes
UreaSigma-AldrichU5128

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