3D-Bioprinting von phototunbaren Hydrogelen zur Untersuchung der Fibroblastenaktivierung

Zusammenfassung

In diesem Artikel wird beschrieben, wie phototunbare Hydrogele in 3D biogedruckt werden, um die Versteifung der extrazellulären Matrix und die Aktivierung von Fibroblasten zu untersuchen.

Zusammenfassung

Phototunbare Hydrogele können sich als Reaktion auf Lichteinwirkung räumlich und zeitlich verändern. Die Integration dieser Art von Biomaterialien in Zellkulturplattformen und das dynamische Auslösen von Veränderungen, wie z. B. die Erhöhung der Steifigkeit der Mikroumgebung, ermöglicht es den Forschern, Veränderungen in der extrazellulären Matrix (EZM) zu modellieren, die während des Fortschreitens der fibrotischen Erkrankung auftreten. Hierin wird ein Verfahren zum 3D-Bioprinting eines phototunbaren Hydrogel-Biomaterials vorgestellt, das in der Lage ist, zwei aufeinanderfolgende Polymerisationsreaktionen innerhalb eines Gelatineträgerbades durchzuführen. Die Technik des FRESH-Bioprintings (Freeform Reversible Embedding of Suspended Hydrogels) wurde angepasst, indem der pH-Wert des Stützbades angepasst wurde, um eine Michael-Additionsreaktion zu ermöglichen. Zunächst wurde die Biotinte, die Poly(ethylenglykol)-alphamethacrylat (PEGαMA) enthielt, außerhalb der Stöchiometrie mit einem zellabbaubaren Vernetzer umgesetzt, um weiche Hydrogele zu bilden. Diese weichen Hydrogele wurden später Photoinitator und Licht ausgesetzt, um die Homopolymerisation nicht umgesetzter Gruppen zu induzieren und das Hydrogel zu versteifen. Dieses Protokoll umfasst die Hydrogelsynthese, das 3D-Bioprinting, die Photoversteifung und die Charakterisierung von Endpunkten zur Beurteilung der Fibroblastenaktivierung in 3D-Strukturen. Die hier vorgestellte Methode ermöglicht es Forschern, eine Vielzahl von Materialien, die pH-katalysierten Polymerisationsreaktionen durchlaufen, in 3D zu drucken und könnten zur Entwicklung verschiedener Modelle der Gewebehomöostase, -krankheit und -reparatur eingesetzt werden.

Einleitung

3D-Bioprinting ist eine transformative Technologie, die es Forschern ermöglicht, Zellen und Biomaterialien präzise in 3D-Volumina abzulegen und die komplexe hierarchische Struktur biologischer Gewebe nachzubilden. In den letzten zehn Jahren haben Fortschritte im 3D-Bioprinting schlagendes menschliches Herzgewebe¹, Funktionsmodelle von Nierengewebe², Modelle des Gasaustauschs in der Lunge³ und Tumormodelle für die Krebsforschung⁴ hervorgebracht. Die Erfindung eingebetteter 3D-Bioprinting-Techniken, wie z. B. das Freeform Reversible Embedding of Suspended Hydrogel (FRESH) Bioprinting, hat es ermöglicht, komplexe Weichteilstrukturen wie Lungenblutgefäße⁵ und sogar das menschliche Herz⁶ in 3D zu reproduzieren. Der FRESH 3D-Biodruck ermöglicht den schichtweisen Druck von weichen und niedrigviskosen Biotinten durch Extrusion in ein scherverdünnendes Stützbad. Das Trägerbad besteht aus einem Material, wie z. B. dicht gepackten Gelatine-Mikropartikeln, die als Bingham-Kunststoff fungieren und die beabsichtigte Form und Struktur der Biotinte nach dem Druck beibehalten. Sobald das gedruckte Konstrukt erstarrt ist, kann das Stützbad durch Erhöhung der Temperatur auf 37 °C^{weggelöst werden 7}.

In einem kürzlich erschienenen Übersichtsartikel wurden die Materialien zusammengefasst, die in verschiedenen Publikationen mit der FRESH-Technik in 3D biogedruckt wurden. Diese natürlich gewonnenen Materialien reichen von Kollagen Typ I bis hin zu methacrylierter Hyaluronsäure und repräsentieren verschiedene Gelierungsmechanismen⁷. Die meisten Forschungsstudien, die mit dieser 3D-Bioprinting-Technik durchgeführt werden, verwenden statische Biomaterialien, die sich als Reaktion auf äußere Reize nicht verändern. Dynamische, phototunbare Hydrogel-Biomaterialien wurden von unserem Labor und anderen 8,9,10,11,12 verwendet^, um eine Vielzahl von fibrotischen Erkrankungen zu modellieren. Im Gegensatz zu statischen Biomaterialien ermöglichen phototunable Biotinten die Erstellung eines weichgezeichneten Modells mit niedrigerem Elastizitätsmodulwert und späterer Versteifung, um zelluläre Reaktionen auf eine Zunahme der Versteifung der Mikroumgebung zu untersuchen.

Fibrotische Erkrankungen sind gekennzeichnet durch eine Zunahme der Produktion der extrazellulären Matrix, die zu Narbenbildung und Versteifung führen kann¹³. Eine Versteifung des Gewebes kann weitere Verletzungen und Zerstörungen des betroffenen Gewebes auslösen, was zu dauerhaften Organschäden und sogar zum Tod führen kann. Fibrotische Erkrankungen sind weltweit für ein Drittel der Sterblichkeit verantwortlich. Fibroblasten produzieren in diesem Krankheitszustand überschüssige und abnorme extrazelluläre Matrix^14,15. Erhöhte Fibroblastenproliferation und extrazelluläre Matrixablagerung versteifen das Gewebe weiter und aktivieren eine profibrotische positive Rückkopplungsschleife^16,17,18,19. Die Untersuchung der Aktivierung von Fibroblasten ist für das Verständnis fibrotischer Erkrankungen von entscheidender Bedeutung. Hier stellen wir die humane pulmonale arterielle Hypertonie (PAH) als Beispiel für eine fibrotische Erkrankung vor, bei der es wichtig ist, die 3D-Geometrie des Blutgefäßes mittels 3D-Bioprinting nachzuahmen und die dynamischen Versteifungsfähigkeiten von phototunbaren Hydrogelen vorzustellen. PAH ist eine Erkrankung, bei der der Druck in den Hauptpulmonalarterien über das normale Niveau hinausgeht und das Herz belastet, wodurch die Aktivierung der adventitialen Fibroblasten der menschlichen Lungenarterie (HPAAF) erhöht und das Blutgefäßgewebe versteift^{wird 16,17,18,19}. Eine phototunbare Poly(ethylenglykol)-alpha-methacrylat (PEGαMA)-Biotintenformulierung ermöglicht eine zeitliche Versteifung in Konstrukten und hilft bei der Modellierung von gesundem Gewebe und dem Fortschreiten der Krankheit 5,8,9,10. Die Ausnutzung dieser einzigartigen Eigenschaft ermöglicht die Quantifizierung der HPAAF-Aktivierung und -Proliferation als Reaktion auf die Versteifung der Mikroumgebung in 3D und könnte wertvolle Einblicke in die zellulären Mechanismen liefern, die an dieser Krankheit beteiligt sind. Das hier beschriebene Protokoll wird es den Forschern ermöglichen, 3D-Modelle zu erstellen, die Veränderungen in der extrazellulären Mikroumgebung während des Fortschreitens der Krankheit oder der Gewebereparatur rekapitulieren und die Aktivierung von Fibroblasten untersuchen.

Protokoll

1. PEGαMA-Synthese und -Charakterisierung

ANMERKUNG: Die Synthese von Poly(ethylenglykol)-alphamethacrylat (PEGαMA) wurde von Hewawasam et al . übernommen und unter feuchtigkeitsfreien Bedingungen durchgeführt⁹.

1. Wiegen Sie die Reaktanten.
   HINWEIS: Wiegen Sie z. B. 5 g 10 kg/mol 8-armiges PEG-Hydroxyl (PEG-OH) und 0,38 g Natriumhydrid (NaH) ab (siehe Materialtabelle).
2. Einen Rührstab in den 250-ml-Schlenk-Kolben geben und mit Argon reinigen.
3. Das PEG-OH wird in dem niedrigsten Volumen des wasserfreien Tetrahydrofurans (THF) gelöst, das für die Auflösung im Schlenkkolben erforderlich ist.
   HINWEIS: Etwa 80 ml THF lösen 5 g PEG-OH auf. Fügen Sie die minimale Menge THF hinzu, die erforderlich ist, um das PEG-OH aufzulösen.
4. Man gibt 3-mal molaren NaH-Überschuss zur Reaktionsmischung und rührt bei Raumtemperatur (RT) 30 min.
5. 6-fach molaren Überschuss Ethyl-2-(Brommethyl)acrylat (EBrMA, siehe Materialtabelle) tropfenweise in den Schlenkkolben geben und das Reaktionsgefäß lichtgeschützt mit Aluminiumfolie abdecken. Die Reaktion wird bei Raumtemperatur für ca. 48 h gerührt.
   HINWEIS: Für 5 g PEG-OH und 0,38 g NaH verwenden Sie 3,68 ml EBrMA für diese Reaktion.
6. Fügen Sie einige Tropfen 1 N Essigsäure hinzu, um die Reaktion zu unterdrücken. Vakuumfiltrieren Sie die Lösung durch ein Filtrationshilfsmittel.
   HINWEIS: Durch die Zugabe von Essigsäure entstehen Gasblasen. Hören Sie auf, Essigsäuretropfen hinzuzufügen, wenn sich keine Blasen mehr bilden, da dies darauf hinweist, dass die Mischung erfolgreich abgeschreckt wurde.
7. Das Filtrat wird auf einem Rotationsverdampfer konzentriert und in 4 °C Diethylether ausgefällt. Niederschlag lichtgeschützt bei 4 °C 12-18 h stehen lassen.
8. Fügen Sie ein Whatman-Filterpapier zu einem Buchner-Trichter hinzu. Gießen Sie das Reaktionsgemisch langsam über das Filterpapier und trennen Sie den Niederschlag durch Vakuumabsaugung vom Diethylether. Der Niederschlag wird in einem trockenen und sauberen Filterkolben aufgefangen.
9. Trocknen Sie das Produkt mindestens 5 Stunden oder über Nacht bei Raumtemperatur und lösen Sie es in der erforderlichen Mindestmenge an deionisiertem Wasser auf. Das gelöste Produkt wird in einen Dialyseschlauch (siehe Materialtabelle) überführt und mindestens vier Tage lang gegen 3,5 l deionisiertes Wasser dialysiert. Wechseln Sie das Dialysewasser alle 12 Stunden.
   HINWEIS: Das Produkt erscheint nach der Vakuumtrocknung als vollständig trockenes, reinweißes festes Pulver.
10. Das Produkt schockgefrieren und ca. 72 h lang gefrieren, bis es vollständig getrocknet ist.
11. Das Produkt wird in Chloroform D (CDCl₃) gelöst. Führen Sie die Probe mit einer 1-Stunden-NMR mit einem Protokoll durch, das 248 Scans mit ^einerRelaxationszeit von 2,5 s durchführt.
12. Überprüfen Sie die Funktionalisierung und Reinheit des Produkts, indem Sie den_CDCl 3-Lösungsmittelpeak auf 7,26 ppm kalibrieren. Integrieren Sie den Peak für PEG-Backbone-Protonen (d3.71) und kalibrieren Sie die Integration auf 114.
13. Integrieren Sie die restlichen Peaks: PEGαMA 1 H NMR (300 MHz, CDCl 3): d (ppm) ^1,36(t, 3H, CH 3-),_3,71 (s, 114H, PEG CH 2-CH 2), 4,29 (t, s, 4H, -CH 2-C(O)-O-O, -O-CH _2-C(=CH 2)-), 5,93 (q, 1H, -C=CH 2), 6,34 (q, 1H, -C=CH ₂) und vergleichen Sie die Integration für die αMA-Alken-Endgruppen-Peaks mit dem Erwartungswert (1H) basierend auf der PEG-Backbone-Kalibrierung (Abbildung 1).
    HINWEIS: Mitteln Sie die beiden als "a" gekennzeichneten Peaks (Abbildung 1) und multiplizieren Sie sie mit 100, um den durchschnittlichen Prozentsatz der PEGαMA-Funktionalisierung zu erhalten.

Abbildung 1: Die Protonen-NMR bestätigte die erfolgreiche PEGαMA-Funktionalisierung. Die NMR-Analyse wurde in Chloroform-D (CDCl₃) durchgeführt und zeigte eine Funktionalisierung von 96,5%. PEGαMA 1 H NMR (300 MHz, CDCl3): d (ppm) ^1,36(t, 3H, CH 3-),_3,71 (s, 114H, PEG CH 2-CH 2), 4,29 (t, s, 4H, -CH 2-C(O)-O-O, -_{O-CH 2-C}(=CH 2)-), 5,93 (q, 1H, -C=CH 2), 6,34 (q, 1H, -C=CH ₂). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

2. Modelldesign und Einrichtung des 3D-Biodruckers

HINWEIS: Ein handelsüblicher 3D-Drucker (siehe Materialtabelle) wurde modifiziert, indem der thermoplastische Extruder durch einen speziell angefertigten Spritzenpumpenextruder ersetzt und von Hinton et ^al.20 übernommen wurde. Open-Source-Designs sind online verfügbar: https://3d.nih.gov/users/awfeinberg.

1. Öffnen Sie die Fusion 360-Software (siehe Materialtabelle) und erstellen Sie eine computergestützte 3D-Hohlzylinderkonstruktion.
   HINWEIS: Eine herunterladbare Datei, die für diesen Schritt verwendet werden kann und die Geometrie der Blutgefäße nachahmt, finden Sie in der Zusatzdatei 1.
2. Speichern Sie die Datei und öffnen Sie sie in der Slic3r-Software (siehe Materialtabelle). Vergewissern Sie sich, dass alle Parameter wie gewünscht sind, und drücken Sie dann die Schaltfläche zum Exportieren von G-Code. Speichern Sie den G-Code auf dem Computer.
3. Öffnen Sie die Pronterface-Software (siehe Materialtabelle) und laden Sie die G-Code-Datei hoch.
   HINWEIS: Die Pronterface-Software ist mit dem Bioprinter verbunden und bietet eine ausreichende Hardware-Eingabesteuerung. Eine brauchbare G-Code-Datei finden Sie in der Ergänzungsdatei 2.
4. Übertragen Sie den Bioprinter und alle zugehörigen Teile mit aseptischen Techniken in eine Biosicherheitswerkbank (BSC).
5. Montieren Sie eine 30 g 0,5" lange stumpfe Nadelspitze (siehe Materialtabelle) an der Druckglasspritze und legen Sie sie beiseite.
6. Stecken Sie das Netzkabel des Bioprinters in eine Steckdose. Drücken Sie den roten Netzschalter an der Vorderseite des Bioprinters, um ihn einzuschalten. Schließen Sie das USB-Kabel (Universal Serial Bus) zwischen dem Computer und dem Biodrucker an und stellen Sie sicher, dass alle Kabelverbindungen hergestellt und eingesteckt sind.

3. Vorbereitung des Stützbades und der Reagenzien

HINWEIS: Führen Sie alle Schritte in einer Biosicherheitswerkbank mit aseptischen Techniken durch.

1. Bereiten Sie ein Zellkulturmedium bestehend aus SmBM-Basalmedium (CC-3181) und SmGM-2 SingleQuots-Ergänzungen (CC-4149), ausgenommen fötales Kälberserum (FBS), gemäß den Anweisungen des Herstellers vor. Bis zur Verwendung bei 4 °C lagern.
2. Aliquotieren Sie 50 ml des Zellkulturmediums und fügen Sie 1 % v/v FBS (CC-4149) hinzu (siehe Materialtabelle), um ein Medium mit niedrigem Serumgehalt herzustellen. Bis zur Verwendung bei 4 °C lagern.
3. Resuspendieren Sie das Gelatineaufschlämmungspulver gemäß den Anweisungen des Herstellers mit sterilen Zellkulturmedien ohne FBS als Lösungsmittel (siehe Materialtabelle). Unmittelbar vor Gebrauch den endgültigen pH-Wert der Gelatineaufschlämmung mit 2 M Kaliumhydroxid (KOH) und/oder 2 M Salzsäure (HCl) auf pH 9 einstellen, um den pH-Wert der Lösung mit einem pH-Messgerät nach Bedarf anzupassen.
4. Füllen Sie die gewünschte Anzahl von Vertiefungen einer 24-Well-Platte, von denen jede etwa zur Hälfte gefüllt ist, mit 1 ml Gelatineaufschlämmung pro Well, indem Sie eine Spritze ohne Nadel verwenden.
   HINWEIS: Füllen Sie die Mitte der Vertiefungen gleichmäßig aus und vergewissern Sie sich, dass keine Lufteinschlüsse vorhanden sind. Klopfen Sie auf die Platte, um die Mikropartikelaufschlämmung gleichmäßig zu verteilen. Passen Sie die Höhe und das Volumen der Aufschlämmung pro Vertiefung nach Bedarf an, um sie an jede Bioprint-Größe und -Form anzupassen. Benutzer können eine selbstgemachte Spritze herstellen, um die Gelatineaufschlämmung in jede Vertiefung zu übertragen. Dies kann erreicht werden, indem ein richtig dimensionierter Spritzenkolben in ein 50-ml-Reagenzglas gegeben wird, das bereits die verdichtete Gelatineaufschlämmung am Boden enthält. Führen Sie beim Einsetzen des Kolbens einen kleinen Führungsdraht neben das Reagenzglas ein, damit die Luft entweichen kann, und entfernen Sie ihn dann, wenn der Kolben mit der Gelatineaufschlämmung in Kontakt kommt. Unmittelbar vor Gebrauch die Spitze des Reagenzglases mit einer Rasierklinge abschneiden, um ein Loch zu schaffen, aus dem die Gelatineaufschlämmung herausragen und auf den Kolben drücken kann.
5. Platzieren Sie die gefüllte 24-Well-Platte in der Mitte des Bioprinter-Tisches und befestigen Sie sie am Tisch.
   HINWEIS: Abbildung 2 zeigt ein generisches Bioprinter-Setup. Legen Sie ein Gummiband um den Drucktisch, um eine 24-Well-Platte an der Plattform zu befestigen und ein Verrutschen zu verhindern.

Abbildung 2: Grundlegender Aufbau des 3D-Bioprintings. Der Biodrucker wurde in einer sterilen Umgebung, wie z. B. einer Biosicherheitswerkbank, aufgestellt, und der Druckkopf wurde so montiert, dass die Glasspritze und die Nadel vertikal in den darunter liegenden Druckbereich des Stützbades abgesenkt wurden. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

4. Zellkultur

HINWEIS: Führen Sie alle Schritte in einer Biosicherheitswerkbank mit aseptischen Techniken durch.

1. HPAAF-Zellen (kommerziell erhältlich, siehe Materialtabelle) auftauen und in T-75-Gewebekultur-behandelten Kunststoffkolben expandieren, die SmBM-Basalmedium (CC-3181) und alle SmGM-2 SingleQuots-Ergänzungen (CC-4149) gemäß den Anweisungen des Herstellers enthalten (siehe Materialtabelle).
   HINWEIS: Es sollten Standard-Zellkulturprotokolle für adhärente Zellen verwendet werden, wobei die Zellen bei 37 °C und 5 % CO₂ gehalten und die Medien alle paar Tage aufgefüllt werden sollten.
2. Sobald die HPAAFs ~80-90% Konfluenz erreicht haben, saugen Sie das Medium an und spülen Sie die Zellen einmal mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS).
3. Etwa 4 ml vorgewärmtes 0,05%iges Trypsin-EDTA in jeden T-75-Kolben geben. Kippen Sie den Kolben, um sicherzustellen, dass die gesamte Zellkulturoberfläche mit 0,05%iger Trypsin-EDTA-Lösung bedeckt ist. Die Kolben 3-5 min bei 37 °C inkubieren und auf Zellablösung prüfen.
4. Sobald die Zellen schwimmen, geben Sie mindestens 6 ml Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) in jeden Kolben und überführen Sie die Zellen in ein konisches 50-ml-Röhrchen.
5. Zentrifugieren Sie die Zellsuspension bei 300 x g für 5 Minuten bei Raumtemperatur, um die Zellen zu pelletieren. Saugen Sie den Überstand aus dem Zellpellet ab und resuspendieren Sie die Zellen in 1-3 ml Medien mit FBS unter Verwendung einer 1000-μl-Pipette, um eine Einzelzellsuspension zu gewährleisten.
6. 10 μl der Zellsuspension in ein Mikrozentrifugenröhrchen überführen. Fügen Sie 10 μl Trypanblau-Lösung hinzu und mischen Sie sie gut. Verwenden Sie 10 μl dieser Mischung, um Zellen in einem Hämozytometer mit einem inversen Lichtmikroskop zu zählen.
   HINWEIS: Um eine Endkonzentration von 4 x 10⁶ Zellen/ml Biotinte zu erreichen, wurden 800.000 Fibroblasten pro 200 μl Biotinte beiseite gelegt.

5. Herstellung von Hydrogel-Biotinte

ANMERKUNG: Die Biotintenpräparation wurde von Davis-Hall et ^al.5 übernommen. Die Schritte 5.1 bis 5.2 können parallel zu den Schritten 4.1 bis 4.3 ausgeführt werden, um die Zeit zwischen der Zellentnahme und der Resuspension in der Biotinte zu minimieren. Führen Sie Schritte in einer Biosicherheitswerkbank mit einer aseptischen Technik durch.

1. Bereiten Sie eine 20 mM Tris(2-carboxyethyl)phosphin-Lösung (TCEP, siehe Materialtabelle) pH 7 und einen Sterilfilter mit einem 0,2 μm Spritzenvorsatzfilter vor. Unmittelbar vor der Anwendung 2 M KOH und/oder 2 M HCl hinzufügen, um den pH-Wert der Lösung nach Bedarf anzupassen. Mit dem pH-Messgerät messen und entsprechend anpassen.
   HINWEIS: TCEP reduziert Disulfidbrücken.
2. Herstellen einer 0,25 mg/ml-Stammlösung von PEGαMA, resuspendiert in sterilen Zellkulturmedien ohne FBS, 250 mM Stammlösungen von 1,4-Dithiothreitol (DTT), MMP2-abbaubarem Vernetzer und CGRGDS (RGD)-Peptid (siehe Materialtabelle), Resuspendierung in 20 mM sterilem TCEP und einer 15 Gew.-%igen Stammlösung von Polyethylenoxid (PEO) in destilliertem (DI) Wasser mit Pipetten nach Bedarf.
3. Kombinieren Sie anhand von Tabelle 1 die jeweils benötigten Mengen an PEGαMA, DTT, MMP2-abbaubarem Vernetzer, PEO, CGRGDS und Zellkulturmedien mit niedrigem Serum zusammen mit den Fibroblasten in einem konischen 50-ml-Röhrchen.
   HINWEIS: Es wird empfohlen, den pH-Wert mit pH-Streifen zu überprüfen, nachdem alle außer den Zellkulturmedien hinzugefügt wurden, da diese Kombination dazu führen sollte, dass der pH-Wert sehr nahe bei 6,2 liegt. Wenn weitere pH-Einstellungen erforderlich sind, achten Sie darauf, wie viel zusätzliches Volumen benötigt wird, um den pH-Wert der Vorläuferlösung anzupassen. Erhöhen Sie das Gesamtvolumen auf 200 μl, indem Sie das verbleibende Volumen des Zellkulturmediums abzüglich des bei der letzten pH-Einstellung hinzugefügten Volumens hinzufügen.
4. Mischen Sie die Biotinte mit einer Verdrängungspipette, um sicherzustellen, dass es sich bei den Zellen um Einzelzellen handelt, und vergewissern Sie sich, dass die endgültige Vorläuferlösung einen pH-Wert von 6,2 hat, um eine basenkatalysierte Polymerisation während des 3D-Biodrucks zu verhindern.
5. Füllen Sie die Biotinte in die Glasspritze, indem Sie den Kolben entfernen und eine separate Spritze mit einer 15-Gauge-Nadelspitze mit einer Länge von 1,5 Zoll (siehe Materialtabelle) verwenden, um die Biotinte aus dem Zentrifugenröhrchen in die Spritze zu übertragen, wobei Sie darauf achten müssen, dass sich keine Luftblasen in der Lösung bilden.
6. Platzieren Sie die Glasspritze im Druckkopf und befestigen Sie Druckkopfkomponenten, damit alles fest montiert und druckfertig ist.
   HINWEIS: Zu diesem Zeitpunkt sollte an der Glasspritze im Druckkopf eine stumpfe 30-Gauge-Nadelspitze mit einer Länge von 0,5 Zoll zum Drucken angebracht sein.

   

Bestandteil	Konzentration von Stammlösungen	Hinzuzufügender Betrag
PEGαMA	0,25 mg/ml	140 μl
DVB-T	250 mM	12,24 μl
MMP2 abbaubarer Vernetzer	250 mM	5,25 μl
RGD	250 mM	1,6 μl
PEO	15 Gew.-%	33,33 μl
Aktivierungsmedien und/oder Reagenzien zur pH-Einstellung	-	7,58 μl
Fibroblasten	-	800000 Zellen

Tabelle 1: Beispielvolumina, die für die Herstellung von 200 μl Biotinte (Hydrogel-Vorläuferlösung und Fibroblastenzellen) erforderlich sind.

6.3D Bioprinting

HINWEIS: Führen Sie alle Schritte in einer Biosicherheitswerkbank mit aseptischen Techniken durch.

1. Passen Sie mithilfe der Richtungspfeile in der Pronterface-Software die Position der Extrusionsnadel in der Mitte eines Wells und innerhalb der Stützbadaufschlämmung manuell an. Lassen Sie mindestens 1 mm Stützbadbrei unterhalb der Nadelspitze stehen.
   HINWEIS: Die Software ist nicht in der Lage, zu erkennen, wo sich die Nadel im Raum befindet. Es liegt ganz im Ermessen des Benutzers, die Nadel zu bewegen, indem er manuell auf die Pfeile in der Software klickt (z. B. wird die Nadel durch Klicken auf den Pfeil nach oben oder von der Druckplattform weg bewegt usw.). Manövrieren Sie die Nadel vorsichtig, um sicherzustellen, dass sie keine Grenzen des Brunnens trifft.
2. Sobald sich die Nadelspitze in der Mitte der Aufschlämmung innerhalb der Vertiefung befindet, drücken Sie den Startknopf in der Vorlauffläche und warten Sie, bis der Druck abgeschlossen ist, um Konstrukte zu erhalten, wie in Abbildung 3A gezeigt.
   HINWEIS: Der Biodruck eines Konstrukts mit der bereitgestellten Datei (Ergänzungsdatei 1) dauert ca. 3 Minuten. Es dauert ca. 5 Minuten, um die Nadel auszurichten und zu bewegen und dann ein Konstrukt von Anfang bis Ende vollständig zu drucken.
3. Wiederholen Sie die Schritte 6.1 bis 6.2, bis die gewünschte Anzahl biogedruckter Konstrukte erreicht ist.
   HINWEIS: Es wird empfohlen, mehr Konstrukte als nötig zu erstellen, um fehlgeschlagene Drucke zu berücksichtigen. Wenn ein Fehler auftritt, wechseln Sie zur nächsten Vertiefung, setzen Sie alles zurück, und wiederholen Sie die Schritte 6.1 bis 6.2 erneut.
4. Lassen Sie die Well-Platte bei Raumtemperatur und decken Sie sie nach Beendigung des Drucks 1 Stunde lang in der BSC ab, um eine basenkatalysierte Polymerisation des phototunbaren Hydrogels zu ermöglichen.
5. Legen Sie die Well-Platte mit den 3D-biogedruckten Konstrukten in einen sterilen Inkubator bei 37 °C und lassen Sie sie 12-18 Stunden lang die Stützbadaufschlämmung schmelzen.

Abbildung 3: Experimentelles Schema. Dieses Protokoll wurde in drei Hauptschritten beschrieben: (A) 3D-Bioprinting von PEGαMA-Hohlröhrchen mit eingebetteten Zellen, um das Lungengefäßsystem nachzuahmen. (B) Photoinitiierung der Homopolymerisationsreaktion zur Versteifung der zellulären Mikroumgebung. (C) Bewertung zellulärer Marker für Proliferation und Aktivierung. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

7. .3D biogedruckte Konstruktkultur und Photoversteifung

HINWEIS: Alle Schritte sollten in einer Biosicherheitswerkbank mit aseptischen Techniken durchgeführt werden.

1. 2,2 mM Lithiumphenyl-2,4,6-trimethylbenzoylphosphinat (LAP) Stammlösung (siehe Materialtabelle) in PBS und sterilem Filter mit einem 0,2 μm Spritzenvorsatzfilter herstellen. Bewahren Sie die LAP-Lösung lichtgeschützt auf.
2. Wechseln Sie nach 12-18 h das Medium, das die biogedruckten Konstrukte umgibt. Entfernen Sie das Medium und das Trägerbad der geschmolzenen Gelatine manuell in den Vertiefungen und achten Sie darauf, die biogedruckten Konstrukte nicht zu stören.
   HINWEIS: Es ist hilfreich, das Medium langsam zu entfernen, während die Platte in einem 45°-Winkel gehalten wird, damit die Konstrukte innerhalb der Vertiefung austreten und gesehen werden können. Ein durchsichtiger Hydrogelzylinder sollte in jeder Vertiefung mit erfolgreichem Druck erkennbar sein (Abbildung 4A).
3. Geben Sie ein angemessenes Volumen an Medien mit niedrigem Serumgehalt in jede Vertiefung.
   HINWEIS: Bei einer 24-Well-Platte sollten 700 μl Medien pro Well die biogedruckten Konstrukte vollständig abdecken. Passen Sie die Einstellungen nach Bedarf an.
4. Legen Sie die Platte wieder in den Inkubator und wechseln Sie die Medien auf den Proben alle 3 Tage oder in Übereinstimmung mit dem Versuchsplan.
5. Vierundzwanzig Stunden vor dem gewünschten Versteifungszeitpunkt entfernen Sie Medien aus den Proben und ersetzen Sie sie durch Medien mit niedrigem Serumgehalt, die mit 2,2 mM sterilem LAP ergänzt werden.
   ANMERKUNG: Um die Struktur fluoreszierend zu markieren, werden 3D-biogedruckte Konstrukte in PBS, ergänzt mit 10 μM Methacryloxyethylthiocarbamoylrhodamin B (siehe Table of Materials), über Nacht aufgequollen und dann wie in Schritt 7.6 beschrieben versteift, um die Struktur fluoreszierend zu markieren. 2 Tage lang bei 4 °C in PBS umfüllen, um überschüssiges Rhodamin zu entfernen und mit einem TRITC-Filter abzubilden (Abbildung 4B,C).
6. Entnehmen Sie zum gewünschten Versteifungszeitpunkt die Hälfte des Mediums aus den zu versteifenden Vertiefungen und legen Sie die Platte mit abgenommenem Deckel unter UV-Licht. Schalten Sie das UV-Licht ein und versteifen Sie diese Konstrukte, indem Sie 5 Minuten lang 10 mW/cm² 365-nm-Licht mit Omnicure (siehe Materialtabelle) und einem 365-nm-Bandpassfilter (Abbildung 3B) auftragen.
   HINWEIS: Verwenden Sie das Radiometer/Photometer, um zu überprüfen, ob die Lichtintensität korrekt ist, bevor Sie die Zellen UV-Licht aussetzen.
7. Entfernen Sie das verbleibende Medium aus diesen Vertiefungen und geben Sie frisches Medium mit niedrigem Serumgehalt in jede Vertiefung. Legen Sie die Platte wieder in den Inkubator.
8. Nehmen Sie die Platte aus dem Inkubator und führen Sie die Fibroblastenaktivierungsstudie zum gewünschten Zeitpunkt nach Schritt 9 durch.

Abbildung 4: 3D-biogedruckte Hydrogelstrukturen unterstützten die Lebensfähigkeit der Zellen im Laufe der Zeit. (A) Foto einer 3D-gedruckten Hydrogelstruktur in einer 24-Well-Platte. (B) Projektion mit maximaler Intensität von fluoreszenzmarkiertem PEGαMA 3D-gedrucktem Hydrogel. Maßstabsleiste = 1 mm. Die Mikroskopie mit höherer Vergrößerung zeigte Poren innerhalb der Hydrogelstruktur, die durch Gelatine-Mikropartikel im FRESH-Bioprinting-Trägerbad induziert wurden. (C) 3D-gedruckte PEGαMA-Röhren mit fluoreszenzmarkierten versteiften Bereichen, die auf einem konfokalen Mikroskop (100 μm Z-Stapel als Projektion mit maximaler Intensität) aufgenommen wurden, zeigten eine räumliche Kontrolle über die Versteifung in 3D. Maßstabsbalken = 500 μm. (D) HPAAF-Viabilität in 3D-biogedruckten Konstrukten, gemessen mit Lebend-/Tot-Assays. Konstrukte mit einer Dicke von 300 μm und 4 × 10⁶ Zellen/ml übertrafen alle anderen Bedingungen zu jedem Zeitpunkt. Die Lebensfähigkeit erreichte am 7. Tag ihren Höhepunkt. Diese Bedingung und dieser Zeitpunkt wurden für zukünftige Experimente ausgewählt. Die Spalten zeigen den Mittelwert ± SEM, n = 3. *, p < 0,05, ANOVA, Tukey HSD. (E) Repräsentative konfokale Bilder von Zellen in 3D-Konstrukten, die mit Lebend-/Totreagenz gefärbt wurden, an Tag 7, dem Zeitpunkt mit der größten Gesamtlebensfähigkeit. Calcein AM markierte lebende Zellen in grün und Propidiumiodid markierte tote Zellen in rot. Die Spalte ganz rechts zeigt, dass die leistungsstärkste Bedingung eine gleichmäßige Zellverteilung und einen hohen Prozentsatz an lebenden Zellen aufwies. Maßstabsleiste = 500 μm. Nachdruck mit freundlicher Genehmigung von Davis-Hall et ^al.5. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

8. Die Bewertung der Lebensfähigkeit von Fibroblasten

1. Zu den gewünschten Zeitpunkten der Lebensfähigkeit mit Calcein AM und Propidiumiodid färben (siehe Materialtabelle).
   HINWEIS: Zusammenfassend lässt sich sagen, dass Medien aus jeder Vertiefung entfernt und die Konstrukte mit sterilem PBS gespült werden sollten. Inkubieren Sie die Konstrukte in einer Lebend-/Totfärbelösung für 40 Minuten bei 37 °C auf einer Wippe. Die Färbelösung sollte Calcein AM (1:1000 Verdünnung) und Propidiumiodid (1:1000 Verdünnung) enthalten, um lebende oder tote Zellen bei der Bildgebung zu identifizieren.
2. Übertragen Sie die Konstrukte in ein steriles PBS und bilden Sie sie sofort auf einem konfokalen Fluoreszenzmikroskop ab. Erfassen Sie drei verschiedene 100-μm-Z-Stapelbilder pro Probe und Zeitpunkt und drücken Sie die Lebensfähigkeit als durchschnittlichen Prozentsatz lebender Zellen aus (Abbildung 4D,E).

9. Die Bewertung der Fibroblastenaktivierung

1. Bereiten Sie 3 % w/v Rinderserumalbumin (BSA) und 0,1 % v/v Tween 20 in PBS vor. Diese Lösung wird als Immunfluoreszenzlösung (IF) bezeichnet.
2. Entfernen Sie zu den gewünschten Zeitpunkten Medien aus den Probenvertiefungen und spülen Sie die Konstrukte mit PBS. Ersetzen Sie das PBS durch 4 % Paraformaldehyd (PFA) und bewahren Sie diese Proben 30 Minuten lang bei 37 °C auf einer Wippe auf. Ersetzen Sie dann die 4%ige PFA durch 100 mM Glycin in PBS und lassen Sie diese Proben weitere 15 Minuten bei Raumtemperatur (RT) auf einer Wippe.
3. Als nächstes werden diese Proben in Tissue-Tek Kryoformen überführt, die Probe vollständig mit der Lösung der optimalen Schneidtemperatur (OCT) bedeckt (siehe Materialtabelle) und die OCT 12-18 h bei 4 °C in die Proben diffundieren lassen.
4. Die OCT-getränkten Proben werden mit flüssigem Stickstoff in 2-Methylbutan schockgefroren. Füllen Sie eine Styroporbox oder einen anderen geeigneten Behälter mit flüssigem Stickstoff und stellen Sie dann einen zweiten mit 2-Methylbutan gefüllten Behälter in den flüssigen Stickstoff, so dass er mindestens zur Hälfte untergetaucht ist. Halten Sie jedes Kryomol, das eine OCT-bedeckte Probe enthält, mit einer Pinzette in flüssigem stickstoffgekühltem 2-Methylbutan fest, bis es sichtbar gefroren ist. Diese Proben können bei -80 °C gelagert werden, bis sie für die Kryosektion bereit sind.
   VORSICHT: Persönliche Schutzausrüstung (PSA) wie Kälteschutzhandschuhe, eine Kälteschutzschürze und ein Gesichtsschutzschild, die im kryogenen Sicherheitskit enthalten sind (siehe Materialtabelle), sollten beim Umgang mit flüssigem Stickstoff verwendet werden.
5. Kryosektion der eingefrorenen OCT-Proben bei -22 °C und Befestigen von 10 μm dicken Scheiben auf positiv geladenen Objektträgern. Bereiten Sie drei Objektträger mit mindestens 3-5 Kryoschnitten pro Objektträger für jede 3D-Hydrogelprobe vor.
   HINWEIS: Die Objektträger können an dieser Stelle bei Bedarf bei -80 °C gelagert werden.
6. Fixieren Sie die Kryoschnitte 15 Minuten lang in eiskaltem Aceton, damit die Kryoschnitte an den Objektträgern haften. Spülen Sie die Kryoschnitte vorsichtig mit RT-Wasser ab, um das verbleibende OCT zu entfernen. Lassen Sie diese Proben trocknen und skizzieren Sie die Kryoschnitte mit einem hydrophoben Stift (siehe Materialtabelle).
7. Permeabilisieren Sie die Proben bei Raumtemperatur mit 0,2 % v/v Triton X-100 in PBS für 10 min und blockieren Sie dann die Abschnitte mit 5 % BSA w/v in PBS für 1 h bei RT.
8. Geben Sie den primären Maus-Anti-Human-Alpha-Glattmuskel-Aktin-Antikörper (αSMA) (1:250-Verdünnung) (siehe Materialtabelle) in die IF-Lösung. Lagern Sie diese geschnittenen Proben mit dem Primärantikörper über Nacht bei 4 °C. Spülen Sie die Proben 3x mit IF-Lösung.
9. Inkubieren Sie die Abschnitte in IF-Lösung, die den sekundären Ziegen-Anti-Maus-Antikörper Alexa Fluor 555 (1:250-Verdünnung) und zwei Tropfen ActinGreen 488 ReadyProbe (siehe Materialtabelle) pro Milliliter IF-Lösung enthält. Decken Sie die Proben für alle weiteren Schritte mit Aluminiumfolie ab, um sie vor Licht zu schützen, und lassen Sie die sekundäre Antikörperlösung 1 h lang bei RT auf den Proben verbleiben.
10. Spülen Sie die Abschnitte 3x mit IF-Lösung ab. Inkubieren Sie sie in 300 nM 4',6-Diamidino-2-phylindol (DAPI) in DI-Wasser für 15 min bei RT. Führen Sie eine letzte Spülung der Abschnitte 3x mit DI-Wasser durch.
11. Verwenden Sie 10 μl eines handelsüblichen Antifade-Reagenzes (siehe Materialtabelle), decken Sie die Abschnitte mit Standardmethoden ab.
    HINWEIS: Die eingefassten Objektträger können lichtgeschützt in einem Gefrierschrank bei -80 °C gelagert werden, bis sie für die Bildgebung benötigt werden.
12. Bilden Sie die Kryoschnitte mit einem Fluoreszenzmikroskop ab (Abbildung 3C und Abbildung 5B). Bilden Sie drei zufällige Abschnitte pro Dia mit einem 10-fach-Objektiv ab.
    HINWEIS: Die Bilder sollten in den DAPI-, FITC- und TRITC-Kanälen aufgenommen werden.
13. Laden Sie die Bilder in ImageJ (NIH) hoch. Quantifizieren Sie den Prozentsatz der αSMA-positiven Zellen als Maß für die Fibroblastenaktivierung (Abbildung 5A), indem Sie die Gesamtzahl der αSMA-positiven Zellen durch die Gesamtzahl der Zellkerne für jedes Sichtfeld dividieren.

Abbildung 5: Fibroblastenaktivierung in 3D-biogedruckten Modellen der pulmonal-arteriellen Adventitia . (A) Fibrotische Aktivierung in weichen und versteiften 3D-Hydrogelen, gemessen durch αSMA-Expression. HPAAFs in versteiften Konstrukten waren signifikant positiver für αSMA als Zellen in weichen Konstrukten. Die Spalten stellen den Mittelwert ± SEM dar, n = 3. *, S . < 0,05, Mann-Whitney-U-Test. (B) Repräsentative konfokale Bilder der Immunfärbung für αSMA, Aktin und DAPI in weichen und versteiften 3D-Hydrogelen. HPAAFs in versteiften Konstrukten zeigten eine häufigere αSMA-Immunfluoreszenz als Zellen in weichen Konstrukten. Maßstabsbalken = 250 μm. (C) Fibroblastenproliferation in weichen und versteiften biogedruckten 3D-Konstrukten, gemessen durch EdU-Positivität. HPAAFs in versteiften Konstrukten waren signifikant positiver für EdU als Zellen in weichen Konstrukten. Die Spalten stellen den Mittelwert ± SEM dar, n = 3. *, S . < 0,05, Mann-Whitney-U-Test. (D) Repräsentative konfokale Bilder der Immunfärbung für EdU- und Hoechst-Farbstoff in weichen und versteiften 3D-Hydrogelen. HPAAFs in versteiften Konstrukten zeigten eine häufigere EdU-Immunfluoreszenz als Zellen in weichen Konstrukten. Maßstabsbalken = 300 μm. Nachdruck mit freundlicher Genehmigung von Davis-Hall et ^al.5. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

10. Die Bewertung der Fibroblastenproliferation

1. Vierundzwanzig Stunden vor einem gewünschten Proliferationszeitpunkt werden die Zellkulturmedien aus jeder Vertiefung entnommen und durch Medien mit niedrigem Serumgehalt ersetzt, die mit einer 10-μM-EdU-Lösung aus dem im Handel erhältlichen Zellproliferationskit ergänzt werden (siehe Materialtabelle). Geben Sie die Proben zur Inkubation über Nacht in den Inkubator zurück.
2. Zum gewünschten Proliferationszeitpunkt werden die mit EdU inkubierten Proben unter Verwendung von 4 % PFA bei 37 °C für 30 Minuten auf einem Wippen fixiert. Ersetzen Sie die 4%ige PFA-Lösung durch 100 mM Glycin in PBS und inkubieren Sie die Proben bei 37 °C für mindestens 15 Minuten. Geben Sie den Hoechst in geeigneter Konzentration für 30 min hinzu und spülen Sie die Konstrukte dann 2x mit PBS.
   HINWEIS: Die Proben können bis zur Bildgebung lichtgeschützt bei 4 °C gelagert werden.
3. Bilden Sie alle fixierten und gelagerten EdU-Proben mit einem Fluoreszenzmikroskop ab und schlagen Sie die Einstellungen und Filter des Herstellers des Zellproliferationskits vor (Abbildung 3C und Abbildung 5D). Erfassen Sie drei verschiedene 100-μm-Z-Stack-Bilder pro Probe und erstellen Sie maximale Projektionen aus jedem dieser Z-Stacks. Messen Sie die HPAAF-Proliferation, indem Sie die Anzahl der EdU-positiven Zellen zählen und durch die Gesamtzahl der Zellen dividieren, die durch die Hoechst-Gegenfärbung in den maximalen Projektionsbildern identifiziert wurden (Abbildung 5C).

Ergebnisse

Dieses Protokoll beschreibt, wie phototunbare Hydrogele in einem Trägerbad in 3D biogedruckt werden, um Konstrukte zu erstellen, die in der Lage sind, dynamisch und zeitlich versteift zu werden, um die Fibroblastenaktivierung in Geometrien zu untersuchen, die menschliches Gewebe nachahmen. Zunächst erklärte das Protokoll, wie PEGαMA, das Rückgrat dieses photoabstimmbaren Polymersystems, synthetisiert wird. Kernspinresonanzspektroskopie-Messungen (NMR) zeigten eine erfolgreiche PEGαMA-Funktionalisierung bei 96,5 % (...

Diskussion

Zweistufige Polymerisationsreaktionen als Reaktion auf kontrollierte Lichtexposition können Biomaterialien räumlich und zeitlich kontrollierend versteifen. Mehrere Studien haben diese Technik genutzt, um Zell-Matrix-Interaktionen auf verschiedenen Plattformen zu bewerten 5,8,9,10,11,21,22,23.

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
AccuMax Radiometer/Photometer Kit	Spectronics Corporation	XPR-3000	To measure light intensity, used for photostiffening
Acetic Acid	Fisher Scientific	BP2401-500	Used during PEGaMA synthesis
Acetone	Fisher Scientific	A184	Used with the cryosections
ActinGreen 488 ReadyProbes	Fisher Scientific	R37110	Used for staining
Aluminum Foil	Reynolds	F28028
Anhydrous Tetrahydrofuran (THF)	Sigma-Aldrich	401757-1L	Used during PEGaMA synthesis
Argon Compressed Gas	Airgas	AR R300	Used during PEGaMA synthesis
8 Arm Poly(ethylene glycol)-hydroxyl (PEG-OH)	JenKem Technology	8ARM-PEG-10K	Used during PEGaMA synthesis
365 nm Bandpass Filter	Edmund Optics	65-191	Used for photostiffening
Bovine Serum Albumin (BSA)	Fisher Scientific	BP9700-100	Used during staining process
Buchner Funnel	Quark Glass	QFN-8-14	Used during PEGaMA synthesis
Calcein AM	Invitrogen	65-0853-39	Used during staining process
Celite 545 (Filtration Aid)	EMD Millipore	CX0574-1	Used during PEGaMA synthesis
Charged Microscope Slides	Globe Scientific	1358W
Chloroform-d	Sigma-Aldrich	151823-10X0.75ML	Used to characterize PEGaMA
Click-iT Plus EdU Cell Proliferation Kit	Invitrogen	C10637	Used for staining
50 mL Conical Tubes	CELLTREAT	667050B
Cryogenic Safety Kit	Cole-Parmer	EW-25000-85
Cryostat	Leica	CM 1850-3-1
Dialysis Tubing	Repligen	132105
4’,6-Diamidino-2-Phylindole (DAPI)	Sigma-Aldrich	D9542-1MG	Used for staining
Diethyl Ether	Fisher Scientific	E1384	Used during PEGaMA synthesis
1,4-Dithiothreitol (DTT)	Sigma-Aldrich	10197777001	Bioink component
Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM)	Cytiva	SH30271.FS
Filter Paper	Whatman	1001-090	Used during PEGaMA synthesis
Freezone 2.5L Freeze Dry System	Labconco	LA-2.5LR	Lyophilizer
Fusion 360	Autodesk	N/A	Software download
2.5 mL Gastight Syringe	Hamilton	81420	Used for bioprinting
15 Gauge 1.5" IT Series Tip	Jensen Global	JG15-1.5X	Used for bioprinting
30 Gauge 0.5" HP Series Tip	Jensen Global	JG30-0.5HPX	Used for bioprinting
Goat Anti-Mouse Alexa Fluor 555 Antibody	Fisher Scientific	A21422	Used for staining
Glycine	Fisher Scientific	C2H5NO2	Used during staining process
Hemocytometer	Fisher Scientific	1461
Hoechst	Thermo Scientific	62249	Used during staining process
Human Pulmonary Artery Adventitial Fibroblasts (HPAAFs)	AcceGen	ABC-TC3773	From a 2-year-old male patient
Hydrochloric Acid (HCl)	Fisher Scientific	A144-500	Used to pH adjust solutions
ImageJ	National Institutes of Health (NIH)	N/A	Free software download
ImmEdge® Pen	Vector Laboratories	H-4000	Used during staining process
Incubator	VWR	VWR51014991
LifeSupport Gelatin Microparticle Slurry (Gelatin Slurry)	Advanced Biomatrix	5244-10GM	Used for bioprinting
Light Microscope	Olympus	CKX53	Inverted light microscope
Lithium Phenyl-2,4,6-Trimethylbenzoylphosphinate (LAP)	Sigma-Aldrich	900889-5G	Photoinitiator used for photostiffening
Liquid Nitrogen	N/A	N/A
LulzBot Mini 2	LulzBot	N/A	Bioprinter adapted
Methacryloxyethyl Thiocarbamoyl Rhodamine B	Polysciences Inc.	669775-30-8
2-Methylbutane	Sigma-Aldrich	M32631-4L
Microman Capillary Pistons CP1000	VWR	76178-166	Positive displacement pipette tips
MMP2 Degradable Crosslinker (KCGGPQGIWGQGCK)	GL Biochem	N/A	Bioink component
Mouse Anti-Human αSMA Monoclonal Antibody	Fisher Scientific	MA5-11547	Used for staining
OmniCure Series 2000	Lumen Dynamics	S2000-XLA	UV light source used for photostiffening
Paraformaldehyde (PFA)	Electron Microscopy Sciences	15710	Used to fix samples
pH Meter	Mettler Toledo	FP20
pH Strips	Cytiva	10362010
Phosphate Buffered Saline (PBS)	Hyclone Laboratories, Inc.	Cytiva SH30256.FS
Pipette Set	Fisher Scientific	14-388-100
10 µL Pipette Tips	USA Scientific	1120-3710
20 µL Pipette Tips	USA Scientific	1183-1510
200 µL Pipette Tips	USA Scientific	1111-0700
1000 µL Pipette Tips	USA Scientific	1111-2721
Poly(Ethylene Glycol)-Alpha Methacrylate (PEGαMA)	N/A	N/A	Refer to manuscript for synthesis steps
Poly(Ethylene Oxide) (PEO)	Sigma-Aldrich	372773-250G	Bioink component
Positive Displacement Pipette	Fisher Scientific	FD10004G	100-1000 µL
Potassium Hydroxide (KOH)	Sigma-Aldrich	221473-500G	Used to pH adjust solutions
ProLong Gold Antifade Reagent	Invitrogen	P36930	Used during staining process
Pronterface	All3DP	N/A	Software download
Propidium Iodide	Sigma-Aldrich	P4864-10ML	Used for staining
RGD Peptide (CGRGDS)	GL Biochem	N/A	Bioink component
Rocker	VWR	10127-876
Rotary Evaporator	Thomas Scientific	11100V2022	Used during PEGaMA synthesis
Rubber Band	Staples	808659
Schlenk Flask	Kemtech America	F902450	Used during PEGaMA synthesis
Slic3r	Slic3r	N/A	Software download
Smooth Muscle Cell Growth Medium-2 (SmGM-2) BulletKit	Lonza	CC-3182	Kit contains CC-3181 and CC-4149 components
Sodium Hydride	Sigma-Aldrich	223441-50G	Used during PEGaMA synthesis
Sorvall ST 40R Centrifuge	Fisher Scientific	75-004-525
Stir Bar	VWR	58948-091
Syringe Filter	VWR	28145-483	Used to sterile filter solutions
T-75 Tissue-Cultured Treated Flask	VWR	82050-856	Used for cell culture work
Tissue-Tek Cyromold	Sakura	4557
Tissue-Tek O.C.T Compound (OCT)	Sakura	4583
Tris(2-Carboxyethyl) Phosphine (TCEP)	Sigma-Aldrich	C4706-2G
Triton X-100	Fisher Bioreagents	C34H622O11	Used during staining process
Trypan Blue	Sigma-Aldrich	T8154-20ML	Used for cell culture work
0.05% Trypsin-EDTA	Gibco	25-300-062	Used for cell culture work
Tween 20	Fisher Bioreagents	C58H114O26	Used during staining process
Upright Microscope	Olympus	BX63F	Fluorescent microscope capabilities
Water Bath	PolyScience	WBE20A11B
24-Well Tissue Culture Plates	Corning	3527