Die Autoren danken Andrea Axtell, Satoshi Itoh, MD, Jeff Velotta, MD, Grant Hoyt, Robert C. Robbins, MD, Jin Yu, MD, Tim Doyle, PhD, und die Stanford Small Animal Imaging Core für die technische Unterstützung. Die Autoren danken AM Bickford, Inc. für die Unterstützung der tierärztlichen Einrichtungen. Diese Arbeit wurde durch Forschungsstipendien der National Institutes of Health (R01 HL-75774, R01 CA098303, R21 HL085743, 1K12 HL087746), der California Tobacco Related Disease Research Program der University of California (15IT-0257 und 1514RT-0169) unterstützt und das California Institute for Regenerative Medicine (RS1-00183). NH wird durch ein Stipendium der American Heart Association unterstützt.

1. Induktion von Einseitige Hinterlauf Ischämie <ol><li> Die chirurgische Instrumente für diese Operation erforderlich sind: feine spitzen Pinzette, spitzen Pinzette, Schere Frühjahr, chirurgische Scheren, Nadelhalter und Haken. Wir machen unsere eigene Retraktor mit einer Büroklammer, da es kleiner als handelsübliche Haken ist. Sterilisieren diese Tools vor der Operation durch ein Autoklav oder ein Hot-Bead-Sterilisator. Ein Kauter Werkzeug und sterile feinen spitzen Wattestäbchen wird auch für diese Operation erforderlich sein. Es wird empfohlen, dass die Werkzeuge an den Spitzen als während des Verfahrens benötigt erneut sterilisiert werden. </li><li> Wenn die Werkzeuge bereit sind, platzieren Sie den Mauszeiger in die Narkose Kammer mit 1-3% Isofluran in 100% Sauerstoff bei einer Durchflussrate von 1l/min. </li><li> Lassen Sie die Maus in die Induktion Kammer, bis es reagiert auf äußere Reize ist. Dann entfernen Sie das Tier von der Induktion Kammer. Es wird empfohlen, das Narkosemittel aus dem Karton vor bündig mit der Deckelöffnung, zur Verringerung der Exposition zu Isofluran zu verringern. </li><li> Dann legen Sie das Tier in Rückenlage auf den pre-OP-Tisch und verbinden Sie es mit einem kontinuierlichen Fluss von Isofluran. Mit einem elektrischen Rasierer, entfernen Sie die Haare aus dem hinteren Gliedmaßen. Bewerben Enthaarungscreme gründlich zu entfernen Haare. </li><li> Platzieren Sie die Maus in Rückenlage über einen drapiert Heizkissen auf dem OP-Tisch, und verbinden Sie es mit einem kontinuierlichen Fluss von Isofluran. Erweitern und sichere das Hinterbein mit einem Stück Klebeband. Sobald das Hinterbein ist sicher, wischen Sie die Haut mit drei wechselnden betadine und Alkohol scheuert. Für den Rest des chirurgischen Eingriffs, verwenden Sie einen Dissektionsmikroskop bei 10X oder 20X Vergrößerung, um eine vergrößerte Ansicht der Hinterlauf Region zu erhalten. </li><li> Mit feinen Pinzetten und chirurgische Schere, einen Einschnitt der Haut, ca. 1 cm lang, vom Knie zum medialen Oberschenkel. </li><li> Mit Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung (PBS)-befeuchteten feinen spitzen Wattestäbchen vorsichtig wegzuwischen subkutane Fettgewebe um die Oberschenkelmuskulatur. </li><li> Next gelten die Brenneisen quer zur incise und sezieren durch das subkutane Fettgewebe die zugrunde liegenden Oberschenkelarterie offenbaren. </li><li> Verwenden Sie einen Haken, um die Wunde zu öffnen und einen besseren Blick auf die untere Extremität Gefäßsystem zu erhalten. </li><li> Mit feinen Zange und einem feinen zeigte Wattestäbchen vorsichtig durchstoßen die membranöse femoral Mantel der neurovaskulären Bündel freizulegen. </li><li> Dann mit einem sauberen Satz von feinen Pinzette und Wattestäbchen, sezieren und trennen Sie die Femoralarterie aus der V. femoralis und Nerven am proximalen Lage in der Nähe der Leiste. Nach der Präparation, übergeben Sie einen Strang von 7-0 Seidenfaden unter dem proximalen Ende der Femoralarterie. Verschließen den proximalen A. femoralis mit doppelseitigem Knoten. Legen Sie die Krawatte auf dem Schiff als proximal in die Wunde wie möglich, um Länge für die zweite Krawatte und eine dazwischen liegende Segment, das durchtrennt werden zu lassen. </li><li> Trennen Sie die Femoralarterie aus der V. femoralis am distalen Lage in der Nähe des Knies. Pass ein Strang von 7-0 Naht unterhalb des distalen Endes der Femoralarterie proximal der A. poplitea. Verschließen das Gefäß mit doppelten Knoten. </li><li> Verschließen distalen A. femoralis mit einem zweiten Satz der doppelten Knoten genau proximal der erste Satz von Knoten. Dieser zweite Satz der Nähte wird zum Greifen der Arterie während der Transaktion Verfahren verwendet werden. </li><li> Auch zum Greifen Zwecke, verschließen den proximalen A. femoralis mit einem zweiten Satz der doppelten Knoten unmittelbar distal der erste Satz von Knoten. </li><li> Transect Segment der Femoralarterie zwischen den distalen und proximalen Knoten mit einer feinen spitzen Wattestäbchen und ein Paar Frühling Schere. Seien Sie vorsichtig, nicht zu durchbohren die Vena femoralis Wand. </li><li> Entfernen Sie den Haken und schließen Sie den Schnitt mit 5-0 Vicryl Nahtmaterial. Diese Nähte müssen nicht zu einem späteren Zeitpunkt entfernt werden, da sie sich auflösen auf eigene Faust. </li><li> Sobald der Schnitt wird geschlossen, statt das Tier auf einem drapierten Heizkissen in die Erholung Käfig und überwachen kontinuierlich bis wach. </li><li> Nach Tier 1 Stunde wieder, mit der Laser-Doppler-Durchblutung Schritt fort, um die Ischämie-Induktion zu bestätigen. </li></ol> 2. Laser-Doppler-Durchblutung <ol><li> Zu Beginn der Laser-Doppler-Perfusion Schritt legen Sie die Maus in die Narkose Kammer mit 1-3% Isofluran in 100% Sauerstoff bei einer Durchflussrate von 1l/min. </li><li> Lassen Sie die Maus in die Induktion Kammer, bis es reagiert auf äußere Reize ist. Dann entfernen Sie das Tier von der Induktion Kammer. Es wird empfohlen, das Narkosemittel aus dem Karton vor bündig mit der Deckelöffnung, zur Verringerung der Exposition zu Isofluran zu verringern. </li><li> Legen Sie das Tier auf der Pre-OP-Tisch verbunden kontinuierlichen Fluss von Isofluran. Dann entfernen Sie die Haare aus dem hinteren Gliedmaßen mit einem elektrischen Rasierer von Enthaarungscreme als notwendig an. </li><li> Nach dem Entfernen der Haare,Ort des Tieres auf einem 37 ° C erwärmten Oberfläche für 5 Minuten unter kontinuierlichem Fluss von Isofluran. Überwachen Sie die Kerntemperatur euthermia zu gewährleisten, wie Temperaturschwankungen deutlich beeinflussen wird Perfusion. </li><li> Nach 5 Minuten, legen Sie das Tier in Rückenlage auf eine nicht reflektierende Licht absorbierende Oberfläche, z. B. grün-buntes Tuch, verbunden mit einem kontinuierlichen Fluss von Isofluran. Verlängern Sie die Hinterbeine. </li><li> Als nächstes auf der Laser-Doppler-Imager und die Erfassungs-Software ab und initialisiert die Software. Geben Sie die Größe des Sichtfeldes und Auflösung. Am besten ist es immer das Sichtfeld und Pixeldichte konsequente zwischen Tieren, damit eine spätere Analyse zu erleichtern. </li><li> Öffnen Sie eine neue Datei. Drücken Sie Start, um mit dem Erwerb der Bilddaten. Im Allgemeinen die Imager erkennt automatisch die Entfernung von der Maus, aber wenn Sie dazu aufgefordert werden, geben die Entfernung des Tieres auf die Imager. Der Laser zeigt die Grenzen des Gesichtsfeldes und starten Sie dann Daten erfasst. </li><li> Nach Übernahme abgeschlossen ist, wird das Bild zunächst auf eine Reihe von Farben, die bezeichnend für das Niveau der Durchblutung der Beine zu zeigen. Die Farben können auf einen bestimmten Perfusion Bereich eingestellt werden, um besser vergleichen Daten zwischen den Tieren. </li><li> Wenn die Datenerfassung abgeschlossen ist, speichern Sie die Datei. </li><li> Dann wieder das Tier zur Erholung Käfig und Überwachung der Tiere kontinuierlich bis wach. </li><li> Um die Daten analysieren, verwenden Sie die Schwelle Anpassung in der Analyse-Software, um alle Hintergrundgeräusche zu subtrahieren. Ein Schwellenwert von 0,2 ist in der Regel ein vernünftiger Wert. Wählen Sie 2-Regionen von Interesse, oder ROIs, dass jedes Hinterbein Bereich abdecken. Eine Vielzahl von Sehenswürdigkeiten können Sie den ROI zwischen Gliedmaßen und Tieren zu standardisieren. Dann die mittlere Perfusion und der Variabilität in den ROI. Die Perfusion Differenz und Perfusion Verhältnis zwischen der ischämischen Extremität und Kontrolle des Körpers können dann leicht bestimmt werden. </li><li> Dieser Vorgang kann wiederholt werden, um Veränderungen in der hinteren Gliedmaßen Perfusion im Laufe der Zeit zu folgen. Bei einem gewünschten Zeitpunkt kann das Tier für die Beurteilung von Gewebe-Funktion und der Vergleich mit Perfusion Bilddaten eingeschläfert werden. </li></ol> 3. Repräsentative Ergebnisse: Die Anatomie der Hinterlauf Gefäßsystem ist in Abbildung 1 2 gezeigt. Eine repräsentative Darstellung der Hinterlauf nach Femoralarterie Explantation ist in Abbildung 2 dargestellt. Um zu bestätigen, die Induktion der Ischämie auf die hinteren Gliedmaßen, zeigt Laser-Doppler-Perfusion Bildanalyse eine drastische Reduzierung der Durchblutung der ischämischen Extremität, im Vergleich zu der Kontrolle des Körpers, wie in Abbildung 3 dargestellt. <img src="/files/ftp_upload/old/1035_2009_1_26_9/figure1_1035.png" alt="Abbildung 1" width="600" height="406" /> Abbildung 1. Anatomy of the Hinterlauf Gefäßsystem. Sternchen zeigen die Standorte der Ligation für die Induktion der hinteren Gliedmaßen Ischämie. <img src="/files/ftp_upload/old/1035_2009_1_20_7/Niiyama_HLI_Fig2.png" alt="Bild 2" width="600" height="450" /> Abbildung 2. Representative Diagramm, welches die Anatomie der Hinterlauf nach Unterbindung der A. femoralis am proximalen und distalen Seiten, die nach der Entfernung der Femoralarterie. <img src="/files/ftp_upload/old/1035_2009_1_20_8/Niiyama_HLI_Fig3.png" alt="Abbildung 3" width="600" height="256" /> Abbildung 3. Laser-Doppler-Bildern, die zeigen Blutfluss, bevor und nachdem die Induktion von Ischämie der linken Hinterlauf (durch Pfeil gekennzeichnet).

<ol>
	<li>Huang, N. F., Niiyama, H., De, A., Cooke, J. P., , . <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transplantation+and+non-invasive+tracking+of+embryonic+stem+cell-derived+endothelial+cells+for+treatment+of+hindlimb+ischemia.">Transplantation and non-invasive tracking of embryonic stem cell-derived endothelial cells for treatment of hindlimb ischemia.</a> J Vis Exp. , (2008).</li><li>Cook, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The anatomy of the laboratory mouse. , (1976).</li><li>Niiyama, H., Kai, H., Yamamoto, T., Shimada, T., Sasaki, K., Murohara, T., Egashira, K., Imaizumi, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Roles+of+endogenous+monocyte+chemoattractant+protein-1+in+ischemia-induced+neovascularization.">Roles of endogenous monocyte chemoattractant protein-1 in ischemia-induced neovascularization.</a> J. Am. Coll. Cardiol. 44, 661-666 (2004).</li><li>Dokun, A. O., Keum, S., Hazarika, S., Li, Y., Lamonte, G. M., Wheeler, F., Marchuk, D. A., Annex, B. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+quantitative+trait+locus+(LSq-1)+on+mouse+chromosome+7+is+linked+to+the+absence+of+tissue+loss+after+surgical+hindlimb+ischemia.">A quantitative trait locus (LSq-1) on mouse chromosome 7 is linked to the absence of tissue loss after surgical hindlimb ischemia.</a> Circulation. 117, 1207-1215 (2008).</li></ol>

Es gibt einige Quellen der Variabilität zu berücksichtigen bei der Planung und Durchführung Hinterlauf Ischämie-Modellen. Erstens kann das Niveau der Ischämie nach dem Standort der Ligation in Bezug auf die von Seitenästen variieren. Daher ist für die Konsistenz des Modells sollten die Tiere erleiden das gleiche Maß an Arterienligatur. Eine weitere Quelle der Variabilität in ischämischen Erholung auf das Alter der Tiere ist im Zusammenhang mit jungen Tieren (6-8 Wochen alt) mit schneller und vollständiger Verwertungsquoten als ältere Tiere (8-10 Monate alt), geändert durch hämodynamische (dh beurteilt Laser-Doppler-Perfusion) oder funktionelle (dh Laufband Test) misst. Für Studien, in der man der Beurteilung eines Angiogenese-Medikament, kann es vorteilhaft sein, ältere Tiere zu verwenden, da ein größerer Unterschied zwischen den Gruppen mit einer therapeutischen Intervention beobachtet werden können. Umgekehrt gilt für Studien, in der man die Beurteilung einer anti-angiogenen Faktor ist, kann es vorteilhaft sein, jüngere Tiere zu verwenden, um Wirkung der Größe 3 zu maximieren. Wenn richtig ausgeführt, sollte es minimal Komplikationen wie Blutungen, Infektionen oder Sterblichkeit. Kommt es zu Blutungen durch zufällige Störungen der V. femoralis oder andere Schiffe, unter leichten Druck mit einem sterilen Wattestäbchen oder Mull auf der Website von Blutungen angewendet werden sollte, bis die Blutung aufhört. Tiere mit Anzeichen einer Infektion sollte mit Antiinfektiva behandelt werden. Tiere, die signifikante Gangrän kann beeuthanized müssen. Diese Komplikation ist häufiger bei älteren Tieren, und in einigen Stämmen, wie BALB c Mäusen 4. Darüber hinaus kann das Hinterbein Ischämie-Modell zu leichten bis mäßig starken Schmerzen. Daher sollten Analgetika wie Buprenorphin oder Carprofen verabreicht, wie für die Behandlung von Schmerz benötigt werden, entsprechend den Empfehlungen des IACUC. Zusammenfassend haben wir eine einfache und reproduzierbare Methode zur Untersuchung PAD in einem Mausmodell der hinteren Gliedmaßen Ischämie demonstriert. Die hinteren Gliedmaßen Ischämie-Modell mit Laser-Doppler-Imaging-Analyse ist ein ausgezeichnetes System zur Untersuchung von Gefäßerkrankungen und für die Beurteilung der therapeutischen Kandidaten.

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		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
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		<tbody>
		
<tr>
<td>Surgical Tools</td>
<td>Tool</td>
<td>Fine Science Tools</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Constix Cotton Swabs</td>
<td>Tool</td>
<td>Contec</td>
<td>SC-4</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Betadine (Povidone-iodine)</td>
<td>Reagent</td>
<td>PDI</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>70% alcohol</td>
<td>Reagent</td>
<td>Kendall</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Phosphate Buffered Saline</td>
<td>Reagent</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>7-0 silk suture</td>
<td>Tool</td>
<td>Genzyme</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>5-0 vicryl suture</td>
<td>Tool</td>
<td>Ethicon</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Electric shaver</td>
<td>Tool</td>
<td>GE</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Cautery</td>
<td>Tool</td>
<td>Baxter</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Laser Doppler and PeriScan PIM 3 System</td>
<td>Equipment</td>
<td>Perimed</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

murine model of hindlimb ischemia 

In den Vereinigten Staaten betrifft periphere arterielle Verschlusskrankheit (pAVK) etwa 10 Millionen Menschen und ist auch weltweit verbreitet. Medizinische Therapien für symptomatische Linderung sind begrenzt. Chirurgische oder endovaskuläre Interventionen sind für einige Einzelpersonen nützlich, aber die langfristigen Ergebnisse sind oft enttäuschend. Als Ergebnis gibt es einen Bedarf für die Entwicklung neuer Therapien zur Behandlung von PAD. Die murine Hinterlauf Ischämie Vorbereitung ist ein Modell der PAD, und ist nützlich für die Erprobung neuer Therapien. Im Vergleich zu anderen Modellen der Gewebeischämie wie koronare oder zerebrale Arterienligation Vergleich bietet Femoralarterie Ligation für ein einfacheres Modell von ischämischem Gewebe. Weitere Vorteile dieses Modells sind die Leichtigkeit des Zugangs zu den Femoralarterie und niedrige Sterberate. In diesem Video zeigen wir die Methodik für die murine Modell der einseitigen hindimb Ischämie. Die spezifischen Materialien und Verfahren für die Erstellung und Auswertung des Modells beschrieben werden, einschließlich der Beurteilung der Extremitäten-Perfusion mittels Laser-Doppler-Bildgebung. Dieses Protokoll kann auch für die Transplantation und nicht-invasive Tracking von Zellen, die von Huang et al demonstriert. 1 genutzt werden.

Watch this Scientific Journal Video about Murine Model of Hindlimb Ischemia at JoVE.com

Murine Model of Hindlimb Ischemia

Das chirurgische Verfahren zur Induktion einer einseitigen Hinterlauf Ischämie nachgewiesen wird, mit der Bestätigung der Ischämie durch Laser-Doppler-Perfusion.

Mausmodell der hinteren Gliedmaßen Ischämie

In the United States, peripheral arterial disease (PAD) affects about 10 million individuals, and is also prevalent worldwide.  Medical therapies for ...

Research

JoVE Journal

Biology

Murine Model of Hindlimb Ischemia 

57.1K Aufrufe.  Stanford University. Das chirurgische Verfahren zur Induktion einer einseitigen Hinterlauf Ischämie nachgewiesen wird, mit der Bestätigung der Ischämie durch Laser-Doppler-Perfusion.

Serie: Murine Model of Hindlimb Ischemia

The Hypoxic Ischemic Encephalopathy Model of Perinatal Ischemia

Hypoxic-Ischemic Encephalopathy (HIE) is the consequence of systemic asphyxia occurring at birth. Twenty five percent of neonates with HIE develop severe and permanent neuropsychological sequelae, including mental retardation, cerebral palsy, and epilepsy. The outcomes of HIE are devastating and permanent, making it critical to identify and develop therapeutic strategies to reduce brain injury in newborns with HIE. To that end, the neonatal rat model for hypoxic-ischemic brain injury has been developed to model this human condition. The HIE model was first validated by Vannucci et al 1 and has since been extensively used to identify mechanisms of brain injury resulting from perinatal hypoxia-ischemia 2 and to test potential therapeutic interventions 3,4. The HIE model is a two step process and involves the ligation of the left common carotid artery followed by exposure to a hypoxic environment. Cerebral blood flow (CBF) in the hemisphere ipsilateral to the ligated carotid artery does not decrease because of the collateral blood flow via the circle of Willis; however with lower oxygen tension, the CBF in the ipsilateral hemisphere decreases significantly and results in unilateral ischemic injury. The use of 2,3,5-triphenyltetrazolium chloride (TTC) to stain and identify ischemic brain tissue was originally developed for adult models of rodent cerebral ischemia 5, and is used to evaluate the extent of cerebral infarctin at early time points up to 72 hours after the ischemic event 6. In this video, we demonstrate the hypoxic-ischemic injury model in postnatal rat brain and the evaluation of the infarct size using TTC staining.

The postnatal rat model for hypoxic-ischemic brain injury is a well-established model of human neonatal hypoxic ischemic encephalopathy (HIE). In this article, we describe the model of HIE in post-natal rat pups.

Die hypoxische ischämischen Enzephalopathie Model of Perinatal Ischämie

Hypoxic-Ischemic Encephalopathy (HIE) is the consequence of systemic asphyxia occurring at birth. Twenty five percent of neonates with HIE develop severe ...

Forschung

Biologie

Embryonic Stem Cell-Derived Endothelial Cells for Treatment of Hindlimb Ischemia

Peripheral arterial disease (PAD) results from narrowing of the peripheral arteries that supply oxygenated blood and nutrients to the legs and feet, This pathology causes symptoms such as intermittent claudication (pain with walking), painful ischemic ulcerations, or even limb-threatening gangrene. It is generally believed that the vascular endothelium, a monolayer of endothelial cells that invests the luminal surface of all blood and lymphatic vessels, plays a dominant role in vascular homeostasis and vascular regeneration. As a result, stem cell-based regeneration of the endothelium may be a promising approach for treating PAD.In this video, we demonstrate the transplantation of embryonic stem cell (ESC)-derived endothelial cells for treatment of unilateral hindimb ischemia as a model of PAD, followed by non-invasive tracking of cell homing and survival by bioluminescence imaging. The specific materials and procedures for cell delivery and imaging will be described. This protocol follows another publication in describing the induction of hindlimb ischemia by Niiyama et al.1

The surgical procedure for delivery of embryonic stem cell-derived endothelial cells to the ischemic hindlimb is demonstrated, with non-invasive tracking by bioluminescence imaging.

Embryonale Stammzellen gewonnenen Endothelzellen zur Behandlung von Ischämie Hinterlauf

Peripheral arterial disease (PAD) results from narrowing of the peripheral arteries that supply oxygenated blood and nutrients to the legs and feet, This ...

LAD-Ligation: A Murine Model of Myocardial Infarction

Research models of infarction and myocardial ischemia are essential to investigate the acute and chronic pathobiological and pathophysiological processes in myocardial ischemia and to develop and optimize future treatment.
Two different methods of creating myocardial ischemia are performed in laboratory rodents. The first method is to create cryo infarction, a fast but inaccurate technique, where a cryo-pen is applied on the surface of the heart (1-3). Using this method the scientist can not guarantee that the cryo-scar leads to ischemia, also a vast myocardial injury is created that shows pathophysiological side effects that are not related to myocardial infarction. The second method is the permanent ligation of the left anterior descending artery (LAD). Here the LAD is ligated with one single stitch, forming an ischemia that can be seen almost immediately. By closing the LAD, no further blood flow is permitted in that area, while the surrounding myocardial tissue is nearly not affected. This surgical procedure imitates the pathobiological and pathophysiological aspects occurring in infarction-related myocardial ischemia.
The method introduced in this video demonstrates the surgical procedure of a mouse infarction model by ligating the LAD. This model is convenient for pathobiological and pathophysiological as well as immunobiological studies on cardiac infarction. The shown technique provides high accuracy and correlates well with histological sections.

This video demonstrates how to use a fast and reliable model to study pathobiological and pathophysiological processes of myocardial ischemia.

LAD-Ligation: einem Mausmodell der Myokardinfarkt

Research models of infarction and myocardial ischemia are essential to investigate the acute and chronic pathobiological and pathophysiological processes ...

An Alternant Method to the Traditional NASA Hindlimb Unloading Model in Mice

The Morey-Holton hindlimb unloading (HU) method is a widely accepted National Aeronautics and Space Administration (NASA) ground-based model for studying disuse-atrophy in rodents 4-6. Our study evaluated an alternant method to the gold-standard Morey-Holton HU tail-traction technique in mice. Fifty-four female mice (4-8 mo.) were HU for 14 days (n=34) or 28 days (n=20). Recovery from HU was assessed after 3 days of normal cage ambulation following HU (n=22). Aged matched mice (n=76) served as weight-bearing controls.
Prior to HU a tail ring was formed with a 2-0 sterile surgical steel wire that was passed through the 5th, 6th, or 7th inter-vertebral disc space and shaped into a ring from which the mice were suspended. Vertebral location for the tail-ring was selected to appropriately balance animal body weight without interfering with defecation.
We determined the success of this novel HU technique by assessing body weight before and after HU, degree of soleus atrophy, and adrenal mass following HU. Body weight of the mice prior to HU (24.3 &plusmn; 2.9g) did not significantly decline immediately after 14d of HU (22.7 &plusmn; 1.9g), 28d of HU (21.3 + 2.1g) or after 3 days recovery (24.0 &plusmn; 1.8g). Soleus muscle mass significantly declined (-39.1%, and -46.6%) following HU for 14 days and 28 days respectively (p&lt;0.001). Following 3 days of recovery soleus mass significantly increased to 74% of control values. Adrenal weights of HU mice were not different compared to control mice.
The success of our novel HU method is evidenced by the maintenance of animal body weight, comparable adrenal gland weights, and soleus atrophy following HU, corresponding to expected literature values 2, 7, 8. The primary advantages of this HU method include: 1) ease of tail examination during suspension; 2) decreased likelihood of cyanotic, inflamed, and/or necrotic tails frequently observed with tail-taping and HU; 3) no possibility of mice chewing the traction tape and coming out of the suspension apparatus; and 4) rapid recovery and normal cage activity immediately after HU.

We developed an alternant hindlimb unloading model in mice. The primary advantage of our hindlimb unloading tail-ring method over the conventional Morey-Holton tail-traction technique is a simple straightforward procedure that minimizes stress upon the animal.

Eine alternierende Methode, um die traditionelle NASA Hinterlauf Entladen Modell in Mäusen

The Morey-Holton hindlimb unloading (HU) method is a widely accepted National Aeronautics and Space Administration (NASA) ground-based model for studying ...

An Anoxia-starvation Model for Ischemia/Reperfusion in C. elegans

Protocols for anoxia/starvation in the genetic model organism C. elegans simulate ischemia/reperfusion. Worms are separated from bacterial food and placed under anoxia for 20 hr&#160;(simulated ischemia), and subsequently moved to a normal atmosphere with food (simulated reperfusion). This experimental paradigm results in increased death and neuronal damage, and techniques are presented to assess organism viability, alterations to the morphology of touch neuron processes, as well as touch sensitivity, which represents the behavioral output of neuronal function. Finally, a method for constructing hypoxic incubators using common kitchen storage containers is described. The addition of a mass flow control unit allows for alterations to be made to the gas mixture in the custom incubators, and a circulating water bath allows for both temperature control and makes it easy to identify leaks. This method provides a low cost alternative to commercially available units.

An Anoxia-starvation Model for Ischemia/Reperfusion in C. elegans

A protocol is described that uses anoxia/starvation in C. elegans to model ischemia/reperfusion. Functional outcomes include increased mortality, visible abnormalities in GFP-labeled neuronal processes, and impaired behavioral responses that require neuronal function.

Ein Anoxia-Hunger-Modell für Ischämie / Reperfusion in<em&gt; C. elegans</em

Protocols for anoxia/starvation in the genetic model organism C. elegans simulate ischemia/reperfusion. Worms are separated from bacterial food and placed ...

The Murine Choline-Deficient, Ethionine-Supplemented (CDE) Diet Model of Chronic Liver Injury

Chronic liver diseases, such as viral hepatitis, alcoholic liver disease, or non-alcoholic fatty liver disease, are characterized by continual inflammation, progressive destruction and regeneration of the hepatic parenchyma, liver progenitor cell proliferation, and fibrosis. The end-stage of every chronic liver disease is cirrhosis, a major risk factor for the development of hepatocellular carcinoma. To study processes regulating disease initiation, establishment, and progression, several animal models are used in laboratories. Here we describe a six-week time course of the choline-deficient and ethionine-supplemented (CDE) mouse model, which involves feeding six-week old male C57BL/6J mice with choline-deficient chow and 0.15% DL-ethionine-supplemented drinking water. Monitoring of animal health and a typical body weight loss curve are explained. The protocol demonstrates the gross examination of a CDE-treated liver and blood collection by cardiac puncture for subsequent serum analyses. Next, the liver perfusion technique and collection of different hepatic lobes for standard evaluations are shown, including liver histology assessments by hematoxylin and eosin or Sirius Red stainings, immunofluorescent detection of hepatic cell populations as well as transcriptome profiling of the liver microenvironment. This mouse model is suitable for studying inflammatory, fibrogenic, and liver progenitor cell dynamics induced through chronic liver disease and can be used to test potential therapeutic agents that may modulate these processes.

The Murine Choline-Deficient, Ethionine-Supplemented CDE Diet Model of Chronic Liver Injury

Here we describe a common method to induce chronic liver injury in mice by feeding of a choline-deficient and ethionine-supplemented (CDE) diet. We demonstrate health monitoring, liver perfusion, isolation, and preservation. A time course of six weeks can inform about liver injury, pathohistology, fibrosis, inflammatory, and liver progenitor cell responses.

Der murinen Cholin-Mangel, Ethionine ergänzt (CDE) Diät-Modell einer chronischen Leberschädigung

Chronic liver diseases, such as viral hepatitis, alcoholic liver disease, or non-alcoholic fatty liver disease, are characterized by continual ...

A Murine Model of Vertical Sleeve Gastrectomy

Bariatric surgery, such as vertical sleeve gastrectomy (VSG), is a surgery of the gastrointestinal tract that is performed for the purpose of weight loss. Bariatric surgery is currently the most effective long-term treatment for obesity. In addition to weight loss, bariatric surgery produces additional health benefits such as remission of type 2 diabetes, remission of hypertension, and decreased risk of developing certain types of cancer. The mechanisms beyond weight loss for these benefits remain incompletely defined. Therefore, animal models of bariatric surgery are being developed and validated to identify the mechanisms leading to these benefits, with the goal of improving understanding of gastrointestinal physiology and identifying new therapeutic targets. VSG has become the most commonly performed bariatric procedure in the clinic in the United States because it is highly effective at producing weight loss and metabolic improvement, and is simpler to perform than other bariatric procedures. Therefore, we have developed and validated a murine model of VSG. This murine VSG model recapitulates many of the effects of VSG seen in humans, including improved glucose and blood pressure regulation. The method is based on isolation of the stomach, ligation of gastric vessels, and removal of 70% of the stomach by transecting along the greater curvature of the stomach. We have successfully applied this surgical protocol to various genetically modified mouse lines to define the mechanistic contributors to the benefits of VSG. Furthermore, this murine VSG model has been combined with other surgical techniques, to achieve deeper mechanistic insight. Therefore, this is a simple and versatile model for studying gastrointestinal physiology and the health benefits of bariatric surgery.

The following describes the performance of vertical sleeve gastrectomy in mice. This is a type of weight-loss surgery that involves removal of approximately 70% of the stomach.

Ein Mausmodell der vertikalen Sleeve-Gastrektomie

Bariatric surgery, such as vertical sleeve gastrectomy (VSG), is a surgery of the gastrointestinal tract that is performed for the purpose of weight loss. ...

Mass Spectrometry Analysis to Identify Ubiquitylation of EYFP-tagged CENP-A (EYFP-CENP-A)

Studying the structure and the dynamics of kinetochores and centromeres is important in understanding chromosomal instability (CIN) and cancer progression. How the chromosomal location and function of a centromere (i.e., centromere identity) are determined and participate in accurate chromosome segregation is a fundamental question. CENP-A is proposed to be the non-DNA indicator (epigenetic mark) of centromere identity, and CENP-A ubiquitylation is required for CENP-A deposition at the centromere, inherited through dimerization between cell division, and indispensable to cell viability.
Here we describe mass spectrometry analysis to identify ubiquitylation of EYFP-CENP-A K124R mutant suggesting that ubiquitylation at a different lysine is induced because of the EYFP tagging in the CENP-A K124R mutant protein. Lysine 306 (K306) ubiquitylation in EYFP-CENP-A K124R was successfully identified, which corresponds to lysine 56 (K56) in CENP-A through mass spectrometry analysis. A caveat is discussed in the use of GFP/EYFP or the tagging of high molecular weight protein as a tool to analyze the function of a protein. Current technical limit is also discussed for the detection of ubiquitylated bands, identification of site-specific ubiquitylation(s), and visualization of ubiquitylation in living cells or a specific single cell during the whole cell cycle.
The method of mass spectrometry analysis presented here can be applied to human CENP-A protein with different tags and other centromere-kinetochore proteins. These combinatory methods consisting of several assays/analyses could be recommended for researchers who are interested in identifying functional roles of ubiquitylation.

Mass Spectrometry Analysis to Identify Ubiquitylation of EYFP-tagged CENP-A EYFP-CENP-A

CENP-A ubiquitylation is an important requirement for CENP-A deposition at the centromere, inherited through dimerization between cell division, and indispensable to cell viability. Here we describe mass spectrometry analysis to identify ubiquitylation of EYFP-tagged CENP-A (EYFP-CENP-A) protein.

Massenspektrometrieanalyse zur Identifizierung der Ubiquitylierung von EIFP-A mit EYFP-Tags (EYFP-CENP-A)

Studying the structure and the dynamics of kinetochores and centromeres is important in understanding chromosomal instability (CIN) and cancer ...

A Murine Model of a Burn Wound Reconstructed with an Allogeneic Skin Graft

Trivial superficial wounds heal without complications by primary intention. Deep wounds, such as full thickness burns, heal by secondary intention and require surgical debridement and skin grafting. Successful integration of the donor graft into a recipient wound bed depends on timely recruitment of immune cells, robust angiogenic response and new extracellular matrix formation. The development of novel therapeutic agents, which target some key processes involved in wound healing, are hindered by the lack of reliable preclinical models with optimized objective assessment of wound closure. Here, we describe an inexpensive and reproducible model of experimental full thickness burn wound reconstructed with an allogeneic skin graft. The wound is induced on the dorsum surface of anaesthetized inbred wild type mice from the BALB/C and SKH1-Hrhr backgrounds. The burn is produced using a brass template measuring 10 mm in diameter, which is preheated to 80 &#176;C and delivered at a constant pressure for 20 s. Burn eschar is excised 24 hours after the injury and replaced with a full thickness graft harvested from the tail of a genetically similar donor mouse. No specialized equipment is required for the procedure and surgical techniques are straightforward to follow. The method may be effortlessly implemented and reproduced in most research settings. Certain limitations are associated with the model. Due to technical difficulties, the harvest of thinner split thickness skin grafts is not possible. The surgical method we describe here allows for the reconstruction of burn wounds using full thickness skin grafts. It may be used to carry out preclinical therapeutic testing.

The aim of this study was to develop a murine model of burn wound healing. A thermal burn was induced on the dorsal skin of mice using a preheated brass template. Burned tissue was debrided and overlaid with a skin graft harvested from the tail of a genetically similar donor mouse.

Ein murines Modell einer Verbranntenwunde, rekonstruiert mit einem allogenen Hautgraft

Trivial superficial wounds heal without complications by primary intention. Deep wounds, such as full thickness burns, heal by secondary intention and ...

A Modified Surgical Model of Hind Limb Ischemia in ApoE-/- Mice using a Miniature Incision

The purpose of this study is to introduce and evaluate a modified surgical approach to induce acute ischemia in mice that can be implemented in most animal laboratories.&#160;Contrary to the conventional approach for double ligation of the femoral artery (DLFA), a smaller incision on the right inguinal region was made to expose the proximal femoral artery (FA) to perform DLFA. Then, using a 7-0 suture, the incision was dragged to the knee region to expose the distal FA. Magnetic resonance imaging (MRI) on bilateral hind limbs was used to detect FA occlusion after the surgery. At 0, 1, 3, 5, and 7 days after the surgery, functional recovery of the hind limbs was visually assessed and graded using the Tarlov scale. Histologic evaluation was performed after euthanizing the animals 7 days after DLFA. The procedures were successfully performed on the right leg in ten ApoE-/- mice, and no mice died during subsequent observation. The incision sizes in all 10 mice were less than 5 mm (4.2 &#177; 0.63 mm). MRI results showed that FA blood flow in the ischemic side was clearly blocked. The Tarlov scale results demonstrated that hind limb function significantly decreased after the procedure and slowly recovered over the following 7 days. Histologic evaluation showed a significant inflammatory response on the ischemic side and reduced microvascular density in the ischemic hind limb. In conclusion, this study introduces a modified technique using a miniature incision to perform hind limb ischemia (HLI) using DLFA.

A Modified Surgical Model of Hind Limb Ischemia in ApoE-/- Mice using a Miniature Incision

This article demonstrates an efficient surgical approach to establish acute ischemia in mice with a small incision. This approach can be applied by most research groups without any laboratory upgrades.

A Modified Surgical Model of Hind Limb Ischemia in ApoE-/- Mäuse mit einem Miniaturschnitt

The purpose of this study is to introduce and evaluate a modified surgical approach to induce acute ischemia in mice that can be implemented in most ...