Das übergeordnete Ziel dieses Experiments, unser hinterlimbische ischmia Modell ist es, das Experiment eine Grundlage für eine umfassende Bewertung der funktionellen, histologischen und molekularen Wirkung von vermeintlichen angiogenen Wirkstoffen zu beleuchten. Dieses Protokoll stellt einen Standard für die Prüfung möglicher angiogener Therapien in einem Kleintiermodell mit dem Potenzial für zukünftige Anwendungen im klinischen Kontext auf. Da die Revaskularisation bei zwanzig bis dreißig Prozent der kritischen Ischämie-Patienten nicht geeignet ist, hat sich die therapeutische Angiogenese als eine neue Strategie zur Verbesserung der Blutprofusion an der ischämischen Stelle herauskristallisiert.
Dieses experimentelle Protokoll könnte ein umfassendes Verständnis der Mechanismen bieten, mit denen angiogene Therapien ihre Wirkung im Maße ihrer Wirksamkeit bei jedem ihrer Ergebnisse ausüben. Nach der Bestätigung einer fehlenden Reaktion auf Zehenkneifen in einer 22 Wochen alten C57 schwarz sechs weibliche Maus, rasieren Sie die Haare von der rechten Hinterbein und sichern Sie das Tier in der dorsalen zu cubitus Position auf einem beheizten Pad. Legen Sie das Tier unter ein Sezierendes Mikroskop.
Und verwenden Sie eine Nummer elf chirurgische Skalpellklinge, um einen einen Zentimeter Hautschnitt über den Oberschenkel des rechten Hinterglieds zu machen. Blunt sezieren das subkutane Fett, um das neurovaskuläre Bündel zu belichten. Und verwenden Sie spitze Zangen, Federschere und einen ophthalmologischen Nadelhalter, um die membranöse ileofemorale Hülle zu öffnen, um die distalen äußeren Ilias- und Femoralgefäße freizulegen.
Nach der Zerlegung und Trennung der Arterie und Vene vom Nerv, verwenden Sie sieben O nicht resorbierende Polypropylen Nähte, um die distale femorale Arterie und Vene und distale äußere Iliac Arterie und Vene zu ligte. Die Identifizierung der distalen äußeren Iliasarterie und die Ligation und Exzision der distalen äußeren Ilias- und Femoralarterie und Venen sind entscheidend für den Erfolg des Verfahrens. Verwenden Sie die Federschere, um das Segment der iliofemoralen Arterie und Venen zwischen den distalen und proximalen Knoten zu transsektieren.
Und schließen Sie den Schnitt mit einer resorbierbaren Naht. Dann, interperitoneally liefern antisedative Lösung in das Tier und bringen Sie die Maus in seinen Hauskäfig mit Überwachung bis zur vollständigen Genesung. Um die Gastrocnemius-Muskeln zu ernten, entfernen Sie die Haut von beiden Hinterbeinen.
Und verwenden Sie den Wattestäbchen, um die Haut von den Muskeln zu trennen. Halten Sie die Achillessehne, verwenden Sie die Federschere, um den Muskel von der Tibia und Fibel bis zum Kniegelenk zu trennen. Und trennen Sie den Bizeps femoris vom Magen-Darm-Muskel.
Verwenden Sie die Federschere, um die Einfügungen des Magen-Darm-Muskels auf kniegelenksebene zu schneiden. Und verwenden Sie 10%trigasanth, um die geernteten Muskeln in einer queren Ausrichtung auf einer kleinen Korkscheibe zu positionieren. Dann, Snap einfrieren die Proben in flüssigen Stickstoff gekühlt isopentane für minus 80 Grad Celsius Lagerung.
Für die Kapillar-Mikrodissektions-Laseraufnahme, nach Erhalt 12 Mikrometer Abschnitte der Muskelproben, fixieren Sie das Gewebe an den Dias in 50 Milliliter gekühlten reinen Aceton für fünf Minuten bei minus zwanzig Grad Celsius. Nach der Lufttrocknung und umkreisen sie jedes Exemplar mit einem hydrophoben Pen. Und rehydrieren Sie die Proben mit zwei mollaren Natriumchlorid in PBS bei vier Grad Celsius.
Am Ende der Rehydratation die Proben mit dem entsprechenden primären Antikörper von Interesse bei vier Grad Celsius über Nacht beschriften. Gefolgt von zwei dreiminütigen Wälten in frischem zwei Mol-Natriumchlorid in PBS pro Waschgang. Nach der zweiten Wäsche die Abschnitte mit einem geeigneten Sekundärantikörper für dreißig Minuten bei vier Grad Celsius beschriften, gefolgt von zwei Waschungen in Natriumchlorid in PBS, wie gezeigt.
Als nächstes beschriften Sie die Proben mit avidin konjugierten Peroxidase-Komplex für dreißig Minuten bei vier Grad Celsius. Gefolgt von einer Wäsche und fünf Minuten Etikettierung mit DAB Peroxidase Substrat. Am Ende der Inkubation dehydrieren Sie das Gewebe in sequenziellen eiskalten 90%Ethanol- und 100%Ethanol-Emersionen.
Verwenden Sie dann ein späteres Mikrodissektionssystem, das mit einem Puls-zu-Festkörper-Laser 355 Nanometer ausgestattet ist, um 10.000 Kapillaren pro Maus zu sezieren und die dissect kapillaren in eine Mikrofugenrohr-Klebstoffkappe zu katapultieren. Wie dargestellt, wird ein vollständiger Verlust der Hinterbleibsperfusion unmittelbar nach der Hinterbder Ischämie-Induktion beobachtet. Quantitative Auswertung des Blutflusses, ausgedrückt als Verhältnis von ISC zu NISC Gliedmaßen, zeigte signifikant verbesserte Gliedmaßenblutperfusion bei Mäusen, die dem pro-angiogenetischen Reiz an den Tagen 15 und 45 nach dem HLI ausgesetzt waren.
Die Quantifizierung von CD31-positiven Kapillaren in histologischen Abschnitten von Gastrocnemius-Muskelgewebeabschnitten zeigt, dass die Kapillardichte in der ischämischen als in der nicht-ischämischen Extremität größer ist. Wie erwartet. Dieser Effekt wird jedoch nach der Behandlung mit dem pro-angiogenetischen Mittel weiter verstärkt.
Die Kollateralgefäßdichte steigt auch in der ischämischen Gliedmaße kontinuierlich an und dieser Anstieg ist nach exposition mit dem pro-angiogenen Reiz deutlich höher. Die Reverse-Transkriptase-Polymerase-Kettenreaktionsanalyse der pro-angiogenen Genexpression in CD31-positiven Endothelzellen zeigt eine deutliche Variation der Genexpression zwischen Mäusen, die dem pro-angiogenen Wirkstoff ausgesetzt sind oder nicht. Es ist wichtig, eine augenheilbe,ältere zu verwenden, um die membranöse iliofemorale Scheide zu öffnen, um ein Reißen der Arterie und Vene während der Gefäßsektion zu vermeiden.
Das Gefäß reagiert auf hintere Zischämie in der leicht durch Laserdoppler-basierten Perfusionsmessungen ausgewerteten Und die histologische Quantifizierung der Kapillargefäßdichte ermöglicht es uns, die Angiogenese zu bewerten.
