Zellzyklusanalyse: Bewertung der Proliferation von CD4- und CD8-T-Zellen nach Stimulation mit CFSE-Färbung und Durchflusszytometrie
Quelle: Perchet Thibaut1,2,3, Meunier Sylvain1,2,3, Sophie Novault4, Rachel Golub1,2,3
1 Abteilung für Lymphpoiesis, Institut für Immunologie, Pasteur Institute, Paris, Frankreich
2 INSERM U1223, Paris, Frankreich
3 Université Paris Diderot, Sorbonne Paris Cité, Cellule Pasteur, Paris, Frankreich
4 Flow Cytometry Platfrom, Cytometry and Biomarkers UtechS, Center for Translational Science, Pasteur Institute, Paris, Frankreich
Der Zellzyklus ist ein universeller Prozess des Lebens. Während des Zellzyklus erfährt eine Zelle mehrere Modifikationen, um sich in zwei Tochterzellen zu teilen. Dieser Mechanismus tritt im gesamten Leben eines Organismus als Reaktion auf seine Bedürfnisse auf. Zellteilungen und embryonale Entwicklung produzieren einen vollständigen Organismus aus einer einzelligen Zygote. Im Erwachsenenalter ist der Zellzyklus für viele kritische biologische Prozesse, wie Gewebereparaturen, von zentraler Bedeutung.
Mechanismen der Zellteilung sind streng kontrollierte Ereignisse, bei denen die Zelle vor der endgültigen Teilung schrittweise modifikationen. Zellen, die sich noch nicht im Zyklus befinden,werden als in der Phase "Lücke 0". In dieser Phase gilt die Zelle als ruhend. Wenn die Zelle zu zyklieren beginnt, werden vier verschiedene Phasen erkannt: Lücke 1 (G1), Synthese (S), Lücke 2 (G2) und Mitosis (M). G1 Phase ist ein Checkpoint für Ressourcen, die von der Zelle für die DNA-Synthese benötigt werden. Dann tritt die S-Phase auf, und die DNA-Replikation beginnt, gefolgt von der G 2-Interphase, einem weiteren Prüfpunkt, der alle Elemente steuert, die erforderlich sind, damit die Zelle geteilt werden kann. Schließlich tritt die Zelle in die Mitose ein und teilt sich in zwei Tochterzellen.
Die Zellteilung ist ein sehr informativer Parameter in vielen verschiedenen biologischen Systemen. Im Bereich der Immunologie kann die Analyse der Leukozytenproliferation auf den Mechanismus der Immunantwort hinweisen. Andere Untersuchungsbereiche stützen sich ebenfalls auf die Zellzyklusanalyse. Zum Beispiel hat die Analyse des Zellzyklus während der Tumorentwicklung unser Verständnis von Krebs verbessert.
Viele Fluoreszenzfarbstoffe sind jetzt für die Verfolgung der Zellproliferation verfügbar. Diese Farbstoffe unterscheiden sich in ihren chemischen und spektralen Eigenschaften. Es gibt zwei verschiedene Klassen von Farbstoffen: Proteinfarbstoffe verbinden sich dauerhaft mit Protein, indem sie eine kovalente Bindung bilden, und Membranfarbstoffe, die über starke hydrophobe Assoziationen stabil in Zellmembranen intercalate. In-vitro- und In-vivo-Studien zur Proliferation von Immunzellen durch Durchflusszytometrie gehören zu den häufigsten Anwendungen beider Klassen von Zelltracking-Farbstoffen (1, 2).
CFSE (Carboxyfluorescein succinimidylester) ist ein fluoreszierender Farbstoff, der teilende Zellen markiert. Zunächst erhalten alle Zellen die gleiche Menge an Farbstoff; Die teilenden Zellen teilen den Farbstoff, den sie erhielten, gleichmäßig zwischen ihren beiden Tochterzellen auf. Folglich kann dem Zellzyklus die fortschreitende Abnahme der Farbstoffintensität in den Zellen folgen. Auf cfSE-Färbung folgt die herkömmliche multiparametrische Durchflusszytometrie, eine technologiebasierter Technologie mit hohem Durchsatz, die eine phänotypische und funktionelle Charakterisierung von Zellen auf der Grundlage ihres CFSE-Färbegrades ermöglicht (3).
Im folgenden Experiment bewerten wir die Proliferation von CD4+ und CD8+ T-Zellen in-vitronach CD3-Stimulation mit CFSE-Färbung und Durchflusszytometrie.
1. Vorbereitung
- Vor Beginn Laborhandschuhe und die entsprechende Schutzkleidung anziehen.
- Sterilisieren Sie alle Sezierwerkzeuge, zuerst mit einem Reinigungsmittel und dann mit 70% Ethanol und wischen Sie sie dann gründlich trocken.
- Bereiten Sie 50 ml von Hanks ausgewogener Salzlösung (HBSS) vor, die 2% fetales Kalbsserum (FCS) enthält.
2. Dissektion
- Mit einem Kohlendioxid-Zufuhrsystem, euthanisieren Sie die Maus d
In diesem Experiment verfolgten wir die Proliferation von Splenic CD4+ und CD8+ T-Zellen in der In-vitro-Kultur. Nach 3 Tagen haben wir keine starke Proliferation sowohl in CD4+ als auch in CD8+ T-Zellen mit oder ohne Stimulation gesehen. Dies ist auf dem oberen Panel von Abbildung 2 zu sehen, wo die Spitzen von CSFE nicht abnehmen. Nach 5 Tagen begannen wir jedoch, eine Proliferation in beiden Populationen
Proliferations-Assays werden häufig in verschiedenen Bereichen wie der Immunologie verwendet, um den Grad der Aktivierung von Zellen zu bestimmen. Es wird auch in der onkologischen Diagnostik durchgeführt, um Die Tumoraggressivität bei Patienten zu bestimmen. CFSE-Färbung ist eine nützliche Technik, um die Proliferation von Immunzellpopulationen im Laufe der Zeit zu verfolgen. Andere Methoden ermöglichen die Charakterisierung des Zellzyklus. BrdU, ein Äquivalent von CFSE, wird nur in teilenden Zellen eingebaut. J?...
- Lyons, A. B. and Parish, C. R. Determination of lymphocyte division by flow cytometry. Journal of Immunological Methods. 171 (1): 131-37, (1994).
- Lyons, A. B. Analyzing cell division in vivo and in vitro using flow cytometric measurement of CFSE dye dilution. Journal of Immunological Methods. 243 (1-2), 147-154, (2000).
- Quah, B. J., Warren H. S., and Parish, C. R. Monitoring lymphocyte proliferation in vitro and in vivo with the intracellular fluorescent dye carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester. Nature Protocols. 2 (9): 2049-56, (2007).
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