1. Preparazione

1. Prima di iniziare, indossare guanti da laboratorio e gli indumenti protettivi appropriati.
2. Sterilizzare tutti gli strumenti di dissezione, prima con un detergente e poi con etanolo al 70% e poi asciugarli accuratamente.
3. Preparare 50 ml di soluzione salina bilanciata di Hank (HBSS) contenente il 2% di siero fetale per vitelli (FCS).

2. Dissezione

1. Utilizzando un sistema di rilascio di anidride carbonica, eutanasizzare il topo per ipossia. Fissare il topo eutanasizzato su una piastra di dissezione in posizione supina ed eseguire una laparotomia longitudinale usando forbici e pinza.
2. Usando la pinza, spostare l'intestino e lo stomaco sul lato destro dell'addome per esporre lo stomaco e la milza. La milza è attaccata allo stomaco.
3. Usando la pinza staccare accuratamente la milza dallo stomaco e metterla nella capsula di Petri contenente 5 ml di HBSS 2% FCS.

3. Isolamento delle cellule immunitarie

1. Posizionare la milza su un colino cellulare da 40 μm sulla stessa capsula di Petri. Schiacciare la milza con uno stantuffo per dissociarla.
2. Trasferire la milza dissociata e il fluido in un tubo centrifugo da 15 ml.
3. Centrifugare il tubo a 370 x g per 7 min a 10°C ed eliminare il surnatante evitando il pellet.
4. Ricaspendare il pellet in 2 ml di acetato di potassio per lisire gli eritrociti. Attendere 2 minuti e quindi portare il volume fino a 15 ml utilizzando HBSS 2% FCS.
5. Centrifugare nuovamente il tubo a 370 x g per 7 min a 10°C. Scartare il surnatante e ricaspenare il pellet in 5 ml di HBSS 2% FCS.
6. Contare le cellule utilizzando un test di colorazione blu tripano e regolare la concentrazione cellulare finale a 10⁷ cellule / mL utilizzando un volume appropriato di HBSS 2% FCS.

4. Colorazione CFSE e stimolazione delle cellule T

1. Distribuire 10⁷ cellule/tubo isolati della milza in 4 tubi (tubi da 15 mL, etichettati da 1 a 4)
2. Aggiungere 3 mL HBSS 2%FCS a ciascun tubo.
3. Aggiungere 1 μL di CSFE in ogni tubo (concentrazione finale- 5 μM).
4. Incubare i tubi a 37°C in un incubatore a CO_{2 al 5%} per 10 min.
5. Nei tubi 3 e 4, aggiungere 12 mL di anticorpo HBSS 2% FCS + anti-CD3 ad una concentrazione finale di 2,5 μg/mL. I tubi 3 e 4 sono stimolati utilizzando anticorpi anti-CD3, per osservare l'effetto sul ciclo cellulare.
6. Nei tubi 1 e 2 aggiungere 12 mL di HBSS 2% FCS. Le cellule nei tubi 1 e 2 non saranno stimolate.
7. Centrifugare tutti i tubi a 370 x g per 7 min a 10°C. Scartare i supernatanti.
8. Spese di sospensione del pellet in 2 ml di HBSS 2%FCS.
9. Trasferire le soluzioni risultanti in pozzetti separati su una piastra a 6 pozzetti.
10. Incubare le cellule a 37°C, 5% CO₂ per 3 giorni.

5. Colorazione cellulare

1. Il giorno 3, aggiungere 2 ml HBSS 2% FCS in ben 1 e 3.
2. Pipettare vigorosamente e trasferire i campioni in tubi FACS da 5 ml.
3. Continuare l'incubazione delle cellule rimanenti dai pozzi 2-4 a 37°C, 5% CO₂. Saranno analizzati il giorno 5 per studiare gli effetti a lungo termine della stimolazione sul ciclo cellulare.
4. Centrifugare i tubi a 370 x g per 7 min a 10°C. Scartare i supernatanti.
5. Aggiungere 100 μL di miscela di anticorpi (vedere Tabella 1) a ciascun tubo.

Tabella 1: Composizione della miscela di anticorpi. Quattro cocktail di anticorpi che utilizzano coniugati fluorescenti anticorpali concentrati e HBSS.

6. Incubare i tubi per 20 minuti sul ghiaccio al buio.
7. Aggiungere 1 mL di HBSS 2%FCS e centrifugare i tubi a 370 x g per 7 min a 10°C.
8. Scartare il surnatante e risuspenare il pellet in 200 μL di HBSS 2% FCS.
9. Trasferire i pellet riaspendati in nuovi tubi FACS etichettati.
10. Valutare la proliferazione delle cellule T utilizzando FACS.
11. Il giorno 5, ripetere il processo di colorazione cellulare con le cellule dai restanti due pozzi della piastra a 6 pozzi.

6. Analisi dei dati

1. Aprire il software "FlowJo" e trascinare i file nella finestra "Tutti di esempio".
2. Fare doppio clic sul file per le celle non stimolate raccolte il giorno 3 per visualizzare un dot plot con dispersione in avanti sull'asse Y e dispersione laterale sull'asse X.
3. Clicca su"Polygon"e crea una strategia di gating per selezionare le cellule linfoidi, Thy1.2⁺ CD3⁺ cellule e distinguere le cellule CD4⁺ e CD8⁺ (vedi Figura 1).

Figura 1: Strategia di Gating. Le cellule vengono prima recintate in base alla loro morfologia (a sinistra: FSC-A, SSC-A). Le cellule T vengono quindi gated (al centro: CD3, Thy1.2) e ulteriormente divise su cellule CD4⁺ T (arancione) e cd8⁺ T (blu) (a destra: CD4, CD8). Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

4. Ripetere i passaggi con altri file.
5. Per determinare le frequenze delle celle in divisione e non in divisione, visualizzare prima le popolazioni cellulari facendo clic su "Editor di layout".
6. Trascinare le celle T CD4 e CD8 T da ciascuna delle quattro provette nella finestra "Tutti i campioni"
7. Appariranno grafici che rappresentano ogni popolazione.
8. Usa l'istogramma per visualizzare i risultati e seleziona "CFSE" come parametro per il confronto dei diversi tubi e delle diverse popolazioni.
9. Le cellule non in divisione mantengono livelli più elevati di CFSE, mentre le cellule proliferanti dividono il contenuto di CFSE in cellule in divisione
10. Create un cancello su celle non divisorie e applicatelo in tutti i tubi.
11. Create un cancello sulle celle divisorie e applicatelo in tutti i tubi.
12. Per esaminare la frequenza di divisione delle celle CD3+, fare clic su "Editor tabelle".
13. Trascinare le popolazioni di interesse - dividendo le cellule T CD8 e dividendo le cellule T CD4 - in "Tabella".
14. Nel menu"Statistiche",seleziona"Frequenza delle cellule T",quindi fai clic su"Crea tabella"per visualizzare la frequenza in una nuova tabella.
15. Clicca su"Crea tabella". Per visualizzare i valori di frequenza, visualizzateli in una nuova tabella.