細胞周期分析:CFSE染色と流れサイトメトリーを用いた刺激後のCD4およびCD8 T細胞増殖の評価

1. 準備

1. 始め始めの前に、実験室の手袋と適切な防護服を着用してください。
2. すべての解剖ツールを殺菌し、まず洗剤で、次に70%のエタノールで乾燥させ、完全に拭き取ります。
3. 2%の胎児子牛血清(FCS)を含むハンクのバランス塩溶液(HBSS)の50 mLを調調します。

2. 解剖

1. 二酸化炭素送達システムを用いて、低酸素症でマウスを安楽死させる。サパンの位置の解剖プレート上で安楽死マウスを固定し、はさみと鉗子を使用して縦開腹術を行います。
2. 鉗子を使用して、腹部の右側に腸と胃を動かして胃と脾臓を露出させる。脾臓は胃に付着している。
3. 鉗子を使用して慎重に胃から脾臓を取り外し、HBSS 2%FCSの5 mLを含むペトリ皿に入れます。

3. 免疫細胞分離

1. 脾臓を40μmのセルストレーナーの上に置き、同じペトリ皿の上に置きます。脾臓をプランジャーでつぶして解離します。
2. 解離した脾臓と流体を15 mL遠心管に移します。
3. チューブを10°Cで7分間370 x gで遠心し、ペレットを避けて上清を捨てます。
4. 赤血球をlyseseにアセテートカリウムの2mLで再濁させる。2 分間待ってから、HBSS 2% FCS を使用して最大 15 mL の音量を構成します。
5. 10°Cで7分間370 x gでチューブを再度遠心分離します。上清を廃棄し、HBSS 2%FCSの5 mLでペレットを再懸濁します。
6. トリパンブルー染色アッセイを使用して細胞をカウントし、HBSS 2%FCSの適切な体積を使用して、最終的な細胞濃度を10⁷細胞/mLに調整します。

4. CFSE染色とT細胞刺激

1. 10⁷の単離された脾臓細胞/管を4つの管に分配する(15 mL管、標識1から4)
2. 各チューブに 3 mL HBSS 2% FCS を追加します。
3. 各チューブにCSFEの1 μLを加えます(最終濃度- 5 μM)。
4. 5%CO₂インキュベーターで37°Cのチューブを10分間インキュベートします。
5. チューブ3および4では、2.5 μg/mLの最終濃度でHBSS 2%FCS+抗CD3抗体の12mLを添加する。チューブ3および4は、抗CD3抗体を用いて刺激され、細胞周期に及ぼす影響を観察する。
6. チューブ1および2では、HBSS 2%FCSの12 mLを追加します。チューブ1および2内の細胞は刺激されない。
7. 10°Cで7分間370 x gですべての管を遠心分離します。上清を捨てる。
8. HBSS 2%FCSの2 mLでペレットを再中断します。
9. 得られた溶液を6ウェルプレート上の別々のウェルに移します。
10. 細胞を37°C、5%CO2で3日間インキュベートします。

5. 細胞染色

1. 3日目に、ウェル1と3に2 mL HBSS 2%FCSを追加します。
2. ピペットを活発に、サンプルを5 mL FACSチューブに移します。
3. 37°Cでウェル2-4から残りの細胞をインキュベートし続けます, 5% CO₂.彼らは、細胞周期に対する刺激の長期的な影響を調査するために5日目に分析されます。
4. 10°Cで7分間370 x gで管を遠心分離します。上清を捨てる。
5. 各チューブに100μLの抗体ミックス(表1参照)を追加します。

表 1:抗体混合組成物。濃縮抗体蛍光コンジュゲートおよびHBSSを用いた4つの抗体カクテル製剤。

6. 暗闇の中で氷の上で20分間チューブをインキュベートします。
7. HBSS 2%FCSの1 mLを追加し、10°Cで7分間370 x gでチューブを遠心分離します。
8. 上清を廃棄し、HBSS 2% FCSの200 μLでペレットを再懸濁します。
9. 再懸濁ペレットを新しいラベル付き FACS チューブに移します。
10. FACSを用いてT細胞増殖を評価する。
11. 5日目に、6ウェルプレートの残りの2つのウェルからの細胞と細胞染色プロセスを繰り返す。

6. データ分析

1. "FlowJo"ソフトウェアを開き、ファイルを [すべてのサンプル"ウィンドウにドラッグします。
2. 3 日目に収集された非刺激セルのファイルをダブルクリックすると、Y 軸に前方散布を持つドット プロットと X 軸のサイド 散布が表示されます。
3. 「ポリゴン」をクリックし、リンパ球細胞、Thy1.2⁺ CD3 +細胞を選択し、CD4⁺およびCD8 ⁺細胞を区別するゲーティング戦略を作成します(図1参照)。

図1:ゲーティング戦略。細胞は、まず形態に基づいてゲートされます(左:FSC-A、SSC-A)。次いでT細胞(中央:CD3、Thy1.2)をゲートし、^{さらにCD4+T}細胞(オレンジ色)とCD8+T細胞(青)に分割する(右:CD4、CD8)。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

4. 他のファイルと同じ手順を繰り返します。
5. 分割セルと非分割セルの頻度を決定するには、まず [レイアウト エディタ]をクリックしてセルの母集団を視覚化します。
6. CD4 T セルと CD8 T セルを 4 つのチューブのそれぞれから "すべてのサンプル ウィンドウ"にドラッグします。
7. 各母集団を表すグラフが表示されます。
8. ヒストグラムを使用して結果を視覚化し、異なるチューブと異なる母集団を比較するためのパラメータとして"CFSE"を選択します。
9. 非分裂細胞はCFSEの高いレベルを維持するのに対し、増殖細胞はCFSEの含有量を分裂細胞に分割する
10. 非分割セルにゲートを作成し、すべてのチューブに適用します。
11. 分割セルにゲートを作成し、すべてのチューブに適用します。
12. CD3+ セルを分割する頻度を調べるには、"テーブル エディタ"をクリックします。
13. 目的の集団をドラッグ - CD8 T細胞を分割し、CD4 T細胞を分割 - "テーブル"に分割します。
14. [統計]メニューで[T セルの頻度]を選択し、[テーブルを作成]をクリックして新しいテーブルの頻度を表示します。
15. [テーブルの作成]をクリックします。周波数値を表示するには、新しいテーブルに表示します。