Die Autoren bedanken sich bei Dr. danken. Rick Ryan, Umesh Patel, Jeff Till, Matthew Hsu, Jehangir Mistry und Michele Hatler für die Unterstützung während der Entwicklung dieser Projekte und Protokolle.

Cell Preparation: <ol><li> Vor Zellaussaat für Test-, Kultur-Neuronen / Astrozyten in Nährmedien bis ~ 70-80% konfluent (es sei denn, Zellaussaat direkt vom Tauwetter oder Isolation). </li><li> Lösen Sie Zellen aus Kulturflaschen / Platten über geeignete Methode für Zelltyp von Interesse. Wenn nötig, zu beschichten Assayplatte Brunnen mit Poly-D-Lysin oder extrazellulären Matrix-Proteins zu verbessern Zelladhäsion. Co-Kulturen von Astrozyten und Neuronen können gleichzeitig oder nacheinander ausgesät werden. Für die sequentiellen Setzliste ist plating von Astrozyten zunächst als &quot;basal&quot; Schicht empfohlen, gefolgt von neuronalen Beschichtung und Differenzierung, wenn nötig. Passen Zelldichte gegebenenfalls für die Zell-Typ, nachfolgende Kultur der Zeit, Parameter von Interesse, etc. Je nach Kultur Alters-, Zell-Quelle und Aussaatdichte, können primäre Kulturen sehr unterschiedlich in Proliferationsrate, GFAP Ausdruck oder Neuritenwachstum - ist es wichtig, charakterisieren und optimieren Sie Ihre Zellsystem zu den biologischen Relevanz für Ihre experimentellen Modell, als auch für eine effektive Bildverarbeitung, Segmentierung und Analyse mit HCS (siehe Abbildung 1) bereitzustellen. Nach Hinzufügen von Zellen zu Platte (Zellen können in 90 ul Medien ausgesät werden, um Toxin-Behandlung zu erleichtern, wie in Schritt 3 beschrieben), ermöglichen Platte auf einer ebenen Fläche bei Raumtemperatur stehen lassen für 15-30 min, so dass auch Zellverteilung. Nach dieser Zeit inkubieren Zellen in Wachstumsmedium (37 ° C / 5% CO 2) für mindestens 24 Stunden, dann die Differenzierung Kulturbedingungen Schalter (zB niedrige Serum / NGF für PC12-Zellen), als angemessen. Weiter Kultur, bis die Zellen gewünschte Zusammenfluss oder Differenzierung zu erreichen, wechselnden Medien angemessenen Abständen Zelltyp. </li><li> Zell-Therapien (Kontrolle Verbindungen, Testverbindungen, etc.) können an jedem Punkt in dieser Kultur Frist eingeführt werden, je nach Zeit-Verlauf der Behandlung von Interesse. Acrylamid, Wasserstoffperoxid und K-252a als neurotoxische Kontrolle Verbindungen zur Verfügung gestellt. Ausreichende Reagenzien sind für die doppelte 12-Punkte-Dosis-Wirkungs-Kurven (einschließlich eines dH 2 O oder DMSO-Kontrolle gesetzt innerhalb der Dosis-Wirkungs-) für alle fünf 96-Well-Platten zur Verfügung gestellt. Die Verbindungen sind bei 250X-Konzentration (für K-252a, der Annahme einer maximalen Behandlung von 1 nM) oder 10X (für Acrylamid und Wasserstoffperoxid von einer maximalen Behandlungen von 100 mM und 10 mM bzw.) zur Verfügung gestellt. Empfohlene Behandlung Vorbereitung umfasst Halb-log (1: √ 10) Verdünnungsreihe des 250X Verbindung in DMSO, durch Verdünnung in Verbindung Verdünnungspuffer zu folgen 10X (10X Kontrolle Verbindungen mit Ursprung in dH 2 O kann seriell verdünnt direkt in sterile dH 2 O oder Compound Verdünnungspuffer). 10 ul jeder Behandlung kann dann die 90 ul von Kulturmedien bereits in jede Vertiefung gegeben werden, für eine endgültige 1X-Konzentration (0,4% DMSO oder 10% dH 2 O). Sample-Daten ist für 24 oder 96 Stunden der Verbindung der Behandlung bei 37 ° C vor der Fixierung zur Verfügung gestellt. </li></ol> Zellfixierung und Immunfluoreszenzfärbung: Hinweis: Die Färbung beträgt ~ 2,5 Stunden nach der Fixierung. Nicht in die Brunnen austrocknen zwischen Färbeschritte. Aspiration und Dispensation von Reagenzien sollten bei niedrigen Strömungsgeschwindigkeiten durchgeführt werden, um eine beliebige Zelle Verlust durch Fluidscherung verringern. Alle empfohlenen &quot;pro Well &#39;Volumina beziehen sich auf einen einzigen Vertiefung einer 96-well Mikroplatten. Alle empfohlenen &quot;pro 96-Well-Platte &#39;Bände enthalten 25% Selbstbeteiligung für Liquid-Handling-Volumen Verlust. Alle Färbung Schritte sind bei Raumtemperatur (RT) durchgeführt. Alle Puffer und Antikörper-Lösungen sind für mindestens 24 Stunden bei RT stabil. <ol start="4"><li> Am Ende der Kulturzeit, pre-warm HCS Fixation Solution (2X) auf Raumtemperatur (RT) oder 37 º C, falls gewünscht (12 mL/96-well Platte). In einem Laborabzug, 100 l / well direkt auf Nährböden und lassen Sie sie für 30 min bei RT fixieren. Entfernen Fixativ / Toxin-haltigen Medien und entsorgen unter Einhaltung von Vorschriften für gefährliche Abfälle (siehe Sicherheitsdatenblatt). Wenn Sie fortfahren sofort Färbung, die jeweils gut ausspülen zweimal mit 200 ul der HCS Immunfluoreszenz Buffer. Alternativ, wenn die Platten zu einem späteren Zeitpunkt gebeizt werden, zweimal gründlich mit 200 ul Waschpuffer, dann lassen Sie zweiten Spülung Volumen in Brunnen und speichern Platten dicht bei 4 º C bis Färbung versiegelt. </li><li> Wenn festen Proben bei 4 º C vor dem Färben gespeichert wurden, zweimal gründlich mit 200 ul HCS Immunfluoreszenz Buffer, bevor Sie mit Färbeprotokoll. </li><li> Bereiten Sie arbeiten Lösung von Kaninchen Anti-βIII Tubulin / Mouse Anti-GFAP HCS Primärantikörper (6 mL/96-well Platte) wie folgt: Fügen Sie 60 ul jeder aufgetaut Primärantikörper bis 5,88 ml HCS Immunfluoreszenz Buffer. Gut mischen. Entfernen Sie ältere Immunfluoreszenz Buffer spülen. Dann werden 50 ul der Primary Antibody-Lösung in jede Vertiefung und inkubieren für 1 Stunde bei RT. </li><li> Entfernen des primären AntikörpersLösung. Spülen Sie dreimal mit 200 ul HCS Immunfluoreszenz Buffer. </li><li> Bereiten Sie arbeiten Lösung von HCS Sekundäre Antikörper / Hoechst HCS Kernfärbung (6 mL/96-well Platte) wie folgt: Fügen Sie 30 ul jeder aufgetaut sekundären Antikörper und 30 ul aufgetauten Hoechst HCS Kernfärbung zu 5,91 ml HCS Immunfluoreszenz Buffer. Gut mischen, Schutz-Lösung von Licht. Entfernen Sie ältere HCS Immunfluoreszenz Buffer spülen. Dann werden 50 ul der HCS Sekundäre Antikörper / Hoechst HCS Nuclear Stain-Lösung und Inkubation für 1 Stunde bei RT vor Licht geschützt. </li><li> Entfernen HCS Sekundäre Antikörper / Hoechst HCS Kernfärbung Lösung. Spülen Sie zweimal mit 200 ul HCS Immunfluoreszenz Buffer. </li><li> Entfernen Sie ältere HCS Immunfluoreszenz Buffer spülen. Spülen Sie zweimal mit 200 ul der HCS Waschpuffer, verlassen zweiten Spülung Volumen in Brunnen. </li><li> Seal Platte und Bild sofort oder zu speichern Platte bei 4 º C vor Licht, bis sie zur Bildgebung geschützt. </li></ol> Image Acquisition and Analysis: <ol start="12"><li> Imaging und Analyse von gefärbten Platten können von einer Vielzahl von verfügbaren HCS-Plattformen, einschließlich der IN Cell Analyzer (GE Healthcare), ArrayScan (ThermoFisher Scientific) oder Opera (Perkin Elmer) durchgeführt werden. Einige Leitlinien für die Bildgebung und Analyse sind in Tabelle 1 angegeben: </li></ol><table border="1" cellspacing="0" cellpadding="0"><tbody><tr><td style="background:#000000; color:#FFFFFF;" colspan="4"> HCS222 Image Acquisition Richtlinien </td></tr><tr><td> Nachweisreagenz </td><td> Objektivdurchmesser </td><td> Anregungsfilter Range [peak / Bandbreite (nm)] </td><td> Emission Filter Range [peak / Bandbreite (nm)] </td></tr><tr><td> Hoechst HCS Kernfärbung </td><td> 20X </td><td> 360/40 </td><td> 460/40 (oder 535/50 falls erforderlich) </td></tr><tr><td> HCS Sekundäre Antikörper, FITC-Donkey anti-Rabbit IgG </td><td> 20X </td><td> 480/40 </td><td> 535/50 </td></tr><tr><td> HCS Sekundäre Antikörper, Cy3-Donkey anti-Mouse IgG </td><td> 20X </td><td> 535/50 </td><td> 600/50 </td></tr></tbody></table> <table border="1" cellspacing="0" cellpadding="0"><tbody><tr><td style="background:#000000; color:#FFFFFF;" colspan="4" width="545"> HCS222 Image Analysis Richtlinien </td></tr><tr><td> Zellparameter </td><td> Erkennung </td><td> Segmentation / Measurement </td><td> Gründe </td></tr><tr><td> Zellzahl, Nuclear Eigenschaften </td><td> Hoechst HCS Kernfärbung </td><td> Nuclear Region (460 nm-Emission-Kanal). Count Anzahl der Kerne. DNA-Gehalt (nuclear Intensität) oder nuklearen Bereich Analysen sind ebenfalls möglich. </td><td> Verwenden Sie Zellzahl, nukleare Eigenschaften Zellverlust, Toxizität Phänotypen, etc. bestimmen kann &quot;Filter&quot; Kerne für Menschen mit βIII-Tubulin oder GFAP Expression assoziiert zu trennen neuronalen und astrozytären Zellzahlen / Charakterisierungen (dringend empfohlen) zu erhalten. </td></tr><tr><td> βIII-Tubulin Expression, Neuritenwachstum </td><td> HCS Sekundäre Antikörper, FITC-konjugierten </td><td> Cytoplasmatische Region (535 nm-Emission-Kanal). FITC-Signal kann verwendet werden, um neuronale Zellkörper von Neuriten (zB via Minimum / Durchschnitt Zellkörper Bereichen, Minimum / Maximum Neuriten Längen und Breiten) zu unterscheiden. Bestimmen Sie Parameter wie insgesamt Neuritenlänge, Neuriten counts / Zelle, etc. </td><td> Neuritenwachstum Messungen können während der neuronalen Differenzierung oder als Folge von chemischen Verletzungen, Erkrankungen, etc. moduliert Kann &quot;filtern&quot; Zellkörper für Menschen mit βIII-Tubulin-Expression assoziiert zu verschiedenen neuronalen Charakterisierung (dringend empfohlen) zu erhalten. </td></tr><tr><td> GFAP Expression, Astrocyte Bereich </td><td> HCS Sekundäre Antikörper, Cy3-konjugierten </td><td> Cytoplasmatische Region (600 nm-Emission-Kanal). Cy3-Signal kann verwendet werden, um astrozytären zytoplasmatische Segmentierung zu definieren. Bestimmen Sie Parameter wie mittlere zytoplasmatische Signalintensität, Zellfläche, etc. </td><td> GFAP Expression und Astrozyten Zellfläche kann während Astrozyten Entwicklung oder als Folge von chemischen Verletzungen, Erkrankungen moduliert, etc. Kann &quot;filtern&quot; Zellkörper für die mit GFAP-Expression assoziiert zu deutlichen astrozytären Charakterisierung (dringend empfohlen) zu erhalten. </td></tr></tbody></table> . Tabelle 1 Image Acquisition and Analysis Guidelines - HCS222 βIII-Tubulin/GFAP (Co-Kultur) Assay Repräsentative Ergebnisse: <img src="/files/ftp_upload/1173/figure31173.png" alt="Abbildung 3" /> Abbildung 1. βIII-Tubulin und GFAP immunofluoreScence gemischter Ratte neuronalen Zellkulturen. Co-Kulturen von primären Ratten-Hippocampus Astrozyten entweder mit primären Ratten-Neuronen im Hippocampus oder Ratte PC12 Zellen wurden durch Vor-Vernickelung Astrozyten für mehrere Tage in Kultur, durch neuronale Aussaat folgte generiert. Primäre Neuronen wurden für weitere 11 Tage kultiviert, während PC12s für weitere 2 Tage unter Differenzierung Bedingungen (niedrige Serum / NGF) kultiviert wurden. Handhabung von Zellen, Fixierung und Immunfärbung wurden nach HCS222 Assayprotokolle durchgeführt. Die Zellen wurden auf der GE IN Cell Analyzer 1000 (3.3) bei 20-fach (primären Neuronen) oder 10X (PC12) Objektivvergrößerung abgebildet und analysiert werden mit dem GE IN Cell Analyzer 1000 Workstation (3,4) Neuritenwachstum und Multi Target-Analyse-Algorithmen Top-Panel.: Fused Bilder von Hoechst HCS Kernfärbung (blau), βIII-Tubulin (grün) und GFAP (rot) Fluoreszenz. Eine getrennte Analyse der βIII-Tubulin-Fluoreszenz-Kanal ermöglicht Neuritenwachstum Segmentierung (mittlere Tafel: Zellkörper in blau (primären Neuronen beschrieben) oder gelb (PC12), Neuriten in grün (primären Neuronen) oder hellblau (PC12)). Die Analyse der GFAP-Kanal ermöglicht Astrozyten Segmentierung (unten: Kerne in blau, Zytoplasma in grün dargestellt). GFAP-Segmentierung für die primären Ratten-Hippocampus Neuronen / Astrozyten Co-Kultur zeigt die Fähigkeit, zwischen den Kernen / Zellkörper, dass GFAP (+) (Grün Umrisse) und diejenigen, die GFAP sind zu unterscheiden (-) (rot), so dass getrennte Zellzahlen für Neuronen und Astrozyten in einer Mischkultur Einstellung. <img src="/files/ftp_upload/1173/figure41173.png" alt="Abbildung 4" /> <img src="/files/ftp_upload/1173/figure4.51173.png" alt="Abbildung 4 part2" /> Abbildung 2. Dose Reaktionen der primären Ratten-Hippocampus Neuronen / Astrozyten Co-Kulturen zu toxischen Belastungen. Primäre Ratten-Hippocampus Astrozyten (P6) wurden auf 96-Well-Platten in Nährmedien ausgestrichen und kultiviert für 6 Tage. Primäre Ratten-Neuronen im Hippocampus (direkt von Tauwetter) wurden dann auf der Oberseite der zuvor abgeschiedenen Astrozyten ausgesät und kultiviert in Nährmedien für 11 Tage. Die Zellen wurden mit seriellen Verdünnungen von Acrylamid oder Wasserstoffperoxid (max. Konzentration = 100mm und 10mm bezeichnet) für die letzten 24 Stunden der Kultur behandelt. Handhabung von Zellen, Fixierung und Immunfärbung wurden nach HCS222 Assayprotokolle durchgeführt. Die Zellen wurden auf der GE IN Cell Analyzer 1000 (3.3) bei 20X (10 Felder / well) abgebildet und analysiert (nuklearen / cytoplasmatischen / Neuriten Segmentierung) mit der GE IN Cell Analyzer 1000 Workstation (3,4) Neuritenwachstum und Multi Target-Analyse-Algorithmen. Die vorgelegten Daten sind Mittelwert ± SEM, n = 3. Mehrere Parameter (Neuritenwachstum, GFAP Intensität, Astrozyten und neuronalen Bereich oder astrozytären Zellzahl) wurden für eine dosisabhängige Trends untersucht.

<ol>
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W., Chan-Ling, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phenotypic+characterization+of+neural+stem+cells+from+human+fetal+spinal+cord:+synergistic+effect+of+LIF+and+BMP4+to+generate+astrocytes.">Phenotypic characterization of neural stem cells from human fetal spinal cord: synergistic effect of LIF and BMP4 to generate astrocytes.</a> Glia. 55, 1156-1168 (2007).</li><li>Casulari, L. A., Melcangi, R. 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Die Autoren sind alle Mitarbeiter der Millipore Corporation.

Bis heute wurden in vitro Experimente zur Neurotoxizität Risikobewertung mit gemischten Kulturen von Neuronen und Astrozyten Studie beschränkt. Es ist gut angenommen, dass Gliazellen integraler bei der Bereitstellung von Raum-und Stoffwechsel-Unterstützung Neuronen sind, und spielen eine entscheidende Rolle bei der Modulation der neuronalen mehrere Funktionen, einschließlich neuronalen Migration, Differenzierung und synaptische Aktivität. Gliazellen Astrozyten auch setzen Zytokine und andere lösliche Faktoren, die in der Lage sowohl induzieren unerwünschten Reaktionen in der Umgebung neuronales Gewebe, sowie die Förderung der neuronalen Toleranz vieler Giftstoffe. Demonstration der Tiefe des neuronal-glialen Interaktionen, in Co-Kultur-Studien haben gezeigt, dass Astrozyten Neuronen gegen die Toxizität von oxidativem Stress zu schützen, während Beeinträchtigung der Astrozyten-Funktionen, wie die Instandhaltung von antioxidativen Abwehr und zellulären Energie, hat sich gezeigt, entscheidend beeinflussen neuronale Überleben. Neuere Studien legen nahe, dass die Verwendung von Astrozyten in einem in vitro Neurotoxizität Testsystem kann sich als relevant für die menschliche Zentralnervensystem Struktur und Funktion neuronaler Zellen als allein. Trotz des wachsenden Bewusstseins über die physiologische Bedeutung der neuronalen-astrozytären Interaktionen, ist es bislang schwierig, quantitative Analysen dieser Interaktionen in intakten Zellen durchzuführen. Das Aufkommen von High Content Screening ermöglicht die Entwicklung von leistungsstarken neuen Assays an diese Adresse. In dieser Studie haben wir gezeigt, dass quantitative Analysen von mehreren neuronalen und astrozytären Phänotypen in einem einzigen Assay ermöglicht werden, indem HCA. In primären Neuronen haben wir quantitative Messungen der Neurotoxizität Marker wie neuronale Zahl, Neuriten zählen und Neuritenlänge durchgeführt. In Astrozyten, ist reaktive Gliose einen bekannten Biomarker für Neurotoxizität, durch Veränderungen in GFAP-Expression, Astrozyten Anzahl und Astrozyten Morphologie charakterisiert. Wir haben gezeigt, dass jeder von diesen Endpunkten ohne weiteres über HCA beurteilt werden. Diese Studien unterstützen das Konzept, dass HCA von neural-spezifischen Biomarkern als Teil einer Batterie konnte in vitro-Tests verwendet werden, um schnell Bildschirm eine große Anzahl von Chemikalien für die neurotoxischen Endpunkte. Millipore ist HCS222 High Content Analyse-Kit für Co-Kultur von Neuronen und Astrozyten ist aus hochwertigem Nachweisreagenzien und Protokolle für die gleichzeitige Profilierung βIII-Tubulin und sauren Gliafaserproteins (GFAP) in einer Vielzahl von zellulären Modellen der Neurotoxizität zusammen. Die hoch-validierte Reagenzien dieses Kits erlauben dem Benutzer, Tests zu standardisieren, zu minimieren Assay-to-Assay-Variabilität und reproduzierbar zu erzeugen Bilder mit einem hohen Signal-zu-Untergrund-Verhältnis.

<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Rabbit Anti-&#x03B2;III-Tubulin HCS Primary Antibody, 100X</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Part No. CS201672</td>
<td>1 vial containing 300 &micro;L 
Millipore HCS222 Kit Component</td>
</tr>
<tr>
<td>HCS Secondary Antibody (donkey anti-rabbit IgG, FITC conjugate), 200X</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Part No. CS201649</td>
<td>1 vial containing 150 &micro;L Millipore HCS222 Kit Component</td>
</tr>
<tr>
<td>Mouse Anti-GFAP HCS Primary Antibody, 100X</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Part No. CS201671</td>
<td>1 vial containing 300 &micro;L Millipore HCS222 Kit Component</td>
</tr>
<tr>
<td>HCS Secondary Antibody (donkey anti-mouse IgG, Cy3 conjugate), 200X</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Part No. CS200437</td>
<td>1 vial containing 150 &micro;L Millipore HCS222 Kit Component</td>
</tr>
<tr>
<td>Hoechst HCS Nuclear Stain, 200X</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Part No. CS200438</td>
<td>1 vial containing 150 &micro;L Millipore HCS222 Kit Component</td>
</tr>
<tr>
<td>HCS Fixation Solution with Phenol Red, 2X</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Part No. CS200434</td>
<td>1 bottle containing 100 mL Millipore HCS222 Kit Component</td>
</tr>
<tr>
<td>HCS Immunofluorescence Buffer, 1X</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Part No. CS200435</td>
<td>1 bottle containing 1000 mL Millipore HCS222 Kit Component</td>
</tr>
<tr>
<td>HCS Wash Buffer, 1X</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Part No. 2007643</td>
<td>1 bottle containing 500 mL Millipore HCS222 Kit Components</td>
</tr>
<tr>
<td>Acrylamide (Control Compound), 10X</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Part No. CS201679</td>
<td>1 vial containing 500 &micro;L of 1M acrylamide in dH2O Millipore HCS222 Kit Component</td>
</tr>
<tr>
<td>Hydrogen Peroxide (Control Compound), 10X</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Part No. CS201730</td>
<td>1 vial containing 500 &micro;L of 100 mM hydrogen peroxide in dH2O Millipore HCS222 Kit Components</td>
</tr>
<tr>
<td>K-252a (Control Compound), 250X</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Part No. CS201741</td>
<td>1 vial containing 100 &micro;L of 250 &micro;M K-252a in DMSO Millipore HCS222 Kit Component</td>
</tr>
<tr>
<td>DMSO for Compound Serial Dilution</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Part No. CS200441</td>
<td>1 bottle containing 10 mL Millipore HCS222 Kit Component</td>
</tr>
<tr>
<td>Compound Dilution Buffer</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Part No. CS200442</td>
<td>1 bottle containing 25 mL Millipore HCS222 Kit Component</td>
</tr>
<tr>
<td>Plate Sealers</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Part No. CS200443</td>
<td>10 each Millipore HCS222 Kit Components</td>
</tr>
<tr>
<td>tissue culture-treated black/clear bottom microplates </td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>HCS imaging/analysis system</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>

a neuronal and astrocyte co-culture assay for high content analysis of neurotoxicity

High Content Analyse (HCA)-Assays kombinieren Zellen und Nachweisreagenzien mit Automated Imaging und leistungsfähige Bildanalyse-Algorithmen, so dass die Messung von mehreren zellulären Phänotypen in einem einzigen Assay. In dieser Studie verwendeten wir HCA eine neuartige Assays für Neurotoxizität zu entwickeln. Neurotoxicity Bewertung stellt einen wichtigen Teil der Bewertung der Arzneimittelsicherheit, wie auch als ein wichtiger Schwerpunkt der Bemühungen im Umweltschutz. Darüber hinaus ist Neurotoxizität auch ein gut angenommen<em&gt; In-vitro-</em&gt; Marker für die Entwicklung von neurodegenerativen Erkrankungen wie Alzheimer und Parkinson. Vor kurzem hat die Anwendung von HCA zu neuronalen Screening berichtet worden. Durch die Kennzeichnung neuronalen Zellen mit βIII-Tubulin, können HCA Untersuchungen liefern hohen Durchsatz, nicht subjektiv, quantitative Messungen von Parametern wie neuronale Zahl, Neuriten zählen und Neuritenlänge, von denen alle neurotoxische Wirkungen hinweisen können. Allerdings bleibt die Rolle der Astrozyten in diesen Modellen unerforscht. Astrozyten sind eine wesentliche Rolle bei der Aufrechterhaltung des zentralen Nervensystems (ZNS) Homöostase, und sind sowohl mit Neuroprotektion und neurodegradation, wenn sie als Reaktion auf toxische Substanzen oder Erkrankungen aktiviert sind verbunden. GFAP ist ein Zwischenprodukt Filament Protein vorwiegend in den Astrozyten des ZNS exprimiert. Astrozytäre Aktivierung (Gliose) führt zur Hochregulation von GFAP, häufig von Astrozyten Proliferation und Hypertrophie begleitet. Dieser Prozess der reaktiven Gliose ist als ein früher Marker der Schädigung des Nervensystems vorgeschlagen worden. Die traditionelle Methode zur Quantifizierung GFAP wird durch Immunoassay. Dieser Ansatz wird durch die Unfähigkeit, Informationen über die zelluläre Lokalisation, Morphologie und Zellzahl bieten begrenzt. Wir haben festgestellt, dass HCA verwendet werden könnten, um diese Einschränkungen zu überwinden und gleichzeitig zu messen mehrere Funktionen mit Gliose in Verbindung gebracht werden - Veränderungen in GFAP-Expression, Astrozyten Hypertrophie und Astrozyten Verbreitung - in einem einzigen Assay. In Co-Kultur-Studien haben gezeigt, dass Astrozyten Neuronen gegen verschiedene Arten von toxischen Beleidigung zu schützen und entscheidend beeinflussen neuronale Überleben. Neuere Studien legen nahe, dass die Verwendung von Astrozyten in einer<em&gt; In-vitro-</em&gt; Neurotoxizität Testsystem kann sich als relevant für die menschliche ZNS-Struktur und Funktion neuronaler Zellen als allein. Dementsprechend haben wir eine HCA Test für Co-Kultur von Neuronen und Astrozyten entwickelt, bestehend aus Protokollen und validiert, target-spezifischen Nachweisreagenzien zur Profilierung βIII-Tubulin und sauren Gliafaserproteins (GFAP). Dieser Assay ermöglicht die gleichzeitige Analyse von Neurotoxizität, Neuritenwachstum, Gliose, neuronale und astrozytären Morphologie und neuronalen und astrozytären Entwicklung in einer Vielzahl von zellulären Modellen, was einem neuartigen, nicht-subjektive, High-Throughput-Assay für Neurotoxizität Beurteilung. Der Test birgt ein großes Potenzial für eine verbesserte Erkennung von Neurotoxizität und eine verbesserte Produktivität der neurowissenschaftlichen Forschung und Wirkstoffentwicklung.

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A Neuronal and Astrocyte Co-Culture Assay for High Content Analysis of Neurotoxicity

Dieser Artikel beschreibt ein neuartiges Protokoll und Reagenz-Set für empfindliche Messung der neurotoxischen Wirkungen von Verbindungen und Behandlungen auf Co-Kulturen von Neuronen und Astrozyten mit High Content Analyse entwickelt. Die Ergebnisse zeigen, dass High Content Analyse eine spannende neue Technologie für die Neurotoxizität Beurteilung darstellt.

Eine Neuronale und Astrocyte Co-Kultur-Assay für High Content Analyse der Neurotoxizität

High Content Analysis (HCA) assays combine cells and detection reagents with automated imaging and powerful image analysis algorithms, allowing ...

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Research

JoVE Journal

Biology

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Serie: A Neuronal and Astrocyte Co-Culture Assay for High Content Analysis of Neurotoxicity

Neuronal Cell Cultures from Aplysia for High-Resolution Imaging of Growth Cones

Neuronal growth cones are the highly motile structures at the tip of axons that can detect guidance cues in the environment and transduce this information into directional movement towards the appropriate target cell. To fully understand how guidance information is transmitted from the cell surface to the underlying dynamic cytoskeletal networks, one needs a model system suitable for live cell imaging of protein dynamics at high temporal and spatial resolution. Typical vertebrate growth cones are too small to quantitatively analyze F-actin and microtubule dynamics. Neurons from the sea hare Aplysia californica are 5-10 times larger than vertebrate neurons, can easily be kept at room temperature and are very robust cells for micromanipulation and biophysical measurements. Their growth cones have very defined cytoplasmic regions and a well-described cytoskeletal system. The neuronal cell bodies can be microinjected with a variety of probes for studying growth cone motility and guidance. In the present protocol we demonstrate a procedure for dissection of the abdominal ganglion, culture of bag cell neurons and setting up an imaging chamber for live cell imaging of growth cones.

Aplysia californica neurons develop large growth cones in culture that are excellent for high-resolution imaging of growth cone motility and guidance. Here, we present a protocol for dissection and plating of Aplysia bag cell neurons as well as for setting up a chamber for live cell imaging.

Neuronalen Zellkulturen von Aplysia für High-Resolution Imaging of Growth Cones

Neuronal growth cones are the highly motile structures at the tip of axons that can detect guidance cues in the environment and transduce this information ...

Forschung

Biologie

A Multi-compartment CNS Neuron-glia Co-culture Microfluidic Platform

We present a novel multi-compartment neuron co-culture microsystem platform for in vitro CNS axon-glia interaction research, capable of conducting up to six independent experiments in parallel for higher-throughput. We developed a new fabrication method to create microfluidic devices having both micro and macro scale structures within the same device through a single soft-lithography process, enabling mass fabrication with good repeatability.
The multi-compartment microfluidic co-culture platform is composed of one soma compartment for neurons and six axon/glia compartments for oligodendrocytes (OLs). The soma compartment and axon/glia compartments are connected by arrays of axon-guiding microchannels that function as physical barriers to confine neuronal soma in the soma compartment, while allowing axons to grow into axon/glia compartments. OLs loaded into axon/glia compartments can interact only with axons but not with neuronal soma or dendrites, enabling localized axon-glia interaction studies. The microchannels also enabled fluidic isolation between compartments, allowing six independent experiments to be conducted on a single device for higher throughput.
Soft-lithography using poly(dimethylsiloxane) (PDMS) is a commonly used technique in biomedical microdevices. Reservoirs on these devices are commonly defined by manual punching. Although simple, poor alignment and time consuming nature of the process makes this process not suitable when large numbers of reservoirs have to be repeatedly created. The newly developed method did not require manual punching of reservoirs, overcoming such limitations. First, seven reservoirs (depth: 3.5 mm) were made on a poly(methyl methacrylate) (PMMA) block using a micro-milling machine. Then, arrays of ridge microstructures, fabricated on a glass substrate, were hot-embossed against the PMMA block to define microchannels that connect the soma and axon/glia compartments. This process resulted in macro-scale reservoirs (3.5 mm) and micro-scale channels (2.5 &mu;m) to coincide within a single PMMA master. A PDMS replica that served as a mold master was obtained using soft-lithography and the final PDMS device was replicated from this master.
Primary neurons from E16-18 rats were loaded to the soma compartment and cultured for two weeks. After one week of cell culture, axons crossed microchannels and formed axonal only network layer inside axon/glia compartments. Axons grew uniformly throughout six axon/glia compartments and OLs from P1-2 rats were added to axon/glia compartments at 14 days in vitro for co-culture.

We developed a novel multi-compartment neuron co-culture microsystem platform for in vitro CNS axon-glia interaction research. The platform is capable of conducting up to six independent experiments in parallel and was fabricated using a newly developed macro/micro hybrid fabrication method.

Ein Multi-Kompartiment-ZNS-Neuron-Glia-Co-Kultur mikrofluidischen Plattform

We present a novel multi-compartment neuron co-culture microsystem platform for in vitro CNS axon-glia interaction research, capable of conducting up to ...

Microfluidic Co-culture of Epithelial Cells and Bacteria for Investigating Soluble Signal-mediated Interactions

The human gastrointestinal (GI) tract is a unique environment in which intestinal epithelial cells and non-pathogenic (commensal) bacteria coexist. It has been proposed that the microenvironment that the pathogen encounters in the commensal layer is important in determining the extent of colonization. Current culture methods for investigating pathogen colonization are not well suited for investigating this hypothesis as they do not enable co-culture of bacteria and epithelial cells in a manner that mimics the GI tract microenvironment. Here we describe a microfluidic co-culture model that enables independent culture of eukaryotic cells and bacteria, and testing the effect of the commensal microenvironment on pathogen colonization. The co-culture model is demonstrated by developing a commensal Escherichia coli biofilm among HeLa cells, followed by introduction of enterohemorrhagic E. coli (EHEC) into the commensal island, in a sequence that mimics the sequence of events in GI tract infection.

This protocol describes a microfluidic co-culture model for simultaneous and localized culture of epithelial cells and bacteria. This model can be used for investigating the role of different soluble molecular signals on pathogenesis as well as screen the effectiveness of putative probiotic bacterial strains.

Mikrofluidik-Co-Kultur von Epithelzellen und Bakterien für die Untersuchung Löslich Signal-vermittelte Wechselwirkungen

The human gastrointestinal (GI) tract is a unique environment in which intestinal epithelial cells and non-pathogenic (commensal) bacteria coexist. It has ...

Analysis of Schwann-astrocyte Interactions Using In Vitro Assays

Schwann cells are one of the commonly used cells in repair strategies following spinal cord injuries. Schwann cells are capable of supporting axonal regeneration and sprouting by secreting growth factors 1,2 and providing growth promoting adhesion molecules 3 and extracellular matrix molecules 4. In addition they myelinate the demyelinated axons at the site of injury 5.
However following transplantation, Schwann cells do not migrate from the site of implant and do not intermingle with the host astrocytes 6,7. This results in formation of a sharp boundary between the Schwann cells and astrocytes, creating an obstacle for growing axons trying to exit the graft back into the host tissue proximally and distally. Astrocytes in contact with Schwann cells also undergo hypertrophy and up-regulate the inhibitory molecules 8-13.
In vitro assays have been used to model Schwann cell-astrocyte interactions and have been important in understanding the mechanism underlying the cellular behaviour.
These in vitro assays include boundary assay, where a co-culture is made using two different cells with each cell type occupying different territories with only a small gap separating the two cell fronts. As the cells divide and migrate, the two cellular fronts get closer to each other and finally collide. This allows the behaviour of the two cellular populations to be analyzed at the boundary. Another variation of the same technique is to mix the two cellular populations in culture and over time the two cell types segregate with Schwann cells clumped together as islands in between astrocytes together creating multiple Schwann-astrocyte boundaries.
The second assay used in studying the interaction of two cell types is the migration assay where cellular movement can be tracked on the surface of the other cell type monolayer 14,15. This assay is commonly known as inverted coverslip assay. Schwann cells are cultured on small glass fragments and they are inverted face down onto the surface of astrocyte monolayers and migration is assessed from the edge of coverslip.
Both assays have been instrumental in studying the underlying mechanisms involved in the cellular exclusion and boundary formation. Some of the molecules identified using these techniques include N-Cadherins 15, Chondroitin Sulphate proteoglycans(CSPGs) 16,17, FGF/Heparin 18, Eph/Ephrins19.
This article intends to describe boundary assay and migration assay in stepwise fashion and elucidate the possible technical problems that might occur.

Analysis of Schwann-astrocyte Interactions Using In Vitro Assays

This article intends to describe in stepwise fashion the commonly used in vitro assays used in studying Schwann cell-asrtocyte interactions.

Analyse von Schwann-Astrozyten Wechselwirkungen mit In Vitro Assays

Schwann cells are one of the commonly used cells in repair strategies following spinal cord injuries. Schwann cells are capable of supporting axonal ...

Quantification of dsDNA using the Hitachi F-7000 Fluorescence Spectrophotometer and PicoGreen Dye

Quantification of DNA, especially in small concentrations, is an important task with a wide range of biological applications including standard molecular biology assays such as synthesis and purification of DNA, diagnostic applications such as quantification of DNA amplification products, and detection of DNA molecules in drug preparations. During this video we will demonstrate the capability of the Hitachi F-7000 Fluorescence Spectrophotometer equipped with a Micro Plate Reader accessory to perform dsDNA quantification using Molecular Probes Quant-it PicoGreen dye reagent kit.
The F-7000 Fluorescence Spectrophotometer offers high sensitivity and high speed measurements. It is a highly flexible system capable of measuring fluorescence, luminescence, and phosphorescence. Several measuring modes are available, including wavelength scan, time scan, photometry and 3-D scan measurement. The spectrophotometer has sensitivity in the range of 50 picomoles of fluorescein when using a 300 &#956;L sample volume in the microplate, and is capable of measuring scan speeds of 60,000 nm/minute. It also has a wide dynamic range of up to 5 orders of magnitude which allows for the use of calibration curves over a wide range of concentrations. The optical system uses all reflective optics for maximum energy and sensitivity. The standard wavelength range is 200 to 750 nm, and can be extended to 900 nm when using one of the optional near infrared photomultipliers. The system allows optional temperature control for the plate reader from 5 to 60 degrees Celsius using an optional external temperature controlled liquid circulator. The microplate reader allows for the use of 96 well microplates, and the measuring speed for 96 wells is less than 60 seconds when using the kinetics mode.
Software controls for the F-7000 and Microplate Reader are also highly flexible. Samples may be set in either column or row formats, and any combination of wells may be chosen for sample measurements. This allows for optimal utilization of the microplate. Additionally, the software allows importing micro plate sample configurations created in Excel and saved in comma separated values, or "csv" format. Microplate measuring configurations can be saved and recalled by the software for convenience and increased productivity. Data results can be output to a standard report, to Excel, or to an optional Report Generator Program.

Demonstration of quantification of dsDNA using Molecular Probes PicoGreen dye and Hitachi F-7000 Fluorescence Spectrophotometer equipped with a microplate reader accessory.

Quantifizierung von dsDNA mit dem Hitachi F-7000 Fluoreszenz-Spektralphotometer und PicoGreen Dye

Quantification of DNA, especially in small concentrations, is an important task with a wide range of biological applications including standard molecular ...

Absolute Quantum Yield Measurement of Powder Samples

Measurement of fluorescence quantum yield has become an important tool in the search for new solutions in the development, evaluation, quality control and research of illumination, AV equipment, organic EL material, films, filters and fluorescent probes for bio-industry.
Quantum yield is calculated as the ratio of the number of photons absorbed, to the number of photons emitted by a material. The higher the quantum yield, the better the efficiency of the fluorescent material.
For the measurements featured in this video, we will use the Hitachi F-7000 fluorescence spectrophotometer equipped with the Quantum Yield measuring accessory and Report Generator program. All the information provided applies to this system. 
Measurement of quantum yield in powder samples is performed following these steps:
<ol>
 <li>Generation of instrument correction factors for the excitation and emission monochromators. This is an important requirement for the correct measurement of quantum yield. It has been performed in advance for the full measurement range of the instrument and will not be shown in this video due to time limitations.</li>
 <li>Measurement of integrating sphere correction factors. The purpose of this step is to take into consideration reflectivity characteristics of the integrating sphere used for the measurements.</li>
 <li>Reference and Sample measurement using direct excitation and indirect excitation.</li>
 <li>Quantum Yield calculation using Direct and Indirect excitation. Direct excitation is when the sample is facing directly the excitation beam, which would be the normal measurement setup. However, because we use an integrating sphere, a portion of the emitted photons resulting from the sample fluorescence are reflected by the integrating sphere and will re-excite the sample, so we need to take into consideration indirect excitation. This is accomplished by measuring the sample placed in the port facing the emission monochromator, calculating indirect quantum yield and correcting the direct quantum yield calculation.</li>
 <li>Corrected quantum yield calculation.</li>
 <li>Chromaticity coordinates calculation using Report Generator program.</li>
</ol>
The Hitachi F-7000 Quantum Yield Measurement System offer advantages for this
application, as follows:
<ul>
 <li>High sensitivity (S/N ratio 800 or better RMS). Signal is the Raman band of water measured under the following conditions: Ex wavelength 350 nm, band pass Ex and Em 5 nm, response 2 sec), noise is measured at the maximum of the Raman peak. High sensitivity allows measurement of samples even with low quantum yield. Using this system we have measured quantum yields as low as 0.1 for a sample of salicylic acid and as high as 0.8 for a sample of magnesium tungstate.</li>
 <li>Highly accurate measurement with a dynamic range of 6 orders of magnitude allows for measurements of both sharp scattering peaks with high intensity, as well as broad fluorescence peaks of low intensity under the same conditions. </li>
 <li>High measuring throughput and reduced light exposure to the sample, due to a high scanning speed of up to 60,000 nm/minute and automatic shutter function. </li>
 <li>Measurement of quantum yield over a wide wavelength range from 240 to 800 nm.</li>
 <li>Accurate quantum yield measurements are the result of collecting instrument spectral response and integrating sphere correction factors before measuring the sample.</li>
 <li>Large selection of calculated parameters provided by dedicated and easy to use software.
</li>
</ul> 
During this video we will measure sodium salicylate in powder form which is known to have a quantum yield value of 0.4 to 0.5.

In this video we will demonstrate measuring and calculating absolute quantum yield and chromaticity coordinates directly in powder samples using the Hitachi F-7000 Quantum Yield Measuring System.

Absolute Quantenausbeute Messung von Pulverproben

Measurement of fluorescence quantum yield has become an important tool in the search for new solutions in the development, evaluation, quality control and ...

A High-content Imaging Workflow to Study Grb2 Signaling Complexes by Expression Cloning

Signal transduction by growth factor receptors is essential for cells to maintain proliferation and differentiation and requires tight control. Signal transduction is initiated by binding of an external ligand to a transmembrane receptor and activation of downstream signaling cascades. A key regulator of mitogenic signaling is Grb2, a modular protein composed of an internal SH2 (Src Homology 2) domain flanked by two SH3 domains that lacks enzymatic activity. Grb2 is constitutively associated with the GTPase Son-Of-Sevenless (SOS) via its N-terminal SH3 domain. The SH2 domain of Grb2 binds to growth factor receptors at phosphorylated tyrosine residues thus coupling receptor activation to the SOS-Ras-MAP kinase signaling cascade. In addition, other roles for Grb2 as a positive or negative regulator of signaling and receptor endocytosis have been described. The modular composition of Grb2 suggests that it can dock to a variety of receptors and transduce signals along a multitude of different pathways1-3.
	Described here is a simple microscopy assay that monitors recruitment of Grb2 to the plasma membrane. It is adapted from an assay that measures changes in sub-cellular localization of green-fluorescent protein (GFP)-tagged Grb2 in response to a stimulus4-6. Plasma membrane receptors that bind Grb2 such as activated Epidermal Growth Factor Receptor (EGFR) recruit GFP-Grb2 to the plasma membrane upon cDNA expression and subsequently relocate to endosomal compartments in the cell. In order to identify in vivo protein complexes of Grb2, this technique can be used to perform a genome-wide high-content screen based on changes in Grb2 sub-cellular localization. The preparation of cDNA expression clones, transfection and image acquisition are described in detail below. Compared to other genomic methods used to identify protein interaction partners, such as yeast-two-hybrid, this technique allows the visualization of protein complexes in mammalian cells at the sub-cellular site of interaction by a simple microscopy-based assay. Hence both qualitative features, such as patterns of localization can be assessed, as well as the quantitative strength of the interaction.

A high-content screening method for the identification of novel signaling competent transmembrane receptors is described. This method is amenable to large-scale automation and allows predictions about in vivo protein binding and the sub-cellular localization of protein complexes in mammalian cells.

Ein High-Content-Imaging Workflow Grb2 Signaling-Komplexe durch Expression Cloning Studie

Signal  transduction by growth factor receptors is essential for cells to maintain  proliferation and differentiation and requires tight control. Signal  ...

A High Throughput MHC II Binding Assay for Quantitative Analysis of Peptide Epitopes

Biochemical assays with recombinant human MHC II molecules can provide rapid, quantitative insights into immunogenic epitope identification, deletion, or design1,2. Here, a peptide-MHC II binding assay is scaled to 384-well format. The scaled down protocol reduces reagent costs by 75% and is higher throughput than previously described 96-well protocols1,3-5. Specifically, the experimental design permits robust and reproducible analysis of up to 15 peptides against one MHC II allele per 384-well ELISA plate. Using a single liquid handling robot, this method allows one researcher to analyze approximately ninety test peptides in triplicate over a range of eight concentrations and four MHC II allele types in less than 48 hr. Others working in the fields of protein deimmunization or vaccine design and development may find the protocol to be useful in facilitating their own work. In particular, the step-by-step instructions and the visual format of JoVE should allow other users to quickly and easily establish this methodology in their own labs.

Biochemical assays with recombinant human MHC II molecules can provide rapid, quantitative insights into immunogenic epitope identification, deletion, or design. &#160;Here, a peptide-MHC II binding assay scaled to 384-well plates is described. This cost effective format should prove useful in the fields of protein deimmunization and vaccine design and development.

Ein hoher Durchsatz MHC II-Bindungsassay für die quantitative Analyse von Peptid-Epitope

Biochemical assays with recombinant human MHC II molecules can provide rapid, quantitative insights into immunogenic epitope identification, deletion, or ...

qPCRTag Analysis - A High Throughput, Real Time PCR Assay for Sc2.0 Genotyping

The Synthetic Yeast Genome Project (Sc2.0) aims to build 16 designer yeast chromosomes and combine them into a single yeast cell. To date one synthetic chromosome, synIII1, and one synthetic chromosome arm, synIXR2, have been constructed and their in vivo function validated in the absence of the corresponding wild type chromosomes. An important design feature of Sc2.0 chromosomes is the introduction of PCRTags, which are short, re-coded sequences within open reading frames (ORFs) that enable differentiation of synthetic chromosomes from their wild type counterparts. PCRTag primers anneal selectively to either synthetic or wild type chromosomes and the presence/absence of each type of DNA can be tested using a simple PCR assay. The standard readout of the PCRTag assay is to assess presence/absence of amplicons by agarose gel electrophoresis. However, with an average PCRTag amplicon density of one per 1.5 kb and a genome size of ~12 Mb, the completed Sc2.0 genome will encode roughly 8,000 PCRTags. To improve throughput, we have developed a real time PCR-based detection assay for PCRTag genotyping that we call qPCRTag analysis. The workflow specifies 500 nl reactions in a 1,536 multiwell plate, allowing us to test up to 768 PCRTags with both synthetic and wild type primer pairs in a single experiment.

Designer chromosomes of the Synthetic Yeast Genome project, Sc2.0, can be distinguished from their native counterparts using a PCR-based genotyping assay called PCRTagging, which has a presence/absence endpoint. Here we describe a high-throughput real time PCR detection method for PCRTag genotyping.

qPCRTag Analyse - ein hoher Durchsatz, Echtzeit-PCR-Assay für Sc2.0 Genotyping

The Synthetic Yeast Genome Project (Sc2.0) aims to build 16 designer yeast chromosomes and combine them into a single yeast cell. To date one synthetic ...

High Content Screening Analysis to Evaluate the Toxicological Effects of Harmful and Potentially Harmful Constituents (HPHC)

Cigarette smoke (CS) is a major risk factor for cardiovascular and lung diseases. Because CS is a complex aerosol containing more than 7,000 chemicals1 it is challenging to assess the contributions of individual constituents to its overall toxicity. Toxicological profiles of individual constituents as well as mixtures can be however established in vitro, by applying high through-put screening tools, which enable the profiling of Harmful and Potentially Harmful Constituents (HPHCs) of tobacco smoke, as defined by the U.S. Food and Drug Administration (FDA).2
For an initial assessment, an impedance-based instrument was used for a real-time, label-free assessment of the compound&#39;s toxicity. The instrument readout relies on cell adhesion, viability and morphology that all together provide an overview of the cell status. A dimensionless parameter, named cell index, is used for quantification. A set of different staining protocols was developed for a fluorescence imaging-based investigation and a HCS platform was used to gain more in-depth information on the kind of cytotoxicity elicited by each HPHC.
Of the 15 constituents tested, only five were selected for HCS-based analysis as they registered a computable LD50 (&#60; 20 mM). These included 1-aminonaphtalene, Arsenic (V), Chromium (VI), Crotonaldehyde and Phenol. Based on their effect in the HCS, 1-aminonaphtalene and Phenol could be identified to induce mitochondrial dysfunction, and, together with Chromium (VI) as genotoxic based on the increased histone H2AX phosphorylation. Crotonaldehyde was identified as an oxidative stress inducer and Arsenic as a stress kinase pathway activator.
This study demonstrates that a combination of impedance-based and HCS technologies provides a robust tool for in vitro assessment of CS constituents.

High Content Screening Analysis to Evaluate the Toxicological Effects of Harmful and Potentially Harmful Constituents HPHC

The objective of the study was to assess the biological impact of 15 cigarette smoke constituents using a combination of an impedance-based real time cell analyzer and a high-content screening (HCS)-based platform for toxicological assessment in vitro. This study provides information on effective doses, toxicity and modes of action of the tested compounds.

High Content Screening-Analyse die toxikologischen Wirkungen von gefährlichen und potenziell gefährlichen Inhaltsstoffe (HPHC) zur Bewertung

Cigarette smoke (CS) is a major risk factor for cardiovascular and lung diseases. Because CS is a complex aerosol containing more than 7,000 chemicals1 it ...