JP bedankt sich für die finanzielle Unterstützung durch den Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada und das University of Saskatchewan College of Medicine. YD bedankt sich für die finanzielle Unterstützung durch den University of Saskatchewan College of Medicine Startup Fund, den Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada Discovery Grant (RGPIN-2023-03659), den MS Canada Catalyst Grant (1019973), den Saskatchewan Health Research Foundation Establishment Grant (6368) und den Brain Canada Foundation Future Leaders in Canadian Brain Research Grant. Abbildung 1A, Abbildung 2A und Abbildung 3A wurden mit BioRender.com erstellt.

Alle Tiere, die in dieser Studie verwendet wurden, wurden mit Genehmigung des University Animal Care Committee (UACC) der University of Saskatchewan und des Canadian Council on Animal Care (CCAC) untergebracht und behandelt. Für diese Studie wurden männliche und weibliche CD1-Mäuse an den postnatalen Tagen 0-2 und Embryonen an den Tagen 16-18 (E16-18) von trächtigen CD1-Mäusen verwendet. Die Details zu den Reagenzien und den verwendeten Geräten sind in der Materialtabelle aufgeführt.
1. Primäre Mikroglia-Kultur
HINWEIS: Es ist wichtig, die gemischten Gliazellen und neuronalen Kulturen so zu timen, dass die Mikroglia innerhalb von 2 Tagen nach der Aussaat der Neuronen in eine 96-Well-Platte reif und erntereif sind.
<ol><li>Präparat<ol><li>Vollständiges Glia-Kulturmedium vorwärmen, das Dulbeccos Modified Eagle Medium (DMEM) mit hohem Glukosegehalt, ergänzt mit 10 % hitzeinaktiviertem fötalem Rinderserum, 50 U/ml Penicillin/Streptomycin mit 2,92 mg/ml L-Glutamin, 1 mM Natriumpyruvat, 1x nicht-essentielle Aminosäuren und 20 mM HEPES in einem 37 °C Wasserbad enthält.</li>
		<li>5 ml 10 μg/ml Poly-L-Ornithin (PO)-Hydrobromid in jeden T-75-Kolben geben. Schwenken Sie den Kolben vorsichtig, um sicherzustellen, dass PO den Boden des Kolbens vollständig bedeckt. Bei 37 °C in einem 5 % CO2 -Inkubator für mindestens 1 h inkubieren. HINWEIS: Dieser Beschichtungsschritt ist erforderlich, um die Zelladhäsion an den T-75-Kolben zu erleichtern.</li>
	</ol></li>
	<li>Isolierung von Gehirnen aus P0-P2-neugeborenen Mäusen HINWEIS: Sterilisieren Sie alle Präparierwerkzeuge und bewahren Sie die Sterilität der Reagenzien. Stellen Sie sicher, dass die aseptischen Techniken durchgehend eingehalten werden.<ol><li>Sprühen Sie vor Beginn des Sezierens die Arbeitsplatte mit 70%igem Ethanol oder Desinfektionsspray ein, wo die Dissektion stattfinden soll. Stellen Sie das Präpariermikroskop auf und stellen Sie die Petrischale unter das Mikroskop. Gießen Sie 20 mL des L-15-Mediums von Leibovitz in die Petrischale. Lassen Sie den Deckel der Petrischale auf, während das Mikroskop nicht verwendet wird, um Kontaminationen zu reduzieren.</li>
		<li>Legen Sie mehrere Lagen Papiertuch darauf und besprühen Sie die Papiertücher gründlich mit 70% Ethanol. Bereiten Sie die Sezierwerkzeuge (Präparierschere, Mikrozange und Gewebezange) vor, indem Sie sie gründlich mit 70% Ethanol besprühen und auf die Papiertücher legen.</li>
		<li>Übertragen Sie die Maus nach der Geburt 0-2 auf die Papiertücher und besprühen Sie die Maus gründlich mit 70% Ethanol. Enthaupten Sie die Maus mit einer Separierschere (nach institutionell anerkannten Protokollen).</li>
		<li>Während Sie den Kopf sanft halten, setzen Sie einen Mittellinienschnitt im Schädel, beginnend vom Hals bis zur Nase. Schälen Sie den Schädel mit einer Gewebezange zurück, um das Gehirn freizulegen.</li>
		<li>Schöpfen Sie das Gehirn mit einer Gewebezange vorsichtig heraus, indem Sie die Pinzette unter das Gehirn einführen und das Gehirn aus dem Kopf herausheben. Setzen Sie das Gehirn sofort in die Petrischale ein, die 20 ml des L-15-Mediums von Leibovitz enthält.</li>
		<li>Unter einem Präpariermikroskop wird der Hirnstamm und die Hirnhäute vorsichtig mit einer Mikrozange entfernt. Sammeln Sie die Gehirne in einem konischen 50-ml-Röhrchen, das 5 ml des L-15-Mediums von Leibovitz enthält.</li>
	</ol></li>
	<li>Dissoziation des Gehirns, Aussaat und Aufrechterhaltung der gemischten Gliakultur HINWEIS: Führen Sie alle nachfolgenden Schritte in einer Biosicherheitswerkbank durch.<ol><li>Schneiden Sie das Gehirn mit einer sterilen Einweg-Skalpellklinge in ca. 1 mm2 Stücke. Übertragen Sie die zerkleinerten Gehirne vorsichtig in ein neues steriles 50-ml-Röhrchen.</li>
		<li>Zu den zerkleinerten Gehirnen eine Endkonzentration von 0,25 % Trypsin geben und das Gewebe in einem 37 °C warmen Wasserbad für 20 min inkubieren. Mischen Sie die Lösung alle 2-3 Minuten, indem Sie das Röhrchen vorsichtig umdrehen, um die Dissoziation des Gewebes zu unterstützen.</li>
		<li>Aus dem 5%igen CO2 -Inkubator werden die T-75-Kolben mit 5 ml PO in die Biosicherheitswerkbank überführt. Entsorgen Sie die PO und spülen Sie die Kolben 3 Mal mit steriler 1x Phosphatpufferlösung (PBS) aus. Achten Sie darauf, die Kolben gründlich zu spülen, da überschüssiges PO für die Zellen giftig ist.</li>
		<li>Übertragen Sie das verdaute Gewebe aus dem 37 °C warmen Wasserbad in die Biosicherheitswerkbank. Fügen Sie 5 ml vollständiges Glia-Kulturmedium hinzu, um das Trypsin zu neutralisieren. Mischen Sie die Gewebesuspension vorsichtig mit einer 10-ml-Pipette.</li>
		<li>Legen Sie ein steriles 70-μm-Nylonnetz-Zellsieb auf ein steriles konisches 50-ml-Röhrchen und befeuchten Sie das Netz, indem Sie etwa 5 ml L-15 einfüllen. Dekantieren Sie die Zellsuspension vorsichtig durch das Zellsieb. Entfernen Sie den Kolben von einer sterilen 1-ml-Spritze, mahlen Sie das Gewebe mit dem Kolben in das Netz, um Gewebeklumpen zu entfernen, und erzeugen Sie eine homogenisierte Zellsuspension.</li>
		<li>Gießen Sie in regelmäßigen Abständen ca. 5 mL L-15-Medium von Leibovitz in das 70 μm Nylonnetz und schleifen Sie das Gewebe auf dem Netz mit dem 1 ml-Spritzenkolben weiter. Wenn wenig bis gar kein sichtbares Gewebe mehr auf dem Netz verbleibt, entsorgen Sie das Netz und legen Sie die Zellsuspension beiseite.</li>
		<li>Mischen Sie die Zellsuspension, indem Sie vorsichtig auf und ab pipettieren. Zu jedem Kolben werden gleiche Volumina der Zellsuspension mit 1-2 Gehirnen mit Glia-Kulturmedien bis zu einem Endvolumen von 15 ml gegeben.</li>
		<li>Inkubieren Sie die Zellen bei 37 °C in einem 5%igen CO2 -Inkubator über Nacht. Waschen Sie die Kolben am nächsten Tag zweimal mit sterilem 1x PBS, um nicht anhaftende Zellen und Ablagerungen zu entfernen.</li>
		<li>Geben Sie 15 ml frische, vollständige Glia-Nährmedien in die Kultur und inkubieren Sie sie bei 37 °C in einem 5 % CO2 -Inkubator. Wechseln Sie nach 3 Tagen die Hälfte des Mediums durch 10 ml frisches Glia-Kulturmedium, das mit 40 ng/ml Makrophagen-Kolonie-stimulierendem Faktor (MCSF) ergänzt wird. HINWEIS: Danach wird die Hälfte des Mediums durch 10 ml frisches Glia-Kulturmedium ersetzt, das alle 3 Tage mit 40 ng/ml MCSF ergänzt wird. Die Kultur wird 8-10 Tage lang aufbewahrt, bevor Mikroglia geerntet werden.</li>
	</ol></li>
</ol>2. Primäre Neuronenkultur
<ol><li>Präparat<ol><li>Tauen Sie B-27 plus Ergänzung aus B-27 plus neuronalem Kultursystem auf. Neurobasal plus Medium aus B-27 plus neuronalem Kultursystem, 1x Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) und hitzeinaktiviertes fötales Rinderserum (FBS) bei 37 °C in einem Wasserbad vorwärmen.</li>
		<li>Die T-25-Kolben werden mit 5 mL 10 μg/mL PO bestreicht und die Kolben mindestens 1 Stunde lang bei 37 °C inkubiert. Bereiten Sie Instrumente und Verbrauchsmaterialien für das Sezieren vor. HINWEIS: Dieser Beschichtungsschritt erleichtert die Zelladhäsion an den T-25-Kolben.</li>
	</ol></li>
	<li>Isolierung des Gehirns aus E16-E18-Mausembryonen HINWEIS: Sterilisieren Sie alle Präparierwerkzeuge und bewahren Sie die Sterilität der Reagenzien. Stellen Sie sicher, dass die aseptischen Techniken durchgehend eingehalten werden.<ol><li>Sprühen Sie vor Beginn des Sezierens die Arbeitsplatte mit 70%igem Ethanol oder Desinfektionsspray ein, wo die Dissektion stattfinden soll. Stellen Sie das Präpariermikroskop auf und stellen Sie die Petrischale unter das Mikroskop. Gießen Sie 20 mL 1x HBSS in die Petrischale. Lassen Sie den Deckel der Petrischale auf, während das Mikroskop nicht verwendet wird, um Kontaminationen zu reduzieren.</li>
		<li>Legen Sie mehrere Lagen Papiertuch darauf und besprühen Sie die Papiertücher gründlich mit 70% Ethanol. Bereiten Sie die Sezierwerkzeuge (Federschere, Mikrozange und Gewebezange) vor, indem Sie sie gründlich mit 70% Ethanol besprühen und auf die Papiertücher legen.</li>
		<li>Betäuben Sie eine trächtige Maus zwischen dem 16. und 18. Schwangerschaftstag mit Isofluran und euthanasieren Sie die Maus durch Gebärmutterhalsluxation (gemäß institutionell anerkannten Protokollen).</li>
		<li>Legen Sie die Maus auf den Rücken auf ein Stück Papiertuch, das mit 70% Ethanol getränkt ist. Desinfizieren Sie den Bauchbereich mit 70% Ethanol. Heben Sie die Haut des Unterbauchs mit einer Gewebezange an und führen Sie von diesem Punkt aus mit einer Präparierschere einen V-förmigen Schnitt zum unteren Brustkorb durch.</li>
		<li>Fassen Sie die Gebärmutterhörner, in denen sich die Embryonen befinden, mit einer Gewebezange und entfernen Sie die Embryonen vorsichtig aus der Bauchhöhle. Desinfizieren Sie die Gebärmutterhörner, die Embryonen enthalten, kurz mit 70% Ethanol.</li>
		<li>Sezieren Sie jeweils einen Embryo aus seinem einzelnen Sack. Machen Sie mit einer Federschere einen Mittellinienschnitt an der Oberseite des Schädels, beginnend vom Nacken bis zur Nase. Heben Sie dann den Schädel von der Inzisionsstelle weg, um das Gehirn freizulegen. Schöpfen Sie das Gehirn vorsichtig mit einer Gewebezange aus und übertragen Sie das Gehirn in eine 10 cm große Petrischale, die 15 mL 1x HBSS enthält.</li>
		<li>Entfernen Sie unter einem Präpariermikroskop vorsichtig den Hirnstamm und die Hirnhäute auf beiden Seiten der Hirnrinde mit einer Mikrozange. Übertragen Sie die Hirnrinde in ein konisches 50-ml-Röhrchen, das 10 mL 1x HBSS enthält, und legen Sie es auf Eis.</li>
	</ol></li>
	<li>Dissoziation und Aussaat von kortikalen Neuronen im Gehirn in Zellkultur HINWEIS: Führen Sie alle nachfolgenden Schritte in einer Biosicherheitswerkbank durch.<ol><li>Zerkleinern Sie das Gehirn in ca. 1 mm2 Stücke in dem konischen 50-ml-Röhrchen mit einer sterilen Einweg-Skalpellklinge. Übertragen Sie die zerkleinerten Gehirne in ein neues steriles konisches 50-ml-Röhrchen.</li>
		<li>Geben Sie Trypsin mit einer Endkonzentration von 0,25% in das Röhrchen. Tauchen Sie das Röhrchen für 15 min in ein 35-38 °C heißes Wasserbad und mischen Sie das Röhrchen alle 2-3 min vorsichtig, um das Gewebe zu homogenisieren.</li>
		<li>Nehmen Sie den Schlauch aus dem Heißwasserbad. Pipettieren Sie die Gewebesuspension vorsichtig auf und ab, um die Zellen weiter zu dissoziieren, und fügen Sie dann 0,5 ml hitzeinaktiviertes FBS zur homogenisierten Suspension hinzu, um die Trypsinaktivität zu neutralisieren. Vermeiden Sie Luftblasen, um die Toxizität für neuronale Zellen zu minimieren.</li>
		<li>Legen Sie ein steriles 70-μm-Nylonnetz-Zellsieb auf ein steriles konisches 50-ml-Röhrchen und befeuchten Sie das Netz mit etwa 5 ml neurobasalem Medium. Filtern Sie die Zellsuspension durch das 70 μm Nylon-Mesh-Zellsieb. Mahlen Sie das Gewebe mit einem 1-ml-Spritzenkolben vorsichtig in das Zellsieb. Gießen Sie regelmäßig ca. 5 ml 1x HBSS ein, während Sie weiter mahlen, um das Zellsieb zu waschen.</li>
		<li>Das konische Röhrchen bei 300 x g für 5 min bei 4 °C zentrifugieren. Während dieser Zeit verdünnen Sie B-27 plus Supplement in neurobasalen plus Medien auf 1x Endkonzentration, um es als vollständiges neurobasales Medium zu verwenden.</li>
		<li>Entsorgen Sie den PO in den T-25-Kolben und spülen Sie die Kolben dreimal mit 5 mL 1x PBS.</li>
		<li>Dekantieren Sie vorsichtig, um den Überstand zu entfernen, und resuspendieren Sie das Zellpellet, indem Sie vorsichtig 2-3 ml des vollständigen neurobasalen Mediums auf und ab pipettieren. Bestimmen Sie die Zellkonzentration und die Gesamtzellzahl mit einem Hämozytometer und Trypanblau. Erwarten Sie bis zu 1,0 x 107 Zellen pro Embryo.</li>
		<li>Die Zellen in den PO-beschichteten T-25-Kolben werden mit ca. 2,0 x 107 Zellen pro Kolben in 5 ml vollständigem neurobasalem Medium plattiert. Inkubieren Sie die Zellkultur bei 37 °C in einem 5% CO2 -Inkubator.</li>
		<li>Führen Sie alle 2-3 Tage einen halben Medienwechsel durch, indem Sie 2,5 ml Medium aus dem Kulturkolben durch frisch hergestellte vollständige neurobasale Medien ersetzen.</li>
	</ol></li>
</ol>3. Co-Kultur von primären Neuronen und Mikroglia
HINWEIS: Alle nachfolgenden Schritte sind in einer sterilen Biosicherheitswerkbank durchzuführen.
<ol><li>Aussaat von Neuronen in 96-Well-Platten<ol><li>Geben Sie 100 μl 10 μg/ml PO pro Vertiefung hinzu und inkubieren Sie die Kolben mindestens 1 h bei 37 °C, um die Vertiefungen mit PO zu beschichten. Waschen Sie die Platte 3 Mal mit 1x PBS, bevor Sie die Zellen säen, und saugen Sie die verbleibende Flüssigkeit nach dem letzten Waschen ab.</li>
		<li>Neuronen, die in T-25-Kolben gezüchtet werden, werden nach 2-5 Tagen in Kultur für die Co-Kultur geerntet. Das Medium wird durch 5 ml 1x Versene-Lösung mit 0,25 % Trypsin und 1 mg/ml DNase I ersetzt, um Neuronen aus dem Kolben zu lösen. Legen Sie die Kolben für 5-6 Minuten zur Verdauung in den Inkubator und schwenken Sie den Kolben alle 2-3 Minuten vorsichtig, um die Zellablösung zu unterstützen.</li>
		<li>Nehmen Sie den Kolben aus dem Inkubator und prüfen Sie, ob sich die Zellen unter dem Mikroskop abgelöst haben. Fügen Sie 0,5 ml hitzeinaktiviertes FBS hinzu, um das Trypsin und DNase I zu neutralisieren. Übertragen Sie die Zellen in ein konisches 15-ml-Röhrchen. Waschen Sie den Kolben einmal mit 5 ml vollständigem neurobasalem Medium, um die gesammelten Neuronen zu maximieren. Sammeln Sie alle Zellen im selben konischen 15-ml-Röhrchen.</li>
		<li>Die Zellsuspension bei 300 x g für 5 min bei 4 °C zentrifugieren. Entsorgen Sie den Überstand und resuspendieren Sie das Zellpellet vorsichtig in 2-3 ml vollständigem neurobasalem Medium.</li>
		<li>Zählen Sie die Zellen mit einem Hämozytometer und fügen Sie vollständige neurobasale Medien hinzu, um eine Endkonzentration von 7,5 x 105 Neuronen/ml zu erreichen. 100 μl der Zellsuspension in jede Vertiefung in der PO-beschichteten 96-Well-Platte aussäen, um 7,5 x 104 Neuronen/Vertiefung zu erhalten. Es wird eine Ausbeute von 5-6 Millionen Neuronen pro Kolben erwartet.</li>
		<li>Inkubieren Sie die Neuronen über Nacht in einer 96-Well-Platte. Geben Sie am nächsten Tag 100 μl des kompletten neurobasalen Mediums in jede Vertiefung. HINWEIS: Sobald die Neuronen ein angemessenes Wachstum des Neuritenprozesses aufweisen (etwa Tag 3-4 nach der Aussaat in 96-Well-Platten), sind sie bereit für die Co-Kultur mit Mikroglia.</li>
	</ol></li>
	<li>Isolation und Mikroglia-neuronale Co-Kultur<ol><li>Sammeln Sie zwischen 8 und 10 Tagen gemischter Gliakultivierung Mikroglia, indem Sie die T-75-Kolben in jedem Kolben mit einer 10-ml-Pipette vorsichtig mit Glia-Kulturmedien waschen und die Zellen und Medien in ein steriles konisches 50-ml-Röhrchen überführen. Waschen Sie die Kolben erneut mit 10 mL frischem Glia-Kulturmedium, um zusätzliche Mikroglia von den Kolben zu lösen und das Medium zu sammeln. Es wird eine Ausbeute von 7,5 x 105 Mikroglia pro Kolben erwartet.</li>
		<li>20 ml frisches Glia-Kulturmedium, ergänzt mit 20 ng/ml MCSF, werden in jeden Kolben gegeben. Mikroglia können ein- oder zweimal mehr geerntet werden, wenn die gemischte Gliakultur beibehalten wird.</li>
		<li>Zentrifugieren Sie die Zellsammlung bei 300 x g für 5 min bei 4 °C. Entfernen Sie vorsichtig den Überstand und resuspendieren Sie das Pellet vorsichtig in 2 ml vollständigem neurobasalem Medium.</li>
		<li>Zählen Sie die Zellen mit einem Hämozytometer und Trypanblau. Geben Sie das komplette neurobasale Medium zu einer Endkonzentration von 2,5 x 105 Zellen/ml.</li>
		<li>Entfernen Sie 100 μl des neurobasalen Mediums aus der 96-Well-Kulturplatte und fügen Sie 100 μl 2,5 x 105 Zellen/ml Zellsuspension hinzu, um 2,5 x 104 Mikroglia pro Vertiefung mit 7,5 x 104 Neuronen zu säen. Die Kultur wird über Nacht bei 37 °C in einem 5 % CO2 -Inkubator inkubiert, damit sich die Mikroglia absetzen können. Die Co-Kultur kann nun für nachgelagerte Experimente genutzt werden.</li>
	</ol></li>
</ol>

 Primäres Mikroglia- und Neuronen-Co-Kulturprotokoll für ZNS-Interaktionsstudien

Die Autoren erklären, dass keine Interessenkonflikte bestehen.

Dieser Artikel beschreibt ein Protokoll für die Isolierung und Kultivierung von primären Mausneuronen und primären Mikroglia, die anschließend verwendet werden, um eine Mikroglia-Neuronal-Co-Kultur zu etablieren, mit der untersucht werden kann, wie Mikroglia- und Neuroneninteraktionen ihre zelluläre Gesundheit und Funktion regulieren. Dieser relativ einfache und zugängliche Ansatz kann wichtige Einblicke in die Mechanismen und funktionellen Ergebnisse von Mikroglia-Neuroneninteraktionen im ZNS liefern.
<p class...

Mikroglia sind geweberesidente Makrophagen, die die Immunüberwachung und Homöostase im Zentralnervensystem (ZNS) erleichtern1,2,3. Sie stammen aus erythromyeloiden Vorläuferzellen des Dottersacks, die das Gehirn während der Embryonalentwicklung besiedeln 4,5,6 und während der gesamten Lebensspanne des Organismus durch Selbsterneuerung, die Proliferation und Apoptose beinhaltet, erhalten bleiben7. Im Steady-State haben ruhende Mikroglia die Morphologie verzweigt und beteiligen sich an der Gewebeüberwachung 8,9,10.
Mikroglia exprimieren zahlreiche Rezeptoren der Zelloberfläche, was es ihnen ermöglicht, schnell auf Veränderungen im ZNS zu reagieren11,12 und Entzündungsreaktionen bei Infektionen oder Gewebeverletzungen zu fördern 12,13,14 sowie bei neurodegenerativen Erkrankungen 9,15 wie z.B. Multipler Sklerose (MS)16,17. Mikroglia exprimieren auch Rezeptoren für verschiedene Neurotransmitter und Neuropeptide 18,19,20, was darauf hindeutet, dass sie auch auf neuronale Aktivität reagieren und diese regulieren können 21,22. In der Tat interagieren Mikroglia und Neuronen in verschiedenen Formen der bidirektionalen Kommunikation 8,23, wie z. B. direkte Wechselwirkungen, die durch Membranproteine vermittelt werden, oder indirekte Wechselwirkungen durch lösliche Faktoren oder Zwischenzellen23,24.
Zum Beispiel können verschiedene Neurotransmitter, die von Neuronen sezerniert werden, die neuroprotektive oder inflammatorische Aktivität von Mikroglia modulieren 25,26,27. Darüber hinaus tragen direkte Wechselwirkungen zwischen Neuronen und Mikroglia dazu bei, Mikroglia in einem homöostatischen Zustand zu halten28. Umgekehrt können direkte Wechselwirkungen von Mikroglia mit Neuronen die neuronalen Schaltkreise29 prägen und die neuronale Signalübertragungbeeinflussen 30,31,32. Da Störungen dieser Wechselwirkungen eine Übererregbarkeit der Neuronen30 und eine Mikroglia-Reaktivität 33,34 induzieren, werden fehlregulierte Mikroglia-neuronale Interaktionen als beitragender Faktor für neurologische Erkrankungen angesehen33,35. In der Tat wurde beschrieben, dass psychotische23,26 und neurodegenerative Erkrankungen dysfunktionale Mikroglia-Neuronal-Interaktionen aufweisen33. Während diese Beobachtungen die Bedeutung der Mikroglia-Neuronal-Kommunikation im ZNS unterstreichen, sind die spezifischen Mechanismen, wie diese Interaktionen die mikroglialen und neuronalen Funktionen bei Gesundheit und Krankheit regulieren, relativ unbekannt.
In einem komplexen Milieu wie dem ZNS können mehrere Umweltfaktoren die Interaktionen zwischen Mikroglia und Neuronen beeinflussen, was die Fähigkeit einschränkt, transiente zelluläre Interaktionen in vivo zu untersuchen. Hier stellen wir ein in vitro Mikroglia-Neuronal-Co-Kultursystem vor, mit dem direkte zelluläre Interaktionen zwischen Mikroglia und Neuronen untersucht werden können. Dieses Protokoll beschreibt die Erzeugung von primären Mikroglia und Neuronen aus der Rinde von neonatalen Mäusen zwischen den postnatalen Tagen 0-2 und embryonalen Mäusen zwischen den Tagen 16-18. Neuronen und Mikroglia werden dann in 96-Well-Platten für nachgelagerte Hochdurchsatzexperimente co-kultiviert. Wir haben diesen Ansatz bereits verwendet, um zu zeigen, dass die Mikroglia-Phagozytose Neuronen vor oxidiertem Phosphatidylcholin-vermitteltem Zelltod schützt37, was darauf hindeutet, dass diese Methode dazu beitragen kann, die Rolle von Mikroglia im Zusammenhang mit Neurodegeneration und MS zu verstehen. In ähnlicher Weise können Mikroglia-neuronale Co-Kulturen auch nützlich sein, um die Auswirkungen der Mikroglia-Neuronal-Wechselwirkung in anderen Kontexten zu untersuchen, wie z. B. bei Virusinfektionen38 oder neuronalen Verletzungen und Reparaturen39. Insgesamt ermöglichen in vitro Mikroglia-neuronale Co-Kultursysteme den Forschern, Mikroglia-neuronale Interaktionen in einer manipulierbaren und kontrollierten Umgebung zu untersuchen, was die In-vivo-Modelle ergänzt.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>10 cm Petri dish&#160;</td>
			<td>Fisher&#160;</td>
			<td>07-202-011</td>
			<td>Sterile</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1x Versene</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15040-066</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B-27 Plus Neuronal Culture System&#160;</td>
			<td>Gibco&#160;</td>
			<td>A3653401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissection microscope</td>
			<td>VWR</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNase I</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11284932001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s Modified Eagle Medium (DMEM)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11960-044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum&#160;</td>
			<td>ThermoFisher Sci</td>
			<td>12483-020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBSS (10x)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14065-056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemacytometer</td>
			<td>Hausser Scientific</td>
			<td>1475</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES&#160;</td>
			<td>ThermoFisher Sci</td>
			<td>15630080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leibovitz&#8217;s L-15 Medium (1x)</td>
			<td>Fisher Scientific&#160;</td>
			<td>21083027</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Macrophage colony stimulating factor&#160;</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>315-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro-Forceps</td>
			<td>RWD</td>
			<td>F11020-11</td>
			<td>Autoclaved/Sterile</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Non-essential amino acids</td>
			<td>Cytiva</td>
			<td>SH3023801</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS (10x)</td>
			<td>ThermoFisher Sci</td>
			<td>AM9625</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin Streptomycin Glutamine (100x)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>103780-16</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-L-ornithine hydrobromide&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P3655-100MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium pyruvate (100 mM)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11360-070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spring scissors</td>
			<td>RWD</td>
			<td>S11008-42</td>
			<td>Autoclaved/Sterile</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical blade</td>
			<td>Feather</td>
			<td>08-916-5D</td>
			<td>Sterile</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T-25 flasks</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>10-126-9</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T-75 flasks&#160;</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>13-680-65</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue forceps</td>
			<td>Codman</td>
			<td>30-4218</td>
			<td>Autoclaved/Sterile</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue scissors</td>
			<td>RWD</td>
			<td>S12052-10</td>
			<td>Autoclaved/Sterile</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue&#160;</td>
			<td>Thermofisher Sci&#160;</td>
			<td>15250-061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin (2.5%)</td>
			<td>ThermoFisher Sci</td>
			<td>15090046</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Widefield Immunofluorescence Microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

generating and co-culturing murine primary microglia and cortical neurons

Mikroglia sind geweberesidente Makrophagen des Zentralnervensystems (ZNS), die zahlreiche Funktionen erfüllen, die die neuronale Gesundheit und die ZNS-Homöostase unterstützen. Sie sind eine wichtige Population von Immunzellen, die mit der Aktivität der ZNS-Erkrankung assoziiert sind und reaktive Phänotypen annehmen, die möglicherweise zu neuronalen Schädigungen bei chronischen neurodegenerativen Erkrankungen wie Multipler Sklerose (MS) beitragen. Die unterschiedlichen Mechanismen, durch die Mikroglia die neuronale Funktion und das Überleben während Gesundheit und Krankheit regulieren, bleiben aufgrund von Herausforderungen bei der Lösung der komplexen In-vivo-Wechselwirkungen zwischen Mikroglia, Neuronen und anderen ZNS-Umweltfaktoren begrenzt. Daher bleibt der in vitro-Ansatz der Co-Kultivierung von Mikroglia und Neuronen ein wertvolles Werkzeug für die Untersuchung von Mikroglia-Neuronal-Interaktionen. Hier stellen wir ein Protokoll zur Generierung und Co-Kultur von primären Mikroglia und Neuronen aus Mäusen vor. Konkret wurden Mikroglia nach 9-10 Tagen in vitro aus einer gemischten Gliakultur isoliert, die aus Gehirnhomogenaten von neugeborenen Mäusen zwischen den postnatalen Tagen 0-2 etabliert wurde. Neuronale Zellen wurden zwischen dem 16. und 18. Embryonaltag aus der Hirnrinde von Mausembryonen isoliert. Nach 4-5 Tagen in vitro wurden die neuronalen Zellen in 96-Well-Platten ausgesät, gefolgt von der Zugabe von Mikroglia, um die Co-Kultur zu bilden. Ein sorgfältiges Timing ist für dieses Protokoll von entscheidender Bedeutung, da beide Zelltypen die experimentelle Reife erreichen müssen, um die Co-Kultur zu etablieren. Insgesamt kann diese Co-Kultur für die Untersuchung von Mikroglia-Neuronen-Interaktionen nützlich sein und mehrere Messwerte liefern, einschließlich Immunfluoreszenzmikroskopie, Live-Bildgebung sowie RNA- und Protein-Assays.

Microglia are tissue-resident macrophages that facilitate immunosurveillance and homeostasis in the central nervous system (CNS)1,2,3. They originate from yolk sac erythromyeloid progenitor cells that colonize the brain during embryonic development4,5,6&#160;and are maintained throughout the organism&#39;s life span through self-renewal, which involves proliferation and apoptosis7. At steady-state, resting microglia have ramified morphology and engage in tissue surveillance8,9,10.
Microglia express numerous cell-surface receptors, which enables them to rapidly respond to changes in the CNS11,12 and to promote inflammatory responses in the event of infections or tissue injury12,13,14, as well as during neurodegenerative diseases9,15, such as&#160;multiple sclerosis (MS)16,17. Microglia also express receptors to various neurotransmitters and neuropeptides18,19,20, which suggests they may also respond to and regulate neuronal activity21,22. Indeed, microglia and neurons interact in various forms of bidirectional communication8,23 such as direct interactions mediated by membrane proteins or indirect interactions through soluble factors or intermediate cells23,24.
For instance, various neurotransmitters secreted by neurons can modulate the neuroprotective or inflammatory activity of microglia25,26,27. Additionally, direct interactions between neurons and microglia help to maintain microglia in a homeostatic state28. Conversely, direct interactions of microglia with neurons can shape neuronal circuitry29 and influence neuronal signaling30,31,32. As disruptions of these interactions induce hyperexcitability of neurons30 and&#160;microglia reactivity33,34, dysregulated microglia-neuronal interactions&#160;are implicated&#160;as a contributing factor to&#160;neurological diseases33,35. Indeed, psychotic23,26 and neurodegenerative diseases have been described to exhibit dysfunctional microglia-neuronal interactions33. While these observations highlight the importance of microglia-neuronal communication in the CNS, specific mechanisms of how these interactions regulate microglial and neuronal functions in health and disease are relatively unknown.
Within a complex milieu such as the CNS, multiple environmental factors can influence microglia-neuronal interactions, which limits the ability to study transient cellular interactions in vivo. Here, we present an in vitro microglia-neuronal co-culture system that can be used to study direct cellular interactions between microglia and neurons. This protocol describes the generation of primary microglia and neurons from the cortices of neonatal mice between post-natal days 0-2 and embryonic mice days 16-18, respectively. Neurons and microglia are then co-cultured in 96-well plates for downstream high-throughput experiments. We previously used this approach to demonstrate that microglia phagocytosis protects neurons from oxidized phosphatidylcholine mediated cell death37, suggesting that this method can help to understand the roles of microglia in the context of neurodegeneration and MS. Similarly, microglia-neuronal co-cultures may also be useful for investigating the impact of microglia-neuronal crosstalk in other contexts such as viral infections38 or neuronal injury and repair39. Overall, in vitro microglia-neuronal co-culture systems&#160;enable researchers to study microglia-neuronal interactions in a manipulatable and controlled environment, which complements in vivo models.

Autor im Rampenlicht: In vitro Co-Kultur-Modell zur Untersuchung von Mikroglia-neuronalen Interaktionen bei Krankheitszuständen

Generierung und Co-Kultivierung von primären Mikroglia und kortikalen Neuronen von Mäusen

Our research aims to investigate the interactions between neurons and microglia during disease conditions such as multiple sclerosis. We aim to recapitulate microglia neuronal interactions in vitro to better understand their functional importance in the CNS. We previously demonstrated that microglia phagocytosis protects neurons from oxidized phosphatidylcholine-mediated cell death with this co-culture.While other co-culture systems are also employed, this mixed culture system enables direct and close contact between microglia and neurons. In addition, it can remain healthy from 12 days to potentially three weeks, allowing for long-term studies of neuronal microglia interactions. Our protocol offers a simple and accessible method to co-culture microglia neurons that are easily manipulatable and can be further used in downstream assays to determine cellular functional changes.

Ein Flussdiagramm, das die wichtigsten Schritte der gemischten Gliakultur für Mikroglia zeigt, ist in Abbildung 1A dargestellt. Insgesamt werden an Tag 1 spärliche Zellen und übermäßige Zelltrümmer erwartet (Abbildung 1B). Bis zum 4. Tag sollte eine erhöhte Zellzahl beobachtet werden, insbesondere bei der Bildung adhärenter Astrozyten, was durch ihre längliche Morphologie angezeigt wird (Abbildung 1C). Einige Mikroglia kön...

Dieses Protokoll beschreibt eine Mikroglia-neuronale Co-Kultur, die aus primären neuronalen Zellen hergestellt wurde, die an den Embryonaltagen 15-16 aus Mausembryonen isoliert wurden, und aus primären Mikroglia, die aus den Gehirnen von neugeborenen Mäusen an den postnatalen Tagen 1-2 erzeugt wurden.

Microglia are tissue-resident macrophages of the central nervous system (CNS), performing numerous functions that support neuronal health and CNS ...

generating-co-culturing-murine-primary-microglia-cortical

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Generating and Co-culturing Murine Primary Microglia and Cortical Neurons

718 Aufrufe.  University of Saskatchewan. Unsere Forschung zielt darauf ab, die Wechselwirkungen zwischen Neuronen und Mikroglia bei Krankheitszuständen wie Multipler Sklerose zu untersuchen. Unser Ziel ist es, neuronale Interaktionen von Mikroglia in vitro zu rekapitulieren, um ihre funktionelle Bedeutung im ZNS besser zu verstehen. Wir haben bereits gezeigt, dass die Mikroglia-Phagozytose die Neuronen vor oxidiertem Phosphatidylcholin-vermitteltem Zelltod schützt.Während auch andere Co-Ku...

Serie: Autor im Rampenlicht: In vitro Co-Kultur-Modell zur Untersuchung von Mikroglia-neuronalen Interaktionen bei Krankheitszuständen

Microglia are tissue-resident macrophages of the central nervous system (CNS), performing numerous functions that support neuronal health and CNS homeostasis. They are a major population of immune cells associated with CNS disease activity, adopting&#160;reactive phenotypes that potentially contribute to neuronal injury during chronic neurodegenerative diseases such as multiple sclerosis (MS). The distinct mechanisms by which microglia regulate neuronal function and survival during health and disease remain limited due to challenges in resolving the complex in vivo interactions between microglia, neurons, and other CNS environmental factors. Thus, the in vitro approach of co-culturing microglia and neurons remains a valuable tool for studying microglia-neuronal interactions. Here, we present a protocol to generate and co-culture primary microglia and neurons from mice. Specifically, microglia were isolated after 9-10 days in vitro from a mixed glia culture established from brain homogenates derived from neonatal mice between post-natal days 0-2. Neuronal cells were isolated from brain cortices of mouse embryos between embryonic days 16-18. After 4-5 days in vitro, neuronal cells were seeded in 96-well plates, followed by the addition of microglia to form the co-culture. Careful timing is critical for this protocol as both cell types need to reach experimental maturity to establish the co-culture. Overall, this co-culture can be useful for studying microglia-neuron interactions and can provide multiple readouts, including immunofluorescence microscopy, live imaging, as well as RNA and protein assays.

This protocol describes a microglia-neuronal co-culture established from primary neuronal cells isolated from mouse embryos at embryonic days 15-16 and primary microglia generated from the brains of neonatal mice at post-natal days 1-2.

Forschung

Neurowissenschaften

Brain Isolation from Neonatal Mice for Primary Microglia Culture

To begin, add 5 milliliters of 10 micrograms per milliliter Poly-L-ornithine hydrobromide to each T75 flask. Incubate at 37 degrees Celsius in a 5%carbon dioxide incubator for at least one hour. After decapitating the mouse, gently hold the head and create a midline incision in the cranium, starting from the neck to the nose.Peel the skull back with tissue forceps to reveal the brain. To scoop the brain out, insert the tissue forceps under the brain, and lift the brain out from the head. After placing the brain into a Petri dish containing 20 milliliters of Leibovitz's L-15 media under a dissection microscope, using a pair of micro-forceps, carefully remove the brainstem and the meninges.Collect the brains in a 50-milliliter conical tube containing 5 milliliters of Leibovitz's L15 media.

Isolierung des Gehirns von neugeborenen Mäusen für die primäre Mikroglia-Kultur

Preparing and Maintaining Mixed Glia Culture Derived from Neonatal Mice Brains

To begin, mince the isolated brains into approximately one-square-millimeter pieces with a sterile disposable scalpel blade. Carefully transfer the minced brains into a new sterile 50 milliliter tube. Add a final concentration of 0.25%trypsin to the minced brains.Incubate the tissue in a 37-degrees-Celsius water bath for 20 minutes. Add five milliliters of complete glia culture media to neutralize the trypsin and gently mix the tissue suspension using a 10 milliliter pipette. Carefully decant the cell suspension through the cell strainer.Then remove the plunger from a sterile one-milliliter syringe and grind the tissue into the mesh using the plunger. Add equal volumes of cell suspension containing one to two brains with glia culture media to each flask resulting in a final volume of 15 milliliters. Sparse cells and excessive cellular debris were observed on day one.By day four, adherent astrocytes were generated. Confluent cells with typical astrocyte morphology were observed by day eight of culture.

Vorbereitung und Pflege von gemischten Gliakulturen aus neonatalen Mäusegehirnen

Isolating Brains from E16-E18 Mouse Embryos for Primary Neuron Culture

Begin by coating T25 flasks with five milliliters of 10 micrograms per milliliter poly-L-ornithine, and incubate them. To isolate the brain from mouse embryos, lift the skin of the euthanized pregnant mouse's lower abdomen with tissue forceps. Using dissection scissors, perform a V-shaped incision from this point to the lower rib cage.Grab the uterine horns containing the embryos with tissue forceps, and gently remove the embryos from the abdominal cavity. Using spring scissors, create a midline incision at the top of the skull, starting from the back of the neck to the nose. Lift the skull away from the incision site to reveal the brain.Gently scoop out the brain with tissue forceps and transfer the brain to a 10 centimeter Petri dish containing 15 milliliters of Hanks'balanced salt solution. Under a dissection microscope, carefully remove the brainstem and the meninges on both sides of the brain cortices with a pair of micro forceps.

Isolierung von Gehirnen aus E16-E18-Mausembryonen für die primäre Neuronenkultur

Brain Dissociation and Seeding of Cortical Neurons in Cell Culture 

To begin, mince the isolated brains into pieces in the 50-milliliter conical tube with a sterile disposable scalpel blade. Add trypsin to the tube at a final concentration of 0.25%Immerse the tube in a 35 to 38 degrees Celsius hot water bath for 15 minutes. Gently pipette the tissue suspension up and down to dissociate cells.Then add 0.5 milliliters of fetal bovine serum to the homogenized suspension to neutralize trypsin activity. Filter the cell suspension through the 70-micrometer nylon mesh cell strainer. Using a one-milliliter syringe plunger, gently grind the tissue into the cell strainer.Then centrifuge the conical tube at 300 g for five minutes at four degrees Celsius. Discard the Poly-L-Ornithine in the T25 flasks and rinse the flasks three times with five milliliters of PBS. Carefully decant the tube to remove the supernatant and resuspend the cell pellet by gently pipetting with two to three milliliters of complete neurobasal media.Plate the cells in the Poly-L-Ornithine-coated T25 flasks with approximately 20 million cells per flask in five milliliters of complete neurobasal media. Incubate the cell culture at 37 degrees Celsius in a 5%carbon dioxide incubator. Neurons in T25 flasks and 96-well plates adhered and formed neurite processes by day three.Suboptimal neuron cultures contained cell clumps and debris.

Dissoziation und Aussaat von kortikalen Neuronen im Gehirn in Zellkultur 

Co-Culture of Primary Neurons and Microglia for Studying Microglia-Neuron Interactions

To begin, take neurons grown in T25 flasks for co-culture. Replace the media with five milliliters of versene solution containing trypsin and Dnase I.Add 0.5 milliliters of fetal bovine serum to neutralize the trypsin and Dnase I.Transfer cells to a 15 milliliter conical tube. Wash the flask with five milliliters of complete neurobasal media once to maximize the collected neurons.Then, centrifuge the cell suspension at 300 G for five minutes at four degrees celsius. After discarding the supernatant, gently resuspend the cell pellet in two to three milliliters of complete neurobasal media. Seed 100 microliters of the cell suspension to each well to obtain 75, 000 neurons per well, between eight to 10 days of mixed glia cultivation.Using a 10 milliliter pipette, gently wash the T75 flasks with glia culture media to collect microglia and transfer the cells and media into a sterile 50 milliliter conical tube. Centrifuge the cell collection at 300 G for five minutes at four degrees celsius. Once the supernatant is removed, gently resuspend the pellet in two milliliters of complete neurobasal media.From the 96-well neuronal culture plate, remove 100 microliters of neurobasal media and add 100 microliters of 250, 000 cells per milliliter cell suspension. In co-culture round and large microglia were observed on top or between neurons and neurite processes.