Unterstützt von Fundação de Amparo ein Fortgeschrittenen-do Estado do Rio de Janeiro (FAPERJ) und Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq). Wir bedanken uns bei anonymen Gutachtern, deren Kommentare dazu beigetragen, uns zu verbessern sowohl das Manuskript und Video.

Alle Chemikalien in fester Form gespeichert wird, wie 6-OHDA und Apomorphin, wurden in sterile Injektion Wasser verdünnt und filtriert in einem Laminar-Flow-Haube, um Verunreinigungen zu vermeiden. Darüber hinaus wurden Neurotoxine und neuroaktiven Stoffe gelagert, zubereitet, behandelt und entsorgt werden gemäß den Vorschriften von internationalen Richtlinien 6 und der örtlichen Kommission für Biosicherheit gesetzt. 1 - Anästhesie und Chirurgie Erwachsene männliche Swiss-Mäuse (25-30g) werden mit Atropin (0,2 mg / kg, sc) vorbehandelt, um Vagotonus zu reduzieren und dann betäubt mit einer intraperitonealen Injektion von Ketamin (90-120 mg / kg) und Xylazin (10 mg / Kg) . Das Tier ist auf einer elektronisch gesteuerten Heizkissen (Insight) platziert, um sicherzustellen, Körpertemperatur bei 37 ° C gehalten, wie die Induktion von Sedierung dauert einige Minuten. Die Anästhesie-Ebene ist während des gesamten Verfahrens durch die Prüfung der Abwesenheit des Rücktritts Reflex überprüft. Betäubungsmittel Dosierung sollte für jeden Stamm / Kolonie ajusted werden. Je nach Tier und Dauer der Operation, können zusätzliche Dosen von Ketamin notwendig sein. Danach wird Kochsalzlösung (NaCl 0,9%) auf beiden Augen aufgetragen, um die Hornhaut vor dem Austrocknen zu schützen und testen Sie die Abwesenheit des Blinkreflex in diesem ersten Augenblick an. Das Fell über die gesamte Kopf ist mit einem Trimmer rasiert wie möglich den Kontakt mit unsterilen Bereichen zu gewährleisten. Lokalanästhetikum (Xylocain) ist an das Ohr Bars angewendet, um Beschwerden zu vermeiden. Nur einmal Entzug und Blinkreflex sind verschwunden, die den Grad der Narkose ist tief genug für Chirurgie (Stufe 3), wird das Tier auf dem stereotaktischen Rahmen mit Mundstück und Ohr Bars speziell für diese Art (Insight) konzipiert positioniert. Sobald positionated, eine augenärztliche Salbe (MARCA) wird angewandt, um das Tier die Augen über alle Operationen zu schützen. Erst nachdem sicher sein, dass die Augen richtig geschützt sind, das Verfahren mit der Desinfektion der Haut des chirurgischen Region weiterhin durch Wiederholung drei Anwendungen von Povidon-Iod mit 70% Ethanol gefolgt, mit sterilen Tupfern Baumwollstoffe Nach, ist die richtige Platzierung des Ohres Bars gewährleistet durch die Prüfung für Seitwärtsbewegungen des Kopfes (der Kopf darf sich nicht bewegen, um sicherzustellen, dass die Balken sicher befestigt sind). Proper dorsoventrale Neigung des Kopfes wird später überprüft werden, wenn Schädel Wahrzeichen enthüllt werden. Ein sagittaler Schnitt (1,5 cm) ist mit einem sterilen Skalpell (# 15 Klinge) gefertigt. Das Periost über dem Bereich von Interesse ist sanft entfernt mit einem neuen Klinge abgeschabt und der Knochen sauber gewischt, mit steriler Blick und Wattestäbchen, um Schädel Sehenswürdigkeiten entdecken: Bregma als Schnittpunkt der sagittalen und Koronarnaht definiert, während lambda ist der Schnittpunkt der Sutura sagittalis und die beste Passform, die durch den linken und rechten Teile der Lambdanaht. Die Spitze eines vertikal ausgerichteten Referenz Nadel wird zunächst mit dem Bregma Null, geprüft durch das Operationsmikroskop, und wechselte dann als Lambda-Punkt zu berühren. Wenn der Kopf richtig positioniert ist, sollte Lambda gleichzeitig dorso-ventralen Ebene Bregma werden, und beide Wahrzeichen sollte um 4,2 mm entlang der rostro-caudalen Achse entfernt. Wenn nicht, sollten die Ohren Bars und Mundstück werden lockern und den Kopf vorsichtig gekippt um die interauralen Achse, um die gewünschte Position, die die &quot;flachen Schädel&quot; Referenz für stereotaxical Maßnahmen definiert zu erreichen. Die Spitze des Referenz-Nadel wird dann an der gewünschten Koordinaten positioniert: anterior-posterior (AP +0,5 mm) und lateralen (L -2,0 mm, links). Die Lage ist auf dem Schädel markiert und eine kleine (1,2 mm Durchmesser) Loch ist mit einer sterilisierten Bohrer eröffnet, mit intermittierenden Maßnahmen zur Wärme der Umgebung zu verhindern. Knochenfragmente werden sorgfältig mit einer zahnärztlichen Kürette entfernt und mit sterilen warmen 0,9% NaCl. Die sterilisierte 5 pl Hamilton-Spritze (26s messen; 0,47 mm Außendurchmesser) wird mit dem 6-OHDA-Lösung (oder Vehikel für Kontrolltiere) geladen und vertikal in den stereotaktischen Apparat ausgerichtet. Die Spitze der Nadel (Typ-2-oder 12 ° Fase) wird dann in das geöffnete Loch eingeführt, bis berühren pialen Oberfläche, auf den Referenzpunkt der dorso-ventralen koordinieren bestimmte. Sobald bestimmte diese zu koordinieren, wird die Nadel langsam abgesenkt, um die Koordinaten des Striatum zu erreichen (AP: +0,5; L: -2,0 und DV: -3,0 mm, unten pialen Oberfläche 7). Die 6-OHDA-Lösung (10 pg 6-OHDA in 0,9% NaCl mit 0,02% Ascorbinsäure), die bereit und filtriert in einem Laminar-Flow-Haube, und muss von Licht durch Aluminium-Folie während des gesamten Verfahrens geschützt werden, wird dann an injizierten einer Durchflussrate von 0.1μL/min. Für Kontroll-Tieren ist das gleiche Volumen des Fahrzeugs (0,02% Ascorbinsäure und 0,9% NaCl in sterilem Wasser) injiziert. Sobald die gesamte 2,0 ul injiziert wurde, ist die Spritze in Platz für 5 min gehalten, bevor sie ganz langsam aus dem Gehirn zurückgezogen, in nicht weniger als in 5 Minuten. Der Schädel ist gereinigt und der Schnitt wird geschlossen mit einem # 6-0 Nylonfaden (Shalon). Um ein zusätzlichesPflege gegen eine Infektion, kann ein lokaler Antibiotika-Salbe, wie Neomycin, die genäht Haut aufgetragen werden. Die Tiere sind aus dem Rahmen, da 0,5 ml Kochsalzlösung (sc.), um eine Austrocknung zu verhindern entfernt und warm gehalten und unter genauer Beobachtung bis zur vollständigen Genesung. Sie werden dann mit Futter und Wasser ad libitum untergebracht. Schmerzmittel, die Trinkwasser-Flasche für den ersten beiden Tagen nach der Operation (bei einem durchschnittlichen täglichen Wasserverbrauch von 5,5 ml und einer empfohlenen Dosierung von 0,03 mg Ibuprofen / g Körpergewicht / Tag aufgenommen, fügen Sie 0,82 mL von 20 mg / mL Ibuprofen-Abbott Suspension auf 100 ml Trinkwasser). Mäuse in der Regel sofort wieder aus dem Verfahren, Wandern und griff nach Wasser Futterpellets leicht. In jedem Fall offensichtlicher Beschwerden oder Anzeichen einer Infektion, sollten die Tiere gemäß den örtlichen Richtlinien eingeschläfert werden. 2 - Behavioral-Test Obwohl motorischen Beeinträchtigungen nach einer Woche beobachtet werden können, ist eine post-Läsion Abstand von einem Monat, bevor verlässliche Quantifizierung mit der Rotation-Test erlaubt. Das Tier erhält eine subkutane Injektion von DA-Agonisten Apomorphin (0,5 mg / Kg) und ist in einem undurchsichtigen Zylinder von 30 cm Durchmesser platziert, platziert 45 cm unterhalb der Aufnahme-Kamera. Es ist wichtig, damit keine Rückstände und Gerüche aus bisher getesteten Tieren, die vor jedem Test zu entfernen. Nach 5 min Gewöhnung Zeit werden die Bewegungen über eine 5 min Zeitrahmen erfasst. Beide contra-und ipsilateral Ganzkörper-Rotation werden gemessen und verglichen mit der Kontrollgruppe (Fahrzeug gespritzt). Wenn das Verfahren korrekt durchgeführt wurde, wird Kontrolltiere zeigen keine Drehung, während 6-OHDA lädierten Tieren beginnt Hinwendung zu der kontralateralen Seite, da die Agonisten vorwiegend aktiviert die hochempfindliche denervierten Striatum auf der lädierten Seite. Tiere Scoring über 7 min (Anzeige mindestens 7 Ganzkörper-kontralateralen Umdrehungen pro Minute) gelten als erfolgreich lädierten. Das Tier kann sicher ans Gehäuse 30 min nach dem Test, die wöchentlich wiederholt werden können zurückgegeben werden. In unseren Händen, erscheint weniger als 5% der verletzten Mäuse suboptimal Drehraten.

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	<li>Ungerstedt, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=6-hydroxy-dopamine+induced+degeneration+of+central+monoamine+neurons.">6-hydroxy-dopamine induced degeneration of central monoamine neurons.</a> Eur. J. Pharmacol. 5, 107-110 (1968).</li><li>Akerud, P., Canals, J. M., Snyder, E. Y., Arenas, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuroprotection+through+delivery+of+glial+cell+line-derived+neurotrophic+factor+by+neural+stem+cells+in+a+mouse+model+of+Parkinson's+Disease.">Neuroprotection through delivery of glial cell line-derived neurotrophic factor by neural stem cells in a mouse model of Parkinson's Disease.</a> J. Neurosci. 21, 8108-8118 (2001).</li><li>Ghosh, A., Roy, A., Liu, X., Kordower, J. H., Mufson, E. J., Hartley, D. M., Ghosh, S., Mosley, R. L., Gendelman, H. E., Pahan, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+inhibition+of+NF-kappaB+activation+prevents+dopaminergic+neuronal+loss+in+a+mouse+model+of+Parkinson's+Disease.">Selective inhibition of NF-kappaB activation prevents dopaminergic neuronal loss in a mouse model of Parkinson's Disease.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 104, 18754-18759 (2007).</li><li>Alvarez-Fischer, D., Henze, C., Strenzke, C., Westrich, J., Ferger, B., H&#246;glinger, G. U., Oertel, W. H., Hartmann, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+the+striatal+6-OHDA+model+of+Parkinson's+disease+in+wild+type+and+a-synuclein-deleted+mice.">Characterization of the striatal 6-OHDA model of Parkinson's disease in wild type and a-synuclein-deleted mice.</a> Exp. Neurol. 210, 182-193 (2008).</li><li>Ungerstedt, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=6-Hydroxydopamine-induced+degeneration+of+the+nigrostriatal+dopamine+pathway:+The+turning+syndrome.">6-Hydroxydopamine-induced degeneration of the nigrostriatal dopamine pathway: The turning syndrome.</a> Pharmacology and Therapeutics Part B: General and Systematic Pharmacology. 2, 37-40 (1976).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Guidelines for the Care and Use of Mammals in Neuroscience and Behaviour Research. , 209 (2003).</li><li>Franklin, K. B. J., Paxinos, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Mouse Brain in Stereotaxic Coordinates. , (1997).</li><li>Hudson, J. L., Horne, C. G. v. a. n., Str&#246;mberg, I., Brock, S., Clayton, J., Masserano, J., Hoffer, B. J., Gerhardt, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Correlation+of+apomorphine-+and+amphetamine-induced+turning+with+nigrostriatal+dopamine+content+in+unilateral+6-hydroxydopamine+lesioned+rats.+Brain+Res.">Correlation of apomorphine- and amphetamine-induced turning with nigrostriatal dopamine content in unilateral 6-hydroxydopamine lesioned rats. Brain Res.</a> , 626-6167 (1993).</li><li>Truong, L., Allbutt, H., Kassiou, M., Henderson, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developing+a+preclinical+model+of+Parkinson's+disease:+A+study+of+behaviour+in+rats+with+graded+6-OHDA+lesions.">Developing a preclinical model of Parkinson's disease: A study of behaviour in rats with graded 6-OHDA lesions.</a> Behav. Brain Res. 169, 1-9 (2006).</li><li>Harvey, B. K., Wang, Y., Hoffer, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transgenic+rodent+models+of+Parkinson's+disease.">Transgenic rodent models of Parkinson's disease.</a> Acta Neurochir. (Wien.). 101, 89-92 (2008).</li><li>Isacson, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ole+Isacson:+Development+of+New+Therapies+for+Parkinson's+Disease.">Ole Isacson: Development of New Therapies for Parkinson's Disease.</a> JoVE. 3, (2007).</li></ol>

Die Experimente wurden in Übereinstimmung mit den internationalen Richtlinien für die Pflege und Nutzung der Säugetiere in Neuroscience and Behavior Forschung durchgeführt<sup&gt; 6</sup&gt;, Nach Genehmigung durch die Institutional Animal Care und Verwenden Committee (Comissão de avaliação de Uso de Animais em Fortgeschrittenen: UFRJ / CAUAP Protokoll # DAHEICB 027). Angemessene Maßnahmen wurden ergriffen, um die Schmerzen und Beschwerden der Versuchstiere zu minimieren.

Umfangreiche einseitige Läsion des nigro-striatalen Bahn zuverlässig bei Mäusen erzielt werden durch eine einzige stereotaktische Injektion von 6-OHDA in das Striatum. Die Ausdehnung der Läsion kann post-mortem durch Immunhistochemie nachgewiesen werden für Tyrosinhydroxylase (was katalysiert den geschwindigkeitsbestimmenden Schritt der Synthese von DA, dh die Umwandlung von L-Tyrosin zu Dihydroxyphenylalanin), wie in dem Video dargestellt. In vivo sind kontralateralen Rotationen durch ...

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		<div>
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		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Ketamine hydrochloride</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>K&ouml;nig</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>90-120 mg/Kg</td>
</tr>
<tr>
<td>Xylazine hydrochloride</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>K&ouml;nig</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>10 mg/Kg</td>
</tr>
<tr>
<td>Atropine Sulfate</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Isofarma</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Isofarma</td>
</tr>
<tr>
<td>6 &#x2013; Hydroxydopamine Hydrochloride</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>5 &mu;g/&mu;L</td>
</tr>
<tr>
<td>L - Ascorbic Acid</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>USB Corporation</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>0.2%</td>
</tr>
<tr>
<td>Xylocaine (Lidocaine Chloridrate)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>ASTRA Chemistry</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>5% 50 mg</td>
</tr>
<tr>
<td>Nebacetin (Neomycin Sulfate + Bacitracin)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Altana Pharma</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>5 mg/g + 250 Ul/g</td>
</tr>
<tr>
<td>R-(-)-Apomorphine hydrochloride</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>0.5 mg/Kg</td>
</tr>
<tr>
<td>GenTeal lOphthalmic ointment Hypromellose</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>NOVARTIS</td>
<td>&nbsp;</td>
<td> 0.33%</td>
</tr>
<tr>
<td>Ibuprofen</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Abbott</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>4 mg/ 100 ml drinking water</td>
</tr>
<tr>
<td>Povidine</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>JohnsonDiversey</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>R-(-)-Apomorphine hydrochloride</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>0.5 mg/Kg</td>
</tr>		</tbody>
		</table>
		</div>

murine model for parkinson's disease: from 6-oh dopamine lesion to behavioral test

Morbus Parkinson (PD) betrifft mindestens 6,5 Millionen Menschen weltweit, unabhängig von Geschlecht, sozialer, ethnischer, wirtschaftlicher oder geografische Grenzen. Key Symptome wie Tremor, Rigor und bradikinesia, entwickeln sich, wenn etwa 3 / 4 der dopaminergen Zellen in der Substantia nigra sind verloren, und nicht, um für den reibungslosen und koordinierten Regelung der striatalen Motorstromkreisen bieten. Depression und Halluzinationen sind häufig, und Demenz tritt schließlich in 20% der Patienten. Zu diesem Zeitpunkt gibt es keine Behandlung zu verzögern oder stoppen das Fortschreiten der PD. Vielmehr sind die zurzeit verfügbaren Medikamente zielen stärker auf die Linderung der Symptome. Neue OP-Strategien können reversibel an das funktionell beschädigt Schaltungen durch die elektrische Stimulation von tief Hirnstrukturen wechseln, aber obwohl die tiefe Hirnstimulation ist ein bedeutender Fortschritt, ist es nicht für alle Patienten geeignet. Es bleibt daher notwendig, neue Zelltherapie Ansätze in präklinischen Modellen zu testen. Selektive neurotoxische Störungen des dopaminergen Bahnen können durch Injektion von 6-Hydroxydopamin (6-OHDA) oder MPTP reproduziert werden (1-Methyl-4-phenyl-1 ,2,3,6-tertahydropyridine), während abbauenden Drogen und oxidative-schädliche Chemikalien können auch reproduzieren Besonderheiten der PD bei Nagetieren. Im Gegensatz zu MPTP, verursachen 6-OHDA Läsionen massiven irreversiblen Verlust von Nervenzellen und kann uni-oder bilateral. Die 6-OHDA Läsion Modell ist zuverlässig, führt zu robusten motorische Defizite, und ist die am weitesten nach 40 Jahren Forschung in rats1 verwendet. Da Wechselwirkungen zwischen transplantierten Zellen und Gastgeber können nun genauer in Mäusen als bei Ratten untersucht werden, hat das Modell bei Mäusen 2,3, wo es vor kurzem 4 gekennzeichnet umgesetzt worden. In diesem Video zeigen wir, wie man Läsion der linken nigro-striatalen Weg von narkotisierten Mäusen durch langsam liefert 2,0 ul der 6-OHDA durch eine stereotaxically eingefügt Mikro-Kanüle. Der Verlust von dopaminergen Input erfolgt innerhalb weniger Tage, und die funktionellen Beeinträchtigungen können über post-operative Wochen und Monaten nach Bewertung Tier Rotationen von dopaminergen Wirkstoffen 5 induzierte überwacht werden. Hier zeigen wir Ganzkörper-kontralateralen Rotationen auftretenden 10 Minuten nach einer einzigen subkutanen Verabreichung von Apomorphin, gemessen ein Monat nach der Läsion. Ergebnisse und Nachteile werden im Folgenden erörtert.

Watch this Scientific Journal Video about Murine Model for Parkinson's Disease: from 6-OH Dopamine Lesion to Behavioral Test at JoVE.com

Murine Model for Parkinson&#039;s Disease: from 6-OH Dopamine Lesion to Behavioral Test

Parkinson-Krankheit ist durch den Verlust von dopaminergen Innervation des Striatum, die experimentell durch 6-OH-Dopamin induziert werden können verursacht werden. Wir beschreiben, wie eine stereotaktische Läsion durchzuführen und Apomorphin-induzierte Drehverhalten in Mäusen zu überwachen. Dieses Modell ist nützlich und zuverlässig für die Erprobung neuer Therapien für Parkinson-Krankheit.

Mausmodell für Morbus Parkinson: von 6-OH Dopamin Läsion Behavioral-Test

Parkinson's disease (PD) affects at least 6.5 million people worldwide, irrespective of gender, social, ethnic, economic, or geographic boundaries. Key ...

murine-model-for-parkinson-s-disease-from-6-oh-dopamine-lesion-to

Research

JoVE Journal

Biology

Murine Model for Parkinson's Disease: from 6-OH Dopamine Lesion to Behavioral Test

31.4K Aufrufe.  Universidade Federal do Rio de Janeiro, Brasil. Parkinson-Krankheit ist durch den Verlust von dopaminergen Innervation des Striatum, die experimentell durch 6-OH-Dopamin induziert werden können verursacht werden. Wir beschreiben, wie eine stereotaktische Läsion durchzuführen und Apomorphin-induzierte Drehverhalten in Mäusen zu überwachen. Dieses Modell ist nützlich und zuverlässig für die Erprobung neuer Therapien für Parkinson-Krankheit.

Serie: Murine Model for Parkinson's Disease: from 6-OH Dopamine Lesion to Behavioral Test

Ole Isacson: Development of New Therapies for Parkinson's Disease

Ole Isacson: Development of New Therapies for Parkinson&#039;s Disease

Ole Isacson gives a concise overview of Parkinsons's disease, its causes, therapeutic strategies, and advances in Parkinson's research.

Ole Isacson: Entwicklung neuer Therapien zur Behandlung der Parkinson-Krankheit

Forschung

Biologie

Primary Dissociated Midbrain Dopamine Cell Cultures from Rodent Neonates

The ability to create primary cell cultures of dopamine neurons allows for the study of the presynaptic characteristics of dopamine neurons in isolation from systemic input from elsewhere in the brain. In our lab, we use these neurons to assess dopamine release kinetics using carbon fiber amperometry, as well as expression levels of dopamine related genes and proteins using quantitative PCR and immunocytochemistry. In this video, we show you how we generate these cultures from rodent neonates.
The process involves several steps, including the plating of cortical glial astrocytes, the conditioning of neuronal cell culture media by the glial substrate, the dissection of the midbrain in neonates, the digestion, extraction and plating of dopamine neurons and the addition of neurotrophic factors to ensure cell survival.
The applications suitable for such a preparation include electrophysiology, immunocytochemistry, quantitative PCR, video microscopy (i.e., of real-time vesicular fusion with the plasma membrane), cell viability assays and other toxicological screens.

Primary dissociated midbrain dopamine cell cultures allow for the study of presynaptic characteristics of dopamine neurons. They can be used to monitor real-time dopamine release kinetics and protein/mRNA levels of regulators of dopamine exocytosis. Here, we show you how to generate these cultures from rodent neonates.

Primäre Dissoziierte Mittelhirn Dopamin Zellkulturen aus Nager Neugeborene

The ability to create primary cell cultures of dopamine neurons allows for the study of the presynaptic characteristics of dopamine neurons in isolation ...

Application of a C. elegans Dopamine Neuron Degeneration Assay for the Validation of Potential Parkinson's Disease Genes

Improvements to the diagnosis and treatment of Parkinson's disease (PD) are dependent upon knowledge about susceptibility factors that render populations at risk. In the process of attempting to identify novel genetic factors associated with PD, scientists have generated many lists of candidate genes, polymorphisms, and proteins that represent important advances, but these leads remain mechanistically undefined. Our work is aimed toward significantly narrowing such lists by exploiting the advantages of a simple animal model system. While humans have billions of neurons, the microscopic roundworm Caenorhabditis elegans has precisely 302, of which only eight produce dopamine (DA) in hemaphrodites. Expression of a human gene encoding the PD-associated protein, alpha-synuclein, in C. elegans DA neurons results in dosage and age-dependent neurodegeneration.
Worms expressing human alpha-synuclein in DA neurons are isogenic and express both GFP and human alpha-synuclein under the DA transporter promoter (Pdat-1). The presence of GFP serves as a readily visualized marker for following DA neurodegeneration in these animals. We initially demonstrated that alpha-synuclein-induced DA neurodegeneration could be rescued in these animals by torsinA, a protein with molecular chaperone activity 1. Further, candidate PD-related genes identified in our lab via large-scale RNAi screening efforts using an alpha-synuclein misfolding assay were then over-expressed in C. elegans DA neurons. We determined that five of seven genes tested represented significant candidate modulators of PD as they rescued alpha-synuclein-induced DA neurodegeneration 2. Additionally, the Lindquist Lab (this issue of JoVE) has performed yeast screens whereby alpha-synuclein-dependent toxicity is used as a readout for genes that can enhance or suppress cytotoxicity. We subsequently examined the yeast candidate genes in our C. elegans alpha-synuclein-induced neurodegeneration assay and successfully validated many of these targets 3, 4.
Our methodology involves generation of a C. elegans DA neuron-specific expression vector using recombinational cloning of candidate gene cDNAs under control of the Pdat-1 promoter. These plasmids are then microinjected in wild-type (N2) worms, along with a selectable marker for successful transformation. Multiple stable transgenic lines producing the candidate protein in DA neurons are obtained and then independently crossed into the alpha-synuclein degenerative strain and assessed for neurodegeneration, at both the animal and individual neuron level, over the course of aging.

Application of a C. elegans Dopamine Neuron Degeneration Assay for the Validation of Potential Parkinson&#039;s Disease Genes

This video demonstrates how to use C. elegans to assess dopaminergic neuron neurodegeneration as a model for Parkinson's disease. Furthermore, genetic screens are used to identify factors that either enhance degeneration or are neuroprotective.

Die Anwendung eines C. elegans Dopamin Neuron Degeneration Assay für die Validierung von potenziellen Parkinson Genes

Improvements to the diagnosis and treatment of Parkinson's disease (PD) are dependent upon knowledge about susceptibility factors that render populations ...

Xenopus laevis as a Model to Identify Translation Impairment

Protein synthesis is a fundamental process to gene expression impacting diverse biological processes notably adaptation to environmental conditions. The initiation step, which involves the assembly of the ribosomal subunits at the mRNA initiation codon, involved initiation factor including eIF4G1. Defects in this rate limiting step of translation are linked to diverse disorders. To study the potential consequences of such deregulations, Xenopus laevis oocytes constitute an attractive model with high degrees of conservation of essential cellular and molecular mechanisms with human. In addition, during meiotic maturation, oocytes are transcriptionally repressed and all necessary proteins are translated from preexisting, maternally derived mRNAs. This inexpensive model enables exogenous mRNA to become perfectly integrated with an effective translation. Here is described a protocol for assessing translation with a factor of interest (here eIF4G1) using stored maternal mRNA that are the first to be polyadenylated and translated during oocyte maturation as a physiological readout. At first, mRNA synthetized by in vitro transcription of plasmids of interest (here eIF4G1) are injected in oocytes and kinetics of oocyte maturation by Germinal Vesicle Breakdown detection is determined. The studied maternal mRNA target is the serine/threonine-protein-kinase mos. Its polyadenylation and its subsequent translation are investigated together with the expression and phosphorylation of proteins of the mos signaling cascade involved in oocyte maturation. Variations of the current protocol to put forward translational defects are also proposed to emphasize its general applicability. In light of emerging evidence that aberrant protein synthesis may be involved in the pathogenesis of neurological disorders, such a model provides the opportunity to easily assess this impairment and identify new targets.

Xenopus laevis as a Model to Identify Translation Impairment

Protein synthesis control occurs mainly at the translation initiation step, deficiencies in which are linked to diverse disorders. To better understand their etiology, we described here a protocol using Xenopus laevis oocytes assessing the translation of mos transcript in the presence of a mutant of translation initiation factor eIF4G1.

Xenopus laevis als Modell zur Übersetzung Impairment Identifizieren

Protein synthesis is a fundamental process to gene expression impacting diverse biological processes notably adaptation to environmental conditions. The ...

Magnetic-Activated Cell Sorting Strategies to Isolate and Purify Synovial Fluid-Derived Mesenchymal Stem Cells from a Rabbit Model

Mesenchymal stem cells (MSCs) are the main cell source for cell-based therapy. MSCs from articular cavity synovial fluid could potentially be used for cartilage tissue engineering. MSCs from synovial fluid (SF-MSCs) have been considered promising candidates for articular regeneration, and their potential therapeutic benefit has made them an important research topic of late. SF-MSCs from the knee cavity of the New Zealand white rabbit can be employed as an optimized translational model to assess human regenerative medicine. By means of CD90-based magnetic activated cell sorting (MACS) technologies, this protocol successfully obtains rabbit SF-MSCs (rbSF-MSCs) from this rabbit model and further fully demonstrates the MSC phenotype of these cells by inducing them to differentiate to osteoblasts, adipocytes, and chondrocytes. Therefore, this approach can be applied in cell biology research and tissue engineering using simple equipment and procedures.

This article presents a simple and economic protocol for the straightforward isolation and purification of mesenchymal stem cells from New Zealand white rabbit synovial fluid.

Magnetische aktiviert Zelle Sortieren Strategien zu isolieren und reinigen Synovial Flüssigkeit abgeleitet mesenchymalen Stammzellen aus einem Kaninchen-Modell

Mesenchymal stem cells (MSCs) are the main cell source for cell-based therapy. MSCs from articular cavity synovial fluid could potentially be used for ...

Noninvasive Monitoring of Lesion Size in a Heterologous Mouse Model of Endometriosis

Here, we describe a protocol for the implementation of a heterologous mouse model in which progression of endometriosis can be assessed in real time through noninvasive monitoring of fluorescence emitted by implanted ectopic human endometrial tissue. For this purpose, biopsies of human endometrium are obtained from donor women ongoing oocyte donation. Human endometrial fragments are cultured in the presence of adenoviruses engineered to express cDNA for the reporter fluorescent protein mCherry. Upon visualization, labeled tissues with an optimal rate of fluorescence after infection are subsequently chosen for the implantation in recipient mice. One week prior to the implantation surgery, recipient mice are oophorectomized, and estradiol pellets are placed subcutaneously to sustain the survival and growth of lesions. On the day of surgery mice are anesthetized, and peritoneal cavity accessed through a small (1.5 cm) incision by the linea-alba. Fluorescently labeled implants are tweezed, briefly soaked in glue and attached to the peritoneal layer. Incisions are sutured, and animals left to recover for a couple of days. Fluorescence emitted by endometriotic implants is usually non-invasively monitored every 3 days for 4 weeks with an in vivo imaging system. Variations in the size of endometriotic implants can be estimated in real time by quantification of the mCherry signal and normalization against the initial time-point showing maximal fluorescence intensity.
Traditional preclinical rodents of models of endometriosis do not allow non-invasive monitoring of lesion in real time but rather allow evaluation of the effects of drugs assayed at the end point. This protocol allows one to track lesions in real time and is more useful to explore the therapeutic potential of drugs in preclinical models of endometriosis. The main limitation of the model thus generated is that non-invasive monitoring is not possible over long periods of time due to the episomal expression of Ad-virus.

Here, we present a protocol for live-imaging of fluorescently labeled human endometrial fragments grafted in mice. The method allows studying the effects of drugs of choice on endometriotic lesion size through monitoring and quantification of fluorescence emitted by the fluorescent reporter on real time

Nicht-invasive Überwachung der Größe der Läsion in einer heterologen Mausmodell der Endometriose

Here, we describe a protocol for the implementation of a heterologous mouse model in which progression of endometriosis can be assessed in real time ...

Mass Spectrometry Analysis to Identify Ubiquitylation of EYFP-tagged CENP-A (EYFP-CENP-A)

Studying the structure and the dynamics of kinetochores and centromeres is important in understanding chromosomal instability (CIN) and cancer progression. How the chromosomal location and function of a centromere (i.e., centromere identity) are determined and participate in accurate chromosome segregation is a fundamental question. CENP-A is proposed to be the non-DNA indicator (epigenetic mark) of centromere identity, and CENP-A ubiquitylation is required for CENP-A deposition at the centromere, inherited through dimerization between cell division, and indispensable to cell viability.
Here we describe mass spectrometry analysis to identify ubiquitylation of EYFP-CENP-A K124R mutant suggesting that ubiquitylation at a different lysine is induced because of the EYFP tagging in the CENP-A K124R mutant protein. Lysine 306 (K306) ubiquitylation in EYFP-CENP-A K124R was successfully identified, which corresponds to lysine 56 (K56) in CENP-A through mass spectrometry analysis. A caveat is discussed in the use of GFP/EYFP or the tagging of high molecular weight protein as a tool to analyze the function of a protein. Current technical limit is also discussed for the detection of ubiquitylated bands, identification of site-specific ubiquitylation(s), and visualization of ubiquitylation in living cells or a specific single cell during the whole cell cycle.
The method of mass spectrometry analysis presented here can be applied to human CENP-A protein with different tags and other centromere-kinetochore proteins. These combinatory methods consisting of several assays/analyses could be recommended for researchers who are interested in identifying functional roles of ubiquitylation.

Mass Spectrometry Analysis to Identify Ubiquitylation of EYFP-tagged CENP-A EYFP-CENP-A

CENP-A ubiquitylation is an important requirement for CENP-A deposition at the centromere, inherited through dimerization between cell division, and indispensable to cell viability. Here we describe mass spectrometry analysis to identify ubiquitylation of EYFP-tagged CENP-A (EYFP-CENP-A) protein.

Massenspektrometrieanalyse zur Identifizierung der Ubiquitylierung von EIFP-A mit EYFP-Tags (EYFP-CENP-A)

Studying the structure and the dynamics of kinetochores and centromeres is important in understanding chromosomal instability (CIN) and cancer ...

Isolation of High Quality Murine Atrial and Ventricular Myocytes for Simultaneous Measurements of Ca2+ Transients and L-Type Calcium Current

Mouse models play a crucial role in arrhythmia research and allow studying key mechanisms of arrhythmogenesis including altered ion channel function and calcium handling. For this purpose, atrial or ventricular cardiomyocytes of high quality are necessary to perform patch-clamp measurements or to explore calcium handling abnormalities. However, the limited yield of high-quality cardiomyocytes obtained by current isolation protocols does not allow both measurements in the same mouse. This article describes a method to isolate high-quality murine atrial and ventricular myocytes via retrograde enzyme-based Langendorff perfusion, for subsequent simultaneous measurements of calcium transients and L-type calcium current from one animal. Mouse hearts are obtained, and the aorta is rapidly cannulated to remove blood. Hearts are then initially perfused with a calcium-free solution (37 &#176;C) to dissociate the tissue at the level of intercalated discs and afterwards with an enzyme solution containing little calcium to disrupt extracellular matrix (37 &#176;C). The digested heart is subsequently dissected into atria and ventricles. Tissue samples are chopped into small pieces and dissolved by carefully pipetting up and down. The enzymatic digestion is stopped, and cells are stepwise reintroduced to physiologic calcium concentrations. After loading with a fluorescent Ca2+-indicator, isolated cardiomyocytes are prepared for simultaneous measurement of calcium currents and transients. Additionally, isolation pitfalls are discussed and patch-clamp protocols and representative traces of L-type calcium currents with simultaneous calcium transient measurements in atrial and ventricular murine myocytes isolated as described above are provided.

Isolation of High Quality Murine Atrial and Ventricular Myocytes for Simultaneous Measurements of Ca2+ Transients and L-Type Calcium Current

Mouse models allow studying key mechanisms of arrhythmogenesis. For this purpose, high quality cardiomyocytes are necessary to perform patch-clamp measurements. Here, a method to isolate murine atrial and ventricular myocytes via retrograde enzyme-based Langendorff perfusion, which allows simultaneous measurements of calcium-transients and L-type calcium current, is described.

Isolierung von hochwertigen atrialen und ventrikulären Myozyten der Maus für die simultane Messung von Ca2+ Transienten und L-Typ Calciumstrom

Mouse models play a crucial role in arrhythmia research and allow studying key mechanisms of arrhythmogenesis including altered ion channel function and ...

Rating L-DOPA-Induced Dyskinesias in the Unilaterally 6-OHDA-Lesioned Rat Model of Parkinson's Disease

L-DOPA-induced dyskinesias (LIDs) refer to motor complications that arise from prolonged L-DOPA administration to patients with Parkinson's disease (PD). The most common pattern observed in the clinic is the peak-dose dyskinesia which consists of clinical manifestations of choreiform, dystonic, and ballistic movements. The 6-hydroxydopamine (6-OHDA) rat model of PD mimics several characteristics of LIDs. After repeated L-DOPA administration, 6-OHDA-lesioned rats exhibit dyskinetic-like movements (e.g., abnormal involuntary movements, AIMs). This protocol demonstrates how to induce and analyze AIMs in 6-OHDA-lesioned rats with 90%-95% dopaminergic depletion in the nigrostriatal pathway. Repeated administration (3 weeks) of L-DOPA (5 mg/kg, combined with 12.5 mg/kg of benserazide) can induce the development of AIMs. The time course analysis reveals a significant increase in AIMs at 30-90 min (peak-dose dyskinesia). Rodent models of LIDs are an important preclinical tool to identify effective antidyskinetic interventions.

Rating L-DOPA-Induced Dyskinesias in the Unilaterally 6-OHDA-Lesioned Rat Model of Parkinson&#039;s Disease

Rodent models of L-DOPA-induced dyskinesias are invaluable tools to identify therapeutic interventions to attenuate the development or alleviate the manifestations that emerge due to the repeated administration of L-DOPA. This protocol demonstrates how to induce and analyze dyskinetic-like movements in the unilaterally 6-OHDA-lesioned rat model of Parkinson's disease.

Bewertung von L-DOPA-induzierten Dyskinesien im einseitig 6-OHDA-läsionierten Rattenmodell der Parkinson-Krankheit

L-DOPA-induced dyskinesias (LIDs) refer to motor complications that arise from prolonged L-DOPA administration to patients with Parkinson's disease (PD). ...

3D-Kultur von Organoiden aus murinen Darmkrypten und einzelnen Stammzellen

The 3D Culturing of Organoids from Murine Intestinal Crypts and a Single Stem Cell for Organoid Research

At present, organoid culture represents an important tool for in vitro studies of different biological aspects and diseases in different organs. Murine small intestinal crypts can form organoids that mimic the intestinal epithelium when cultured in a 3D extracellular matrix. The organoids are composed of all cell types that fulfill various intestinal homeostatic functions. These include Paneth cells, enteroendocrine cells, enterocytes, goblet cells, and tuft cells. Well-characterized molecules are added into the culture medium to enrich the intestinal stem cells (ISCs) labeled with leucine-rich repeats containing G protein-coupled receptor 5 and are used to drive differentiation down specific lineages; these molecules include epidermal growth factor, Noggin (a bone morphogenetic protein), and R-spondin 1. Additionally, a protocol to generate organoids from a single erythropoietin-producing hepatocellular receptor B2 (EphB2)-positive ISC is also detailed. In this methods article, techniques to isolate small intestinal crypts and a single ISC from tissues and ensure the efficient establishment of organoids are described.

Autor im Rampenlicht: Die 3D-Kultivierung von Organoiden aus murinen Darmkrypten und einer einzelnen Stammzelle für die Organoidforschung  

We describe a protocol to isolate murine small intestinal crypts and culture intestinal 3D organoids from the crypts. Additionally, we describe a method to generate organoids from a single intestinal stem cell in the absence of a sub-epithelial cellular niche.

Die 3D-Kultivierung von Organoiden aus murinen Darmkrypten und einer einzelnen Stammzelle für die Organoidforschung

At present, organoid culture represents an important tool for in vitro studies of different biological aspects and diseases in different organs. Murine ...