Teil 1: Fluoreszenzmarkierung von cDNA Der Cy3-Farbstoff in der Microarray-Experiment verwendet wird sensibel auf Foto-Abbau. Das Verfahren soll in einer minimalen Menge an Licht zu nehmen. Die Kennzeichnung Protokoll wurde von der BioPrime Array-CGH Genomic Labeling System Manual 1 angepasst. <ol><li> Die Reagenzien für die Kennzeichnung Reaktion bei -20 ° C gelagert Von der BioPrime Array-CGH Genomic Labeling System Tauwetter 2.5X Random Primer Buffer, 10X dCTP-Mix und Nuklease-freies Wasser. Auch auftauen Cy3-dCTP Farbstoff. Nach dem Auftauen kurz zentrifugieren alle Reagenzien vor dem Gebrauch. </li><li> Eine separate Kennzeichnung Reaktion müssen für jede cDNA zu analysierende Probe abgeschlossen sein. In einem 0,6 ml dickwandigen Rohr add 500 ng cDNA, 40 ul 2,5 X Random Primer Buffer und Nuklease-freiem Wasser auf ein Gesamtvolumen von 86 ul zu erreichen. </li><li> Gut mischen und kurz zentrifugieren. Inkubieren Reaktion für 5 Minuten bei 100 ° C auf einem Thermocycler. </li><li> Unmittelbar Transfer-Reaktion in ein Eisbad Gülle für 10 Minuten. </li><li> Zu jedem Röhrchen fügen Sie dann 10 ul 10x dCTP-Mix, 2 ul 1 mM Cy3-dCTP und 2 ul Exo Klenow-DNA-Polymerase. Die Exo Klenow DNA Polymerase sollte in den Gefrierschrank gelassen werden, bis sie benötigt und sollte immer auf Eis gehalten werden. </li><li> Mix Reaktion gut und kurz zentrifugieren. </li><li> Inkubieren Reaktion bei 37 ° C für 16 Stunden in einem Thermocycler. </li></ol> Teil 2: Fällung von markierten cDNA <ol><li> Bevor Sie fortfahren in dem Protokoll wieder auf die NimbleGen Hybridization System und damit das System auf 42 ° C stehen gelassen </li><li> Für jede Reaktion, legen Sie ein Microcon Säule in ein 1,5 ml-Tube. Geben Sie 300 ul 0,1 X SSC, um jede Spalte durch den Inhalt der Kennzeichnung Reaktion (100 ul). </li><li> Zentrifugieren Sie die Röhrchen mit der Säule bei 16.100 xg für 10 Minuten bei 4 ° C. </li><li> Verwerfen Sie den Durchfluss durch, die leicht rosa kann in Farbe, und fügen Sie weitere 300 ul 0,1 X SSC Spalte. </li><li> Wiederholen Sie die Zentrifugation bei 16.100 xg für 10 Minuten bei 4 ° C. </li><li> Verwerfen Sie den Durchfluss durch und füge eine weitere 300 ul 0,1 X SSC Spalte. </li><li> Zentrifugation bei 16.100 xg für 12 Minuten bei 4 ° C. </li><li> Entsorgen Sie durchströmen. Die Durchströmung sollte nach diesem letzten waschen klar, und Sie sollten in der Lage sein, um die rosa markierten cDNA auf die Spalte klicken. </li><li> Apply 100 ul Nuklease-freies Wasser in die Spalte. Entfernen Sie die Spalte aus dem 1,5-ml-Tube und invertieren Säule in ein neues 1,5-ml-Tube. </li><li> Zentrifuge bei 2.300 xg für 2 Minuten bei 4 ° C. Die markierten cDNA sollte in das Wasser, das an der Unterseite des Rohres sammelt rehydriert werden. </li><li> Verwenden Sie einen NanoDrop ND-1000 Spektrophotometer nach den Anweisungen des Herstellers, um DNA-Konzentration berechnen und auswerten Farbstoff Aufnahme durch die Berechnung der Basis-Verhältnis Farbstoff, wo das Nukleotid an Cy3-Verhältnis entspricht dem A 260 / A 550-Verhältnis von 23,15 multipliziert. Die Basis zu färben Verhältnis sollte zwischen 50 und 80 sein. </li><li> Wenn cDNA wenn beschriftet ausreichend, etikettiert aliquoten 6 ug cDNA in ein neues 1,5-ml-Tube. </li><li> Mix in 0,1 × Volumen 3 M NaOAc, pH 5,2 und 1X Volumen Isopropanol. Eine Mischung im Dunkeln für 30 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren. </li><li> Next Zentrifuge die Probe bei 16.100 xg für 20 Minuten bei Raumtemperatur. </li><li> Vorsichtig den Überstand verwerfen, ohne die DNA-Pellet, das rosa sein sollte in Farbe. </li><li> Führen Sie eine Ethanol waschen durch Zugabe von 500 ul 70% EtOH zugeben und durch vorsichtiges Schwenken. </li><li> Centrifuge Probe bei 16.100 xg für 5 Minuten bei Raumtemperatur. </li><li> Entfernen Sie den Überstand, das Röhrchen und lassen Sie das Pellet für 5 Minuten trocknen lassen. Bei diesem Schritt das Pellet kann bei -20 ° C gelagert werden, wenn gewünscht oder kann das Protokoll auf der Hybridisierung fortgesetzt werden. </li></ol> Teil 3: Hybridisierung Die Hybridisierung Verfahren ist von der Roche NimbleGen Arrays Benutzerhandbuch für Genexpressionsanalyse 2 angepasst. <ol><li> Lösen Sie das Pellet in 5 ul der Nuklease-freies Wasser. </li><li> Sobald das Pellet gelöst ist hinzuzufügen Hybridisierung Komponenten in Tabelle 1 aufgeführt. Hybridisierung Komponenten werden von der Roche NimbleGen Hybridization Kit. Nachdem alle Komponenten hinzugefügt werden, das Gesamtvolumen sollte nun insgesamt 18 ul. Gut mischen und kurz drehen Sie das Rohr, um den Inhalt am Boden sammeln. </li><li> Der nächste Schritt ist, um die markierte cDNA, indem sie auf einem Heizblock bei 95 ° C für 5 Minuten denaturiert. </li><li> Sofortüberweisung das Rohr auf die NimbleGen Hybridization System während der Arrays in den folgenden Schritten bereit sind. </li><li> Microarrays sollte immer sorgfältig behandelt und gelagert werden gemäß den Anweisungen des Herstellers. Roche NimbleGen empfiehlt die Speicherung ihrer Expressions-Arrays in der Dunkelheit mit Trockenmittel bei Raumtemperatur. </li><li> Laden Sie das Array in der Präzisions-Mixer Alignment Tool (PMAT) in die NimbleGen Array-Signalverarbeitung Zubehör zur Verfügung gestellt. </li> &lt;li&gt; Laden Sie ein X1-Mixer auf den PMAT und entfernen Sie die Klebestreifen mit einer Pinzette. Schließen Sie die PMAT sicher. Drücken Sie auf den Mixer durch das Loch in der PMAT und langsam geöffnet, so dass das Array und Mixer aus dem PMAT lösen. </li><li> Fest drücken Sie mit der Brayer um die Außenseite des Mischers, um die Dichtung auf das Array zu gewährleisten ist vollständig und zu jeder Blasen zu entfernen. Legen Sie die Array-Mischer Komplexes auf die Hybridisierung System warm. </li><li> Mit einer Pipette langsam zugeben 15 ul der markierten Probe in die Einfüllöffnung. Dies ist das Loch in der Mitte des Mixers. Wenden Sie langsam und stetig Druck auf die Pipette, so dass die Probe gleichmäßig verteilt über den Mixer ohne Luftblasen. Wischen Sie überschüssiges Probe aus der Bullaugen und Dichtung Port Löcher mit Klebestreifen. </li><li> Schließen Sie die Verriegelung und starten Vermischung der Hybridisierungslösung mit dem Programm B auf der NimbleGen Hybridization System. Lassen Microarrays für 16-20 Stunden hybridisieren. </li></ol> Teil 4: Post-Hybridisierung Wash und Scannen von Microarrays Die Wasch-und Scan-Vorgang wird von der Roche NimbleGen Arrays Benutzerhandbuch für Genexpressionsanalyse 2 angepasst. <ol><li> Nach Hybridisierung ist kurz vor dem Abschluss vorzubereiten Waschpuffer wie in Tabelle 2 dargestellt. Pre-warmen Waschpuffer IA bis 42 ° C in einem Wasserbad. </li><li> Schalten Sie GenePix 4000B Array-Scanner und lassen Sie den Scanner für etwa 15 Minuten vor dem Gebrauch warm. </li><li> Gießen Sie den vorgewärmten Waschpuffer IA in eine Schale. </li><li> Entfernen Sie die Array-Mischer Komplex aus der NimbleGen Hybridisierung und gleiten in die Schablone (im Lieferumfang enthalten in der NimbleGen Array-Signalverarbeitung Zubehör). Tauchen Montage in vorgewärmten Waschpuffer IA und entfernen Sie vorsichtig Mischer durch Abziehen von Folie. </li><li> Remove Array aus Vorrichtungs-und agitieren für 15 Sekunden in Waschpuffer IA. </li><li> Schnelle Übertragung von Array in eine Folie Rack in die Raumtemperatur Waschpuffer IB. Man schüttelt die Dia-Rack 2 Minuten kräftig. </li><li> Die Objektträger-Rack in Waschpuffer II und agitieren für 1 Minute. </li><li> Die Objektträger-Rack in den Waschpuffer III und agitieren für 15 Sekunden. </li><li> Übertragen Sie die Array in die Folie Trocknungszentrifuge und Spin für 2 Minuten, um alle Feuchtigkeit zu entfernen. Gehen Sie zum Scannen. </li><li> Es wird empfohlen, um das Array zu scannen, da der Farbstoff ist empfindlich gegen Licht und Ozon. </li><li> Laden Sie das Array, Barcode nach unten in die GenePix 4000B Array-Scanner. </li><li> Öffnen Sie die GenePix Pro-Software und fahren Sie mit Scannen von Array. Die Roche NimbleGen Genexpressionsarrays nutzen eine Farbe Hybridisierung Strategie. Als Ergebnis nur eine Wellenlänge ist für das Scannen erforderlich. Scan Cy3 Fluoreszenz-Signal mit der 532 nm-Laser. Öffnen Sie die Hardware-Einstellung im Dialogfeld und stellen PMT Wert der 532 nm-Laser auf einen Wert von 500. </li><li> In der Hardware-Einstellung im Dialogfeld eingestellten Leistung bis 100%, Pixelgröße bis 5 Mikron, Linien, um durchschnittlich 1, und Fokuslage auf 0 Mikron. </li><li> Führen Sie eine Vorschau-Scan und Scan-Bereich gesetzt. </li><li> Führen Sie zu scannen. </li><li> Sobald das Scannen abgeschlossen ist überprüfen Sie die Bild-Histogramm. Idealerweise 1e-5 normalisiert zählt sollten bei 65.000 Sättigungsgrenze dh ~ 1-2% der Features sind gesättigt werden. Wenn die normierten Werte von weniger als 1e-5 sind, erhöhen Sie die PMT-Verstärkung und scannen Sie das Bild. Wenn die normierte zählt mehr als 1e-5 sind, verringern Sie die PMT-Verstärkung und scannen Sie das Bild. </li><li> Sobald das Scannen abgeschlossen ist das Bild speichern. Es wird empfohlen, eine Standard-Namenskonvention für Bilder für Leichtigkeit in Bezug zu wählen. Das Bild kann nun in die Datenanalyse-Programm der Vorliebe für Daten-Normalisierung und Berechnung der Intensität Werte geladen werden. </li></ol> Repräsentative Ergebnisse Sie können erst beginnen, um die Effizienz des Cy3 Fluoreszenz-Markierung Reaktion der cDNA zu beurteilen, wenn zu Beginn der Waschungen mit 0,1 × SSC. Bei jedem weiteren waschen die Durchströmung sollte weniger rosa in der Farbe mit dem letzten Durchströmung klar. Darüber hinaus sollten die Cy3-markierten cDNA-Produkt auf der Säule sichtbar in diesen Waschschritten. Wenn der Durchfluss durch ist hell rosa in der Farbe oder es ist kein rosa Produkt auf der Säule, ist dies ein guter Hinweis darauf, dass die Kennzeichnung Reaktion nicht richtig gehen. Die Kennzeichnung Reaktion kann beurteilt quantitativ mit dem NanoDrop ND-1000-Spektralphotometer zur Konzentration der markierten DNA und Basis zu färben Verhältnis (Abbildung 1) zu bestimmen. Die Kennzeichnung Reaktion routinemäßig ergibt mindestens 10 pg markierter DNA in unserem Labor. Dye Einarbeitung kann mit einem einfachen base / Farbstoff-Verhältnis, wo das Nukleotid an Cy3-Verhältnis entspricht dem A 260 / A 550-Verhältnis von 23,15 multipliziert. Werte im Bereich von 50 bis 80 zeigen, ausreichend Farbstoff Einarbeitung in die Kennzeichnung Reaktion. Wenn die Kennzeichnung Reaktion ergibt sich eine niedrige Konzentration von DNA oder schlechte Farbstoff Gründung, Hybridisierung der Probe auf die microarray wird nicht empfohlen und Kennzeichnung Reaktion sollte wiederholt werden. Beurteilung der Qualität der Hybridisierung kann durch die Auswertung der Bild-Histogramm und das gescannte Bild des Mikroarrays (Abbildung 2) durchgeführt werden. Acceptable Hybridisierungen haben 1-2% der Funktionen gesättigt (dh, wodurch 1e-5 normalisierte Zählungen an die 65.000 Sättigungsgrenze) mit der PMT Wert nahe 500 gesetzt. Wenn die PMT Wert drastisch von 500 eingestellt werden, um 1e-5 normalisierte Zählungen an die 65.000 Sättigungsgrenze erreichen, dies in der Regel deutet auf eine schlechte Hybridisierung der markierten cDNA auf den Mikroarray. Die Datenqualität wird zusammen, wenn diese Daten durch die anschließende Analyse fortgesetzt wird. Hybridisierung Qualität kann auch qualitativ, indem Sie Bilder der gescannten Array (Abbildung 3) beurteilt werden. Die Roche NimbleGen Hybridization Kit enthält eine Ausrichtung Oligo Mischung aus Cy3-und Cy5-markierten 48mer-Oligonukleotide, die Ausrichtung Features auf den Arrays hybridisiert. Qualitative Beurteilung der Intensität der Ausrichtung Oligos auf andere Funktionen auf dem Array ermöglicht einen Qualitäts-Check auf der Hybridisierung Effizienz der fluoreszenzmarkierten cDNA auf dem Array. Nach weiteren Untersuchungen kann ein Streudiagramm der analysierten Daten verwendet werden, um die relativen Niveaus der Genexpression zu bestimmen und Gene, die zwischen Ihrem Proben (Abbildung 4) zum Ausdruck zu identifizieren. <img src="/files/ftp_upload/1471/1471figure1thumb.jpg" alt="Vorschaubild von Abbildung 1" /> Abbildung 1. Ein NanoDrop Spektrum von cDNA markiert mit Cy3. Markierten cDNA-Ausbeute und Farbstoff Einarbeitung kann anhand einer NanoDrop ND-1000-Spektrophotometer werden. Bitte <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1471/1471figure1.jpg">klicken Sie hier,</a> um eine größere Version der Abbildung 1 zu sehen. <img src="/files/ftp_upload/1471/1471figure2thumb.jpg" alt="Vorschaubild von Abbildung 1" /> Abbildung 2. Ein GenePix Histogramm für Microarray-Scan. Qualität der Hybridisierung kann durch die Auswertung der Bild-Histogramm beurteilen. Acceptable Hybridisierungen haben 1-2% der Funktionen mit 1e-5 normalisierte Zählungen an die 65.000 Sättigungsgrenze mit der PMT Wert nahe 500 gesetzt gesättigt. Bitte <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1471/1471figure2.jpg">klicken Sie hier,</a> um eine größere Version der Abbildung 2 zu sehen. <img src="/files/ftp_upload/1471/1471figure3.jpg" border="0" alt="Abbildung 3" /> Abbildung 3. Eine eingescannte Microarray Bild. Hybridisierung Qualität kann durch Anzeigen der gescannten Bild des Mikroarrays beurteilt werden. Das Bild sollte auf das Vorhandensein von Staub oder andere Störfaktoren Verbot Visualisierung der einzelnen Funktionen untersucht werden und somit zu verhindern genaue Berechnung der Fluoreszenz-Intensität des Merkmals. Die Intensität der Ausrichtung Oligos können die anderen Funktionen auf dem Array zu Hybridisierungseffizienz beurteilen verglichen werden. <img src="/files/ftp_upload/1471/1471figure4.jpg" border="0" alt="Abbildung 4" /> Abbildung 4. Ein Streudiagramm einer analysierten Mikroarray-Experiment. Das Ziel dieses Verfahrens ist es, Gene, die in Ihrer Proben zum Ausdruck zu identifizieren. Microarray-Daten können weiter analysiert und betrachtet in einem Streudiagramm, um Gene, die differentiell exprimiert sind zu visualisieren. Tabelle 1. Komponenten von Roche NimbleGen Hybridization Kit für Hybridisierung Schritt 2 hinzugefügt werden. <table border="1"><tbody><tr><td> Komponente </td><td> Volumen </td></tr><tr><td> Sample (gelöst in Wasser) </td><td> 5 pl </td></tr><tr><td> 2X Hybridisierungspuffer </td><td> 9 ul </td></tr><tr><td> Hyb A </td><td> 3,6 ul </td></tr><tr><td> Alignment Oligo </td><td> 0,4 ul </td></tr><tr><td> Gesamtvolumen </td><td> 18 ul </td></tr></tbody></table> Tabelle 2. Wash Puffer zum Waschen der Arrays nach der Hybridisierung vorbereitet werden. <table border="1"><tbody><tr><td> Komponente </td><td> Waschpuffer IA * </td><td> Waschpuffer IB </td><td> Waschpuffer II </td><td> Waschpuffer III </td></tr><tr><td> Wasser </td><td> 225 ml </td><td> 225 ml </td><td> 225 ml </td><td> 225 ml </td></tr><tr><td> 10X Waschpuffer I, II oder III </td><td> 25 ml </td><td> 25 ml </td><td> 25 ml </td><td> 25 ml </td></tr><tr><td> 1 M DTT </td><td> 25 ul </td><td> 25 ul </td><td> 25 ul </td><td> 25 ul </td></tr><tr><td> Gesamtvolumen </td><td> 250 ml </td><td> 250 ml </td><td> 250 ml </td><td> 250 ml </td></tr></tbody></table> * Pre-warm bis 42 ° C

<ol>
	<li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> BioPrime Array CGH Genomic Labeling System Manual. , (2004).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Roche NimbleGen Arrays User's Guide for Gene Expression Analysis. , (2008).</li></ol>

Viele Microarray-Protokolle, darunter auch die hier detailliert, verwenden fluoreszierende Farbstoffe als ein Mittel zur Messung und Quantifizierung Hybridisierung. Die Cy3 Fluoreszenzfarbstoff ist empfindlich auf ein Foto, und Ozonabbau. Es wird empfohlen, dass das Verfahren in minimal-Beleuchtung durchgeführt werden. Darüber hinaus können kleine Staubpartikel mit Hybridisierung und Scannen stören. Besondere Aufmerksamkeit sollte sicherstellen, dass die Arbeit ist sauber und frei von Staub sein. <p class="jove_...

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
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		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Array Microcentrifuge Dryer</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>ISC Bioexpress</td>
<td>C-1303-T</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>BioPrime Array CGH Genomic Labeling System</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>18095-011</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Cyanine 3-dCTP</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>PerkinElmer</td>
<td>NEL576</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>GenePix 4000B</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Molecular Devices</td>
<td>GENEPIX 4000B</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Microcon YM-30</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Millipore</td>
<td>42411</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>NimbleGen Array Processing Accessories</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Roche NimbleGen</td>
<td>5223539001</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>NimbleGen Hybridization Kit</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Roche NimbleGen</td>
<td>5223474001</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>NimbleGen Hybridization System 4</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Roche NimbleGen</td>
<td>5223652001</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>NimbleGen Wash Buffer Kit</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Roche NimbleGen</td>
<td>5223504001</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>X1 Mixers</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Roche NimbleGen</td>
<td>5223725001</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

global gene expression analysis using a zebrafish oligonucleotide microarray platform

Gene Microarray-Technologie erlaubt die quantitative Messung und Genexpressions-Profiling von Transkripten auf einer genomweiten Basis. Gene Microarray-Technologie wird in zahlreichen biologischen Disziplinen in einer Vielzahl von Anwendungen, darunter globale Genexpressionsanalyse in Bezug auf Entwicklungsstadium, einer Krankheit Zustand verwendet, und in toxischen Reaktionen. Hierin sind wir eine Demonstration der globalen Genexpressionsanalyse mit einem umfassenden Zebrafisch-spezifischen Oligonukleotid-Microarray-Plattform. Der Zebrafisch Ausdruck Microarray-Plattform enthält 385.000 Sonden, 60 Basenpaaren Länge, verhören 37.157 Ziele mit bis zu 12 Sonden pro Target. Für diese Plattform wurden alle cDNA und genomischer Informationen für die Zebrafisch aus verschiedenen genomischen Datenbanken einschließlich Ensembl (http://www.ensembl.org), VEGA (http://vega.sanger.ac.uk), UCSC gesammelt ( http://genome.ucsc.edu) und ZFIN (http://www.zfin.org). Als Ergebnis dieses Ausdrucks-Array bietet eine vollständige Abdeckung des aktuellen Zebrafisch Transkriptom. Der Zebrafisch Ausdruck Microarray wurde von Roche NimbleGen (Madison, WI) gedruckt. Diese technische Demonstration umfasst die Fluoreszenzmarkierung der cDNA-Produkt, die Hybridisierung der markierten cDNA-Produkt an den Microarray-Plattform und Array-Scanning für die Signalerfassung mit dem eine Farbe Analyse-Strategie.

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Global Gene Expression Analysis Using a Zebrafish Oligonucleotide Microarray Platform

Gene Microarrays sind mächtige Werkzeuge in Genexpressions-Profiling bei einer genomweiten Ebene. Diese Technologie findet Anwendung in einer Vielzahl von biologischen Disziplinen Entwicklungsbiologie und Toxikologie. In diesem Video-, Detail haben wir ein Protokoll für die globale Genexpressionsanalyse mit einem umfassenden Oligonukleotid-Microarray-Plattform für die Zebrafisch.

Globale Genexpressionsanalyse Mit einem Zebrafisch Oligonukleotid-Microarray-Plattform

Gene microarray technology permits quantitative measurement and gene expression profiling of transcript levels on a genome-wide basis. Gene microarray ...

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Research

JoVE Journal

Biology

11.6K Aufrufe.  Purdue University. Gene Microarrays sind mächtige Werkzeuge in Genexpressions-Profiling bei einer genomweiten Ebene. Diese Technologie findet Anwendung in einer Vielzahl von biologischen Disziplinen Entwicklungsbiologie und Toxikologie. In diesem Video-, Detail haben wir ein Protokoll für die globale Genexpressionsanalyse mit einem umfassenden Oligonukleotid-Microarray-Plattform für die Zebrafisch.

Serie: Global Gene Expression Analysis Using a Zebrafish Oligonucleotide Microarray Platform

Bacterial Gene Expression Analysis Using Microarrays

Bakterielle Gene Expression Analysis Using Microarrays

Forschung

Biologie

The Preparation of Primary Hematopoietic Cell Cultures From Murine Bone Marrow for Electroporation

It is becoming increasingly apparent that electroporation is the most effective way to introduce plasmid DNA or siRNA into primary cells. The Gene Pulser MXcell  electroporation system and Gene Pulser  electroporation buffer were specifically developed to transfect nucleic acids into mammalian cells and difficult-to-transfect cells, such as primary and stem cells.This video demonstrates how to establish primary hematopoietic cell cultures from murine bone marrow, and then prepare them for electroporation in the MXcell system. We begin by isolating femur and tibia. Bone marrow from both femur and tibia are then harvested and cultures are established. Cultured bone marrow cells are then transfected and analyzed.

This procedure describes how to establish primary hematopoietic cell cultures from murine bone marrow and is followed by transfection using the Gene Pulser MXCell electroporation system.

Die Herstellung von primären hämatopoetischen Zellkulturen aus Knochenmark der Maus für die Elektroporation

It is becoming increasingly apparent that electroporation is the most effective way to introduce plasmid DNA or siRNA into primary cells. The Gene Pulser ...

RNA Isolation from Embryonic Zebrafish and cDNA Synthesis for Gene Expression Analysis

Many important and complex laboratory procedures require an input of high quality, intact RNA.  A degraded sample or the presence of impurities can lead to disastrous results in downstream experimental applications.  It is therefore, of utmost importance to use solid techniques with numerous safeguards and quality control checks to ensure a superior sample.  Herein, we detail a protocol to isolate total RNA from whole zebrafish embryos using a commercially available chemical denaturant and subsequent cleanup to remove traces of DNA and impurities using a commercial RNA isolation kit. As RNA is relatively unstable and easily prone to cleavage by RNAses, most protocols assay gene expression using a cDNA product that is directly synthesized from an RNA template. We detail a procedure to convert RNA into the more stable cDNA product using a commercially available kit. Throughout these procedures there are numerous quality control checks to ensure that the sample is not degraded or contaminated.  The end product of these protocols is cDNA that is suitable for microarray analysis, RT-PCR or long-term storage.    

The isolation of high quality, intact RNA is an essential step in many laboratory protocols. Here, we demonstrate RNA extraction from whole zebrafish embryos and cDNA synthesis for subsequent application in various experimental procedures including gene expression microarray analysis.

RNA Isolation aus embryonalen Zebrafisch und cDNA-Synthese für die Genexpressionsanalyse

Many important and complex laboratory procedures require an input of high quality, intact RNA.  A degraded sample or the presence of impurities can lead ...

Using the Gene Pulser MXcell Electroporation System to Transfect Primary Cells with High Efficiency

It is becoming increasingly apparent that electroporation is the most effective way to introduce plasmid DNA or siRNA into primary cells. The Gene Pulser MXcell electroporation system and Gene Pulser electroporation buffer (Bio-Rad) were specifically developed to easily transfect nucleic acids into mammalian cells and difficult-to-transfect cells, such as primary and stem cells. We will demonstrate how to perform a simple experiment to quickly identify the best electroporation conditions. We will demonstrate how to run several samples through a range of electroporation conditions so that an experiment can be conducted at the same time as optimization is performed. We will also show how optimal conditions identified using 96-well electroporation plates can be used with standard electroporation cuvettes, facilitating the switch from electroporation plates to electroporation cuvettes while maintaining the same electroporation efficiency. In the video, we will also discuss some of the key factors that can lead to the success or failure of electroporation experiments.

This procedure shows how to use the Gene Pulser MXcell electroporation system to rapidly and easily identify the best electroporation conditions for mouse embryonic fibroblasts (MEFs) or other primary cells. Considerations for troubleshooting are also discussed in the associated video.

Mit dem Gene Pulser MXcell Elektroporation System zur Primary Cells mit hohem Wirkungsgrad zu transfizieren

Using an Automated Cell Counter to Simplify Gene Expression Studies: siRNA Knockdown of IL-4 Dependent Gene Expression in Namalwa Cells

The use of siRNA mediated gene knockdown is continuing to be an important tool in studies of gene expression.  siRNA studies are being conducted not only to study the effects of downregulating single genes, but also to interrogate signaling pathways and other complex interaction networks.  These pathway analyses require both the use of relevant cellular models and methods that cause less perturbation to the cellular physiology.  Electroporation is increasingly being used as an effective way to introduce siRNA and other nucleic acids into difficult to transfect cell lines and primary cells without altering the signaling pathway under investigation. There are multiple critical steps to a successful siRNA experiment, and there are ways to simplify the work while improving the data quality at several experimental stages.  To help you get started with your siRNA mediated gene knockdown project, we will demonstrate how to perform a pathway study complete from collecting and counting the cells prior to electroporation through post transfection real-time PCR gene expression analysis.  The following study investigates the role of the transcriptional activator STAT6 in IL-4 dependent gene expression of CCL17 in a Burkitt lymphoma cell line (Namalwa).  The techniques demonstrated are useful for a wide range of siRNA-based experiments on both adherent and suspension cells.  We will also show how to streamline cell counting with the TC10 automated cell counter, how to electroporate multiple samples simultaneously using the MXcell electroporation system, and how to simultaneously assess RNA quality and quantity with the Experion automated electrophoresis system.

This procedure describes a quick and easy workflow to introduce siRNA into difficult to transfect cell lines and follow gene expression by real-time PCR. Use of an automated cell counter, multi-well electroporation plate, and automated electrophoresis station provide quick and reliable results without the need for expensive robotic handling.

Verwendung eines automatisierten Cell Counter zu Genexpressionsstudien Simplify: siRNA Knockdown von IL-4 abhängige Genexpression in Namalwalzellen

The use of siRNA mediated gene knockdown is continuing to be an important tool in studies of gene expression.  siRNA studies are being conducted not only ...

Analysis of Gene Expression in Emerald Ash Borer (Agrilus planipennis) Using Quantitative Real Time-PCR

Emerald ash borer (EAB, Agrilus planipennis) is an exotic invasive pest, which has killed millions of ash trees (Fraxinus spp) in North America. EAB continues to spread rapidly and attacks ash trees of different ages, from saplings to mature trees. However, to date very little or no molecular knowledge exists for EAB. We are interested in deciphering the molecular-based physiological processes at the tissue level that aid EAB in successful colonization of ash trees. In this report we show the effective use of quantitative real-time PCR (qRT-PCR) to ascertain mRNA levels in different larval tissues (including midgut, fat bodies and cuticle) and different developmental stages (including 1st-, 2nd-, 3rd-, 4th-instars, prepupae and adults) of EAB. As an example, a peritrophin gene (herein named, AP-PERI1) is exemplified as the gene of interest and a ribosomal protein (AP-RP1) as the internal control. Peritrophins are important components of the peritrophic membrane/matrix (PM), which is the lining of the insect gut. The PM has diverse functions including digestion and mechanical protection to the midgut epithelium.

Analysis of Gene Expression in Emerald Ash Borer Agrilus planipennis Using Quantitative Real Time-PCR

Quantitative real-time PCR (qRT-PCR) is an effective tool to diagnose mRNA levels in different insect tissues and developmental stages. In this report we show the use of qRT-PCR to ascertain mRNA levels in different larval tissues and developmental stages of the invasive insect species, emerald ash borer.

Analysis of Gene Expression in Emerald Ash Borer ( Agrilus planipennis) Mittels quantitativer Real Time-PCR

Emerald ash borer (EAB, Agrilus planipennis) is an exotic invasive pest, which has killed millions of ash trees (Fraxinus spp) in North America. EAB ...

Paraffin-Embedded and Frozen Sections of Drosophila Adult Muscles

The molecular characterization of muscular dystrophies and myopathies in humans has revealed the complexity of muscle disease and genetic analysis of muscle specification, formation and function in model systems has provided valuable insight into muscle physiology. Therefore, identifying and characterizing molecular mechanisms that underlie muscle damage is critical. The structure of adult Drosophila multi-fiber muscles resemble vertebrate striated muscles 1 and the genetic tractability of Drosophila has made it a great system to analyze dystrophic muscle morphology and characterize the processes affecting muscular function in ageing adult flies 2. Here we present the histological technique for preparing paraffin-embedded and frozen sections of Drosophila thoracic muscles. These preparations allow for the tissue to be stained with classical histological stains and labeled with protein detecting dyes, and specifically cryosections are ideal for immunohistochemical detection of proteins in intact muscles. This allows for analysis of muscle tissue structure, identification of morphological defects, and detection of the expression pattern for muscle/neuron-specific proteins in Drosophila adult muscles. These techniques can also be slightly modified for sectioning of other body parts.

Paraffin-Embedded and Frozen Sections of Drosophila Adult Muscles

Identification of mechanisms underlying muscle damage is crucial. Here we present the histological technique for preparing paraffin-embedded and frozen sections of Drosophila thoracic muscles. This allows analysis of muscle morphology and localization of protein and other muscle cell components.

Paraffin-Embedded-und Gefrierschnitte von Drosophila Adult Muskeln

The molecular characterization of muscular dystrophies and myopathies in humans has revealed the complexity of muscle disease and genetic analysis of ...

Determining Genetic Expression Profiles in C. elegans Using Microarray and Real-time PCR

Synapses are composed of a presynaptic active zone in the signaling cell and a postsynaptic terminal in the target cell. In the case of chemical synapses, messages are carried by neurotransmitters released from presynaptic terminals and received by receptors on postsynaptic cells. Our previous research in Caenorhabditis elegans has shown that VSM-1 negatively regulates exocytosis. Additionally, analysis of synapses in vsm-1 mutants showed that animals lacking a fully functional VSM-1 have increased synaptic connectivity. Based on these preliminary findings, we hypothesized that C. elegans VSM-1 may play a crucial role in synaptogenesis. To test this hypothesis, double-labeled microarray analysis was performed, and gene expression profiles were determined. First, total RNA was isolated, reversely transcribed to cDNA, and hybridized to the DNA microarrays. Then, in-silico analysis of fluorescent probe hybridization revealed significant induction of many genes coding for members of the major sperm protein family (MSP) in mutants with enhanced synaptogenesis. MSPs are the major component of sperm in C. elegans and appear to signal nematode oocyte maturation and ovulation . In fruit flies, Chai and colleagues 1 demonstrated that MSP-like molecules regulate presynaptic bouton number and size at the neuromuscular junction. Moreover, analysis performed by Tsuda and coworkers 2 suggested that MSPs may act as ligands for Eph receptors and trigger receptor tyrosine kinase signaling cascades. Lastly, real time PCR analysis corroborated that the gene coding for MSP-32 is induced in vsm-1(ok1468) mutants. Taken together, research performed by our laboratory has shown that vsm-1 mutants have a significant increase in synaptic density, which could be mediated by MSP-32 signaling.

Determining Genetic Expression Profiles in C. elegans Using Microarray and Real-time PCR

Microarray analysis was conducted to determine genetic expression profiles in C. elegans, and real-time PCR was used to validate and quantify microarray data.

Bestimmung genetischer Expressionsprofile in C. elegans Verwenden Microarray-und Real-time PCR

Synapses are composed of a presynaptic active zone in the signaling cell and a postsynaptic terminal in the target cell. In the case of chemical synapses, ...

In vitro Reconstitution of the Active T. castaneum Telomerase

Efforts to isolate the catalytic subunit of telomerase, TERT, in sufficient quantities for structural studies, have been met with limited success for more than a decade. Here, we present methods for the isolation of the recombinant Tribolium castaneum TERT (TcTERT) and the reconstitution of the active T. castaneum telomerase ribonucleoprotein (RNP) complex in vitro.
Telomerase is a specialized reverse transcriptase1 that adds short DNA repeats, called telomeres, to the 3' end of linear chromosomes2 that serve to protect them from end-to-end fusion and degradation. Following DNA replication, a short segment is lost at the end of the chromosome3 and without telomerase, cells continue dividing until eventually reaching their Hayflick Limit4. Additionally, telomerase is dormant in most somatic cells5 in adults, but is active in cancer cells6 where it promotes cell immortality7.
The minimal telomerase enzyme consists of two core components: the protein subunit (TERT), which comprises the catalytic subunit of the enzyme and an integral RNA component (TER), which contains the template TERT uses to synthesize telomeres8,9. Prior to 2008, only structures for individual telomerase domains had been solved10,11. A major breakthrough in this field came from the determination of the crystal structure of the active12, catalytic subunit of T. castaneum telomerase, TcTERT1.
Here, we present methods for producing large quantities of the active, soluble TcTERT for structural and biochemical studies, and the reconstitution of the telomerase RNP complex in vitro for telomerase activity assays. An overview of the experimental methods used is shown in Figure 1.

In vitro Reconstitution of the Active T. castaneum Telomerase

Efforts to isolate the catalytic subunit of telomerase, TERT, in sufficient quantities for structural studies, have been met with limited success for more than a decade. Here, we present methods for the isolation of the recombinant Tribolium castaneum TERT (TcTERT) and the reconstitution of the active T. castaneum telomerase ribonucleoprotein (RNP) complex in vitro.

In vitro Rekonstitution der Active T. castaneum Telomerase

Efforts to isolate the catalytic subunit of telomerase, TERT, in sufficient quantities for structural studies, have been met with limited success for more ...

Gene Trapping Using Gal4 in Zebrafish

Large clutch size and external development of optically transparent embryos make zebrafish an exceptional vertebrate model system for in vivo insertional mutagenesis using fluorescent reporters to tag expression of mutated genes. Several laboratories have constructed and tested enhancer- and gene-trap vectors in zebrafish, using fluorescent proteins, Gal4- and lexA- based transcriptional activators as reporters 1-7. These vectors had two potential drawbacks: suboptimal stringency (e.g. lack of ability to differentiate between enhancer- and gene-trap events) and low mutagenicity (e.g. integrations into genes rarely produced null alleles). Gene Breaking Transposon (GBTs) were developed to address these drawbacks 8-10. We have modified one of the first GBT vectors, GBT-R15, for use with Gal4-VP16 as the primary gene trap reporter and added UAS:eGFP as the secondary reporter for direct detection of gene trap events. Application of Gal4-VP16 as the primary gene trap reporter provides two main advantages. First, it increases sensitivity for genes expressed at low expression levels. Second, it enables researchers to use gene trap lines as Gal4 drivers to direct expression of other transgenes in very specific tissues. This is especially pertinent for genes with non-essential or redundant functions, where gene trap integration may not result in overt phenotypes. The disadvantage of using Gal4-VP16 as the primary gene trap reporter is that genes coding for proteins with N-terminal signal sequences are not amenable to trapping, as the resulting Gal4-VP16 fusion proteins are unlikely to be able to enter the nucleus and activate transcription. Importantly, the use of Gal4-VP16 does not pre-select for nuclear proteins: we recovered gene trap mutations in genes encoding proteins which function in the nucleus, the cytoplasm and the plasma membrane.

This protocol describes the method of gene trap insertional mutagenesis using Gal4-VP16 as the primary reporter and GFP/RFP as secondary reporters in zebrafish. Approximately one in ten high-expressing F0 fish yield gene trap progeny co-expressing GFP and RFP. The screening procedure can be readily scaled to adapt to the size of the laboratory performing the insertional mutagenesis screen.

Gene Trapping Mit Gal4 in Zebrafisch

Large clutch size and external development of optically transparent embryos make zebrafish an exceptional vertebrate model system for in vivo insertional ...