Teil 1: Extraktion von Gesamt-RNA mit Trizolreagenz Beim Arbeiten mit RNA ist es sehr wichtig, um in einem Umfeld, das frei von RNasen ist die Arbeit. Einfache Vorsichtsmaßnahmen wie mit reservierten Pipetten für die Verwendung nur mit RNA Verfahren und Besprühen der Arbeitsbereich mit einem Dekontaminationsmittel Reagenz (zB RNAse Away) vor Beginn des Verfahrens sind sehr hilfreich. <ol><li> Um eine ausreichende Menge an RNA Becken 50 Zebrafischembryonen in einem 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen erreichen und entfernen Sie so viel Wasser wie möglich mit einer Pipette. </li><li> Sofort im 250 ul Trizolreagenz 1 zum Mikrozentrifugenröhrchen mit den Embryonen. Trizolreagenz enthält Phenol und sollte nur unter einer Abzugshaube verwendet werden. </li><li> Lyse und Homogenisierung der Embryonen mit einer Pellet-Stößel (ca. 20 Schläge), bis das Gewebe ausreichend gestört wird. </li><li> Wenn die Zellen ausreichend homogenisiert, fügen Sie 750 ul Trizolreagenz auf ein Gesamtvolumen von 1 ml entspricht. </li><li> Um zuzulassen, dass eine vollständige Dissoziation des Nukleoproteinkomplexe inkubieren homogenisierten Proben für 5 Minuten bei Raumtemperatur. In diesem Stadium kann die Probe in flüssigem Stickstoff eingefroren und bei -80 ° C oder das Protokoll fortgesetzt werden kann. </li><li> Um weiterhin 0,2 ml Chloroform und Rock die Röhre für 15 Sekunden zu mischen. </li><li> Inkubieren Sie die Probe für 2 Minuten bei Raumtemperatur und anschließend Zentrifuge bei 12.000 xg für 15 Minuten bei 4 ° C. </li><li> Die Mischung wird in eine untere rote Phenol-Chloroform-Phase, eine Interphase und eine farblose obere wässrige Phase zu trennen. Die obere wässrige Phase enthält die RNA. Die oberste Schicht sollte etwa 60% des ursprünglichen Volumens des TRIzol (ca. 0,6 ml) enthalten. Übertragen Sie die obere wässrige Schicht in ein neues Mikrozentrifugenröhrchen mit einer 1 ml Pipette achten, dass keine der Interphase-Schicht übertragen. </li><li> Zur Fällung der RNA mit 0,5 ml Isopropanol. </li><li> Lassen Sie die Probe bei Raumtemperatur für 10 Minuten sitzen und dann Zentrifuge die Probe bei 12.000 xg für 10 Minuten bei 4 ° C. RNA wird eine gelartige Pellet am Boden des Röhrchens zu bilden. </li><li> Ohne das Pellet, den Überstand mit einer Pipette und waschen das Pellet in 1 ml 75% Ethanol. Mischen Sie die Probe durch vorsichtiges Schwenken und Zentrifuge bei 7.500 xg für 5 Minuten bei 4 ° C. </li><li> Nach Zentrifugation, entfernen Sie das Ethanol mit einer Pipette und ermöglichen Probe zu trocknen, während für 10 Minuten umgedreht. </li><li> Das Pellet durch Zugabe von 100 ul RNAse-freiem Wasser und Inkubation der Probe bei 55 ° C für 10 Minuten. Es wird empfohlen, Wirbel häufig Finger während der Inkubation in RNA Rehydratation Hilfe. Optional können Sie überprüfen Probe qualitativ und quantitativ mit Hilfe eines NanoDrop ND-1000 Spektrophotometer oder direkt mit dem nächsten Schritt fortfahren. </li></ol> Teil 2: RNA Cleanup mit dem Qiagen RNeasy Mini Kit Die Qiagen RNeasy Mini Kit 2 ist nützlich bei der Beseitigung von Schadstoffen und Verunreinigungen aus einem RNA-Probe von anderen Methoden isoliert. Für dieses Verfahren sind β-Mercaptoethanol, Ethanol und Nuklease-freies Wasser zusätzlich zu den Komponenten im Kit enthalten nötig. Eine optionale DNAse Behandlung ist bei diesem Verfahren empfohlen. <ol><li> Bei der ersten Verwendung des Kits wird Buffer RPE müssen durch Zugabe von 4 Volumen 100% Ethanol zu 1 Volumen von Buffer RPE vorbereitet werden. </li><li> Am Tag des Verfahrens, wird Buffer RLT müssen frisch zubereitet werden. Berechnen Sie den Gesamtbetrag von Buffer RLT, die benötigt werden. Ein Volumen von 350 ul pro Probe benötigt. Zur Vorbereitung Buffer RLT, mit 10 ul von β-Mercaptoethanol für jeden 1 ml Puffer. Dies sollte unter dem Abzug durchgeführt werden. </li><li> Zu jeder Probe hinzugefügt 350 ul Puffer RLT und 250 ul 100% Ethanol. Gut mischen durch Auf-und Abpipettieren mehrmals. </li><li> Übertragen Sie die Probe, die etwa 700 ul sein sollte, in eine RNeasy Säule in ein 2 ml Sammel-Tube und zentrifugieren bei 8.000 xg für 1 Minute bei Raumtemperatur befindet. </li><li> Nach Zentrifugieren, entsorgen Sie die Durchströmung und fügen 700 ul Puffer RW1 eine RNeasy Spin-Säule. </li><li> Zentrifugieren Sie die Probe bei 8.000 xg für 1 Minute bei Raumtemperatur und dann verwerfen Sie die Durchströmung. </li><li> DNAse Behandlung mit Qiagen RNase-freie DNase Kit: DNAse Behandlung ist optional, ist jedoch für die höchste Qualität Proben empfohlen. <ol style="list-style-type:upper-alpha;"><li> Beim ersten erhalten die DNAse Behandlung Kit, müssen Sie die DNAse I-Stammlösung durch Zugabe von 550 ul Nuklease-freies Wasser auf die DNAse vorzubereiten. Vorsichtig mischen durch Invertieren und nicht vortexen. Aliquot in Durchstechflaschen zur einmaligen Anwendung mit 10 ul der Stammlösung. Sie können die Stammlösung bei -20 ° C lagern bis zu 9 Monate. Die aufgetauten Aliquots bei 4 ° C für 6 Wochen bei Bedarf gespeichert werden, aber nicht wieder einfrieren die Aliquots nach dem Auftauen. </li><li> Zur Vorbereitung der DNAse I Inkubation Mischung hinzufügen 70 ul Puffer RDD bis 10 ul DNAse I stock-Lösung pro Probe. Mix durch vorsichtiges Schwenken und Zentrifugenröhrchen kurz zu sammeln Restflüssigkeit bilden die Seiten des Rohres. Add 80 ul DNAse I Inkubation Mix direkt auf die RNeasy spin column. Inkubieren Sie die DNAse Behandlung für 30 Minuten bei Raumtemperatur. </li></ol></li><li> Nach DNAse Behandlung add 350 ul Puffer RW1 auf die Spin-Säule und zentrifugieren bei 8.000 xg für 1 Minute bei Raumtemperatur. </li><li> Nach der Zentrifugation verwerfen die Durchströmung und fügen 500 ul Puffer RPE auf die Spin-Säule. Inkubieren Sie die Probe für 5 Minuten bei Raumtemperatur. </li><li> Centrifuge Probe bei 8.000 xg für 1 Minute bei Raumtemperatur und entsorgen Sie die Durchströmung. </li><li> Nach Zentrifugation add 500 ul 75% igem Ethanol auf die Spin-Säule. </li><li> Wiederholen Sie die Zentrifugation bei 8.000 xg, aber für 2 Minuten bei Raumtemperatur. </li><li> Nach der Zentrifugation verwerfen die Durchströmung und damit die Spalte auch für 5 Minuten trocknen lassen. </li><li> Unmittelbar bei 8.000 xg zentrifugieren Sie für 5 Minuten bei Raumtemperatur zu jeder übrig Spuren von Ethanol zu entfernen. </li><li> Nach der Zentrifugation ist die vollständige Übertragung der Spin-Säule in ein neues 1,5 ml Sammel-Tube und füge 10 pl Nuklease-freies Wasser. Inkubation für 1 Minute und dann Zentrifuge bei 10.000 xg für 1 Minute bei Raumtemperatur. Die RNA wird in den Fluss durch sein. </li><li> Add another 10 pl Nuklease-freies Wasser auf die Spin-Säule und Inkubation bei Raumtemperatur für 1 Minute. Centrifuge Probe bei 10.000 xg für 1 Minute bei Raumtemperatur. </li><li> Nach der Zentrifugation zu entfernen und entsorgen Sie die Spin-Säule. RNA wird in den Fluss durch sein. </li><li> Prüfen Sie die Qualität und Quantität der RNA mit einem NanoDrop ND-1000 Spektrophotometer folgenden Anweisungen des Herstellers. </li><li> Darüber hinaus führen Sie einen denaturierenden Gel oder verwenden Sie ein Agilent 2100 Bioanalyzer, um die Integrität der RNA zu überprüfen. </li><li> Die Proben sollten bei -80 ° C gelagert werden, bis die cDNA-Synthese durchgeführt werden kann. </li></ol> Teil 3: cDNA-Synthese mit dem Invitrogen SuperScript First-Strand-System RNA ist leicht anfällig für Spaltung durch RNAsen führt zu Abbau. Als Ergebnis vieler Genexpression Protokolle wurden entwickelt, um eine stabilere cDNA-Produkt, das direkt aus der RNA synthetisiert verwenden. Hier haben wir ausführlich Synthese der ersten cDNA mit dem Invitrogen SuperScript Erststrangsynthese System 3. Jede cDNA-Synthese-Reaktion kann bis zu 5 ug RNA. <ol><li> Vor Beginn des Verfahrens zu mischen und kurz zentrifugieren jede Komponente. </li><li> Bereiten RNA / Primer-Gemisch in ein steriles 0,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen, wie in Tabelle 1 dargestellt. </li><li> Inkubieren Sie die Probe bei 65 ° C für 5 Minuten. </li><li> Sofortüberweisung Probe Eisbrei für 10 Minuten. </li><li> Während der Probe wird die Kühlung bereiten einen Master-Mix mit den Komponenten in Tabelle 2 dargestellt. Die Bände sind pro 1 Reaktion aufgeführt. Lautstärkeanpassung entsprechend der Gesamtzahl der Reaktionen. </li><li> Nach dem Abkühlen 9 ul des Master-Mix in Schritt 5, um jede RNA / Primer-Mischung vorbereitet. Vorsichtig mischen und sammeln durch kurze Zentrifugation. Das Gesamtvolumen jeder Probe sollte 19 ul werden. </li><li> Inkubieren Sie die Probe bei 42 ° C für 2 Minuten in einem Thermocycler. </li><li> Fügen Sie 1 ul (50 Einheiten) Superscript II RT in jedes Röhrchen, mischen und inkubieren bei 42 ° C für 60 Minuten in einem Thermocycler. </li><li> Beenden Sie die Reaktion bei 70 ° C für 15 Minuten und dann Chill Probe auf 4 ° C. Ein Thermocycler für die Schritte 8 und 9 programmiert werden. </li><li> Nachdem die Probe 4 ° C erreicht hat, übertragen Sie die Reaktion auf ein Eisbad. </li><li> Auf Eis hinzufügen 1 ul RNAse H in jedes Röhrchen und inkubieren für 20 Minuten bei 37 ° C. Das Gesamtvolumen beträgt jetzt 21 ul. Die Zugabe von RNAse H Ihrer Probe verschlechtern die RNA-Vorlage und lassen Sie nur den Einzelstrang cDNA-Produkt. </li></ol> Teil 4: cDNA-Isolierung und Niederschlag <ol><li> Ein 1,5 ml Phase Lock Gel Rohr wird in die Isolierung der cDNA-Produkt verwendet werden. Bereiten Sie eine 1,5-ml-Phase Lock Gel Röhrchen durch Zentrifugation bei 12.000 xg für 2 Minuten. Das Gel sollte allen an der Unterseite des Rohres werden. </li><li> Add 81,5 ul Phenol (Tris-gesättigt, gepuffert auf pH 8,0), 81,5 ul von 24:1 Chloroform Isoamylalkohol, und die Probe (21 ul) in die Phase Lock Gel Tube. Mix mehrfach durch vorsichtiges Schwenken. </li><li> Zentrifugieren Sie die Probe bei 12.000 xg für 5 Minuten bei Raumtemperatur. </li><li> Die cDNA sollte in der oberen wässrigen Phase. Oberphase in ein sauberes 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen. Das Gesamtvolumen wird auf rund 20 ul werden. </li><li> Add 1X Volumen 3 M NaOAc, pH 5,2 und vorsichtig mischen. Zum Beispiel, wenn das Volumen der oberen wässrigen Phase wurde in Höhe von 20 ul, müssen Sie 2 ul 3 M NaOAc, pH 5,2 hinzu. </li><li> Add 7 ul von 5 mg / ml Glykogen und vorsichtig mischen. </li><li> Add 1X Volumen Isopropanol und vorsichtig mischen. Im Allgemeinen ist dies etwa 30 ul Isopropanol. </li><li> Lassen Probe bei Zimmertemperatur Temperatur inkubierene für 10 Minuten und dann bei 12.000 xg zentrifugieren für 20 Minuten bei Raumtemperatur. </li><li> Eine kleine cDNA Pellet sollte auf dem Boden der Röhre bilden. Entfernen Sie vorsichtig den Überstand mit einer Pipette. </li><li> Add 500 ul 70% Ethanol und mischen durch Umdrehen. </li><li> Zentrifugieren Sie die Probe bei 12.000 xg für 5 Minuten. </li><li> Nach der Zentrifugation den Überstand mit einer Pipette und wiederholen Sie die 70% Ethanol waschen und Zentrifugation (Schritte 10 und 11). </li><li> Nach der Zentrifugation den Überstand mit einer Pipette. Wenn es verbliebene Flüssigkeit auf den Seiten des Rohres kann durch kurzes Drehen der Röhre gesammelt werden. Entfernen Sie überschüssige Flüssigkeit und lassen Sie das Pellet bei Raumtemperatur für 5 Minuten trocknen lassen. </li><li> Add 20 ul Nuklease-freies Wasser, um das Pellet zu rehydrieren. Legen Sie die Probe bei 55 ° C für 5 Minuten für die Rehydrierung des Pellets. </li><li> Die Quantität und Qualität der cDNA-Produkt wird dann überprüft, wobei ein NanoDrop ND-1000 Spektrophotometer folgenden Anweisungen des Herstellers. Die cDNA kann bei -20 ° C gelagert werden </li></ol> Repräsentative Ergebnisse Nach RNA-Aufreinigung, können etwa 15 ug von hoher Qualität Gesamt-RNA von 50 Zebrafischembryonen erwarten. Zur Beurteilung der Gesamt-RNA Qualität, einem Spektralphotometer, Gelelektrophorese und einem Agilent 2100 Bioanalyzer verwendet werden kann. Ein NanoDrop ND-1000 Spektralphotometer kann verwendet werden, um die Absorption bei 260 nm zu beurteilen im Vergleich zu der Absorption bei 280 nm (Abbildung 1). Die A 260 / A 280-Verhältnis offenbaren kann das Vorhandensein von Schadstoffen und geben Hinweise auf mögliche Abbau. Ein A ​​260 / A 280-Verhältnis von 1,9-2,0 wird als akzeptabel angesehen. Darüber hinaus ist es dringend empfohlen, dass eine RNA-Denaturierung Gellauf auf RNA-Integrität zu beurteilen. RNA-Stränge werden auf Grund ihrer Größe zu trennen, mit kleineren Stränge Migration weiter unten in der Gel. Ein nicht-degradierten Probe wird als ein Abstrich mit zwei starken Banden erscheinen. Der Abstrich ist ein Ergebnis einer Population von unterschiedlich großen mRNA-Stränge und die Bands, die 28S und 18S rRNA entsprechen. Die 28S-Band sollte etwa doppelt so intensiv wie die 18S-Band (Abbildung 2). Alternativ kann der Gesamt-RNA Integrität beurteilt mit Hilfe eines Agilent 2100 Bioanalyzer werden. Zwei unterschiedliche Peaks für 28S und 18S rRNA zu erwarten ist (Abbildung 3). Die 28S-Peak sollte größer sein als die 18S-Peak mit der Fläche unter den Gipfeln von etwa 2:1, jeweils. Zwei deutliche Spitzen nicht in abgebauten Proben beobachtet werden. RNA Proben mit Abbau sollte nicht durch nachträgliche experimentellen Verfahren durchgeführt werden. Spektrophotometrische Analyse kann verwendet werden, um die Qualität der cDNA-Produkt (Abbildung 4) zu beurteilen. Die A 260 / A 280 sollte bei 1,8. cDNA-Reaktionen mit einem Eingang von 5 ug Gesamt-RNA routinemäßig Ertrag 1-2 ug von cDNA-Produkt in unserem Labor. <img src="/files/ftp_upload/1470/1470fig1.jpg" alt="Abbildung 1" /> Abbildung 1. Ein NanoDrop Spektrum von RNA-Probe. Nach RNA-Aufreinigung, können RNA-Menge und Qualität anhand einer NanoDrop ND-1000-Spektrophotometer werden. Etwa 15 ug von hoher Qualität Gesamt-RNA wird routinemäßig von 50 Zebrafischembryonen mit einem A 260 / A 280-Verhältnis etwa 1,9-2,0 ergab. <img src="/files/ftp_upload/1470/1470fig2.jpg" alt="Abbildung 2" /> Abbildung 2. Ein RNA Denaturierung Gel. Für die Beurteilung der Integrität der Gesamt-RNA isoliert, kann eine RNA Denaturierung Gel lief. Ein Abstrich mit zwei hellen Streifen entsprechend 28S und 18S rRNA erwartet. Die 28S-Band sollte etwa doppelt so intensiv wie die 18S-Band sein. <img src="/files/ftp_upload/1470/1470fig3.jpg" alt="Abbildung 3" /> Abbildung 3. Eine Spur von einer RNA-Probe aus einem Bioanalyzer. Um die Integrität der Gesamt-RNA isoliert zu beurteilen, so können Proben auch auf einem Agilent 2100 Bioanalyzer analysiert werden. Zwei scharfe Spitzen, entsprechend der 28S und 18S rRNA, sollten sichtbar sein. Die 28S-Peak sollte größer sein als die 18S-Peak mit der Fläche unter den Gipfeln von etwa 2:1, jeweils. <img src="/files/ftp_upload/1470/1470fig4.jpg" alt="Abbildung 4" /> Abbildung 4. Ein NanoDrop Spektrum einer cDNA-Probe. Spektrophotometrische Analyse mit einem NanoDrop ND-1000 kann verwendet werden, um die Quantität und Qualität der cDNA-Produkt zu beurteilen. Die A 260 / A 280-Verhältnis sollte bei 1,8. cDNA-Reaktionen mit einem Eingang von 5 ug Gesamt-RNA routinemäßig Ertrag 1-2 ug cDNA in unserem Labor. Tabelle 1. Komponenten für RNA / Primer-Mischungen bei Schritt 2 der cDNA-Synthese hinzuzufügen. <table border="1" cellspacing="0" cellpadding="0"><tbody><tr><td> Komponente </td><td> Volumen </td></tr><tr><td> Gesamt-RNA (bis zu 5 ug) </td><td> 10 pl </td></tr><tr><td> 10 mM dNTP-Mix </td><td> 1 ul </td></tr><tr><td> Oligo (dT) 12-18 (0,5 ug / ul) </td><td> 1 ul </td></tr><tr><td> DEPC-behandeltem Wasser </td><td> n ul </td></tr><tr><td> Gesamtvolumen </td><td> 10 pl </td></tr></tbody></table> Tabelle 2. Reaktionsgemisch Schritt 5 von cDNA-Synthese. Volumes aufgelistet sind pro Reaktion. Erhöhen Mengen jeder Komponente für die Gesamtzahl der Reaktionen. <table border="1" cellspacing="0" cellpadding="0"><tbody><tr><td> Komponente </td><td> Volumen </td></tr><tr><td> 10x RT-Puffer </td><td> 2 ul </td></tr><tr><td> 25 mM MgCl2 </td><td> 4 ul </td></tr><tr><td> 0,1 mM DTT </td><td> 2 ul </td></tr><tr><td> RNAseOUT </td><td> 1 ul </td></tr></tbody></table>

<ol>
	<li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> TRIzol Reagent Manual. , (2007).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> RNEasy Mini Handbook. , (2006).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> SuperScript First-Strand Synthesis System for RT-PCR. , (2003).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

Die Fragilität des RNA-Moleküls ist die kritische Betrachtung, die in diesem Protokoll darf nicht vergessen werden. Sterile Geräte, RNAse-frei ist, sollte immer in einem RNAse-freien Zone des Labors eingesetzt werden. Es ist hilfreich, ein Teil des Labors für RNA Verfahren nur verwendet werden, behalten. Dieser Bereich sollte häufig mit einer RNAse Entfernen Produkt, wie RNase AWAY gesprüht werden. Die RNA-Proben sollten immer mit Handschuhen angefasst werden und auf Eis gehalten, um den Abbau zu verhindern. <...

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		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Glycogen (5 mg/ml)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Ambion</td>
<td>9510</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>NanoDrop ND-100</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Thermo Scientific </td>
<td>ND-1000</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Pellet Pestles with Microfuge Tube</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>VWR</td>
<td>KT749520-0090</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Phase Lock Gel Light, 1.5 ml</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Eppendorf</td>
<td>2302800</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Phenol, Tris-saturated</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Roche Diagnostics</td>
<td>3117944001</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>RNAse Away</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>VWR</td>
<td>17810-491</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>RNAse-Free DNase Set</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Qiagen</td>
<td>79254</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>RNEasy Mini Kit</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Qiagen</td>
<td>74104</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>SuperScript&reg; First-Strand Synthesis System for RT-PCR</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>11904-018</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>TRIzol</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>15596-026</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

rna isolation from embryonic zebrafish and cdna synthesis for gene expression analysis

Viele wichtige und komplexe Labor-Verfahren erfordern eine Eingabe von hoher Qualität, intakte RNA. A abgebaut Probe oder das Vorhandensein von Verunreinigungen können zu katastrophalen Ergebnissen in nachgelagerten experimentelle Anwendungen führen. Es ist daher von größter Bedeutung, solide Technik mit zahlreichen Sicherheitsvorkehrungen und Qualitätskontrollen zu verwenden, um ein überlegenes Probe zu gewährleisten. Hier berichten wir ausführlich ein Protokoll zur Gesamt-RNA aus ganzen Zebrafisch-Embryos mit einem handelsüblichen chemischen Denaturierungsmittel und anschließender Bereinigung um Spuren von DNA und Verunreinigungen unter Verwendung eines handelsüblichen RNA Isolation Kit entfernen zu isolieren. Als RNA ist relativ instabil und leicht anfällig für Spaltung durch RNAsen, mit den meisten Protokollen Assay Genexpression einer cDNA-Produkt, das direkt von einer RNA-Matrize synthetisiert wird. Wir Detail ein Verfahren zur RNA in die stabilere cDNA-Produkt mit einem kommerziell erhältlichen Kit zu konvertieren. Während diese Verfahren gibt es zahlreiche Qualitätskontrollen, um sicherzustellen, dass die Probe nicht abgebaut wird oder verschmutzt. Das Endprodukt dieser Protokolle cDNA, die für Microarray-Analyse, RT-PCR oder langfristige Lagerung ist.

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RNA Isolation from Embryonic Zebrafish and cDNA Synthesis for Gene Expression Analysis

Die Isolierung von hoher Qualität, ist intakte RNA ein wesentlicher Schritt in vielen Labor-Protokolle. Hier zeigen wir, die RNA-Extraktion aus ganzen Zebrafisch-Embryos und cDNA-Synthese für die spätere Anwendung in verschiedenen experimentellen Verfahren, einschließlich Genexpression Microarray-Analyse.

RNA Isolation aus embryonalen Zebrafisch und cDNA-Synthese für die Genexpressionsanalyse

Many important and complex laboratory procedures require an input of high quality, intact RNA.  A degraded sample or the presence of impurities can lead ...

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Research

JoVE Journal

Biology

37.7K Aufrufe.  Purdue University. Die Isolierung von hoher Qualität, ist intakte RNA ein wesentlicher Schritt in vielen Labor-Protokolle. Hier zeigen wir, die RNA-Extraktion aus ganzen Zebrafisch-Embryos und cDNA-Synthese für die spätere Anwendung in verschiedenen experimentellen Verfahren, einschließlich Genexpression Microarray-Analyse.

Serie: RNA Isolation from Embryonic Zebrafish and cDNA Synthesis for Gene Expression Analysis

The Preparation of Primary Hematopoietic Cell Cultures From Murine Bone Marrow for Electroporation

It is becoming increasingly apparent that electroporation is the most effective way to introduce plasmid DNA or siRNA into primary cells. The Gene Pulser MXcell  electroporation system and Gene Pulser  electroporation buffer were specifically developed to transfect nucleic acids into mammalian cells and difficult-to-transfect cells, such as primary and stem cells.This video demonstrates how to establish primary hematopoietic cell cultures from murine bone marrow, and then prepare them for electroporation in the MXcell system. We begin by isolating femur and tibia. Bone marrow from both femur and tibia are then harvested and cultures are established. Cultured bone marrow cells are then transfected and analyzed.

This procedure describes how to establish primary hematopoietic cell cultures from murine bone marrow and is followed by transfection using the Gene Pulser MXCell electroporation system.

Die Herstellung von primären hämatopoetischen Zellkulturen aus Knochenmark der Maus für die Elektroporation

It is becoming increasingly apparent that electroporation is the most effective way to introduce plasmid DNA or siRNA into primary cells. The Gene Pulser ...

Forschung

Biologie

Global Gene Expression Analysis Using a Zebrafish Oligonucleotide Microarray Platform

Gene microarray technology permits quantitative measurement and gene expression profiling of transcript levels on a genome-wide basis. Gene microarray technology is used in numerous biological disciplines in a variety of applications including global gene expression analysis in relation to developmental stage, to a disease state, and in toxic responses. Herein, we include a demonstration of global gene expression analysis using a comprehensive zebrafish-specific oligonucleotide microarray platform. The zebrafish expression microarray platform contains 385,000 probes, 60 base pairs in length, interrogating 37,157 targets with up to 12 probes per target. For this platform, all cDNA and genomic information available for the zebrafish was collected from various genomic databases including Ensembl (http://www.ensembl.org), VEGA (http://vega.sanger.ac.uk), UCSC (http://genome.ucsc.edu), and ZFIN (http://www.zfin.org). As a result this expression array provides complete coverage of the current zebrafish transcriptome. The zebrafish expression microarray was printed by Roche NimbleGen (Madison, WI). This technical demonstration includes the fluorescent labeling of a cDNA product, hybridization of the labeled cDNA product to the microarray platform, and array scanning for signal acquisition using the one color analysis strategy.  

Gene microarrays are powerful tools in gene expression profiling at a genome-wide level. This technology has application in a variety of biological disciplines including developmental biology and toxicology. In this video, we detail a protocol for global gene expression analysis using a comprehensive oligonucleotide microarray platform for the zebrafish.

Globale Genexpressionsanalyse Mit einem Zebrafisch Oligonukleotid-Microarray-Plattform

Gene microarray technology permits quantitative measurement and gene expression profiling of transcript levels on a genome-wide basis. Gene microarray ...

Using the Gene Pulser MXcell Electroporation System to Transfect Primary Cells with High Efficiency

It is becoming increasingly apparent that electroporation is the most effective way to introduce plasmid DNA or siRNA into primary cells. The Gene Pulser MXcell electroporation system and Gene Pulser electroporation buffer (Bio-Rad) were specifically developed to easily transfect nucleic acids into mammalian cells and difficult-to-transfect cells, such as primary and stem cells. We will demonstrate how to perform a simple experiment to quickly identify the best electroporation conditions. We will demonstrate how to run several samples through a range of electroporation conditions so that an experiment can be conducted at the same time as optimization is performed. We will also show how optimal conditions identified using 96-well electroporation plates can be used with standard electroporation cuvettes, facilitating the switch from electroporation plates to electroporation cuvettes while maintaining the same electroporation efficiency. In the video, we will also discuss some of the key factors that can lead to the success or failure of electroporation experiments.

This procedure shows how to use the Gene Pulser MXcell electroporation system to rapidly and easily identify the best electroporation conditions for mouse embryonic fibroblasts (MEFs) or other primary cells. Considerations for troubleshooting are also discussed in the associated video.

Mit dem Gene Pulser MXcell Elektroporation System zur Primary Cells mit hohem Wirkungsgrad zu transfizieren

Using an Automated Cell Counter to Simplify Gene Expression Studies: siRNA Knockdown of IL-4 Dependent Gene Expression in Namalwa Cells

The use of siRNA mediated gene knockdown is continuing to be an important tool in studies of gene expression.  siRNA studies are being conducted not only to study the effects of downregulating single genes, but also to interrogate signaling pathways and other complex interaction networks.  These pathway analyses require both the use of relevant cellular models and methods that cause less perturbation to the cellular physiology.  Electroporation is increasingly being used as an effective way to introduce siRNA and other nucleic acids into difficult to transfect cell lines and primary cells without altering the signaling pathway under investigation. There are multiple critical steps to a successful siRNA experiment, and there are ways to simplify the work while improving the data quality at several experimental stages.  To help you get started with your siRNA mediated gene knockdown project, we will demonstrate how to perform a pathway study complete from collecting and counting the cells prior to electroporation through post transfection real-time PCR gene expression analysis.  The following study investigates the role of the transcriptional activator STAT6 in IL-4 dependent gene expression of CCL17 in a Burkitt lymphoma cell line (Namalwa).  The techniques demonstrated are useful for a wide range of siRNA-based experiments on both adherent and suspension cells.  We will also show how to streamline cell counting with the TC10 automated cell counter, how to electroporate multiple samples simultaneously using the MXcell electroporation system, and how to simultaneously assess RNA quality and quantity with the Experion automated electrophoresis system.

This procedure describes a quick and easy workflow to introduce siRNA into difficult to transfect cell lines and follow gene expression by real-time PCR. Use of an automated cell counter, multi-well electroporation plate, and automated electrophoresis station provide quick and reliable results without the need for expensive robotic handling.

Verwendung eines automatisierten Cell Counter zu Genexpressionsstudien Simplify: siRNA Knockdown von IL-4 abhängige Genexpression in Namalwalzellen

The use of siRNA mediated gene knockdown is continuing to be an important tool in studies of gene expression.  siRNA studies are being conducted not only ...

Isolation and Culture of Cells from the Nephrogenic Zone of the Embryonic Mouse Kidney

Embryonic development of the kidney has been extensively studied both as a model for epithelial-mesenchymal interaction in organogenesis and to gain understanding of the origins of congenital kidney disease. More recently, the possibility of steering na&iuml;ve embryonic stem cells toward nephrogenic fates has been explored in the emerging field of regenerative medicine. Genetic studies in the mouse have identified several pathways required for kidney development, and a global catalog of gene transcription in the organ has recently been generated <a href="http://www.gudmap.org/">http://www.gudmap.org/</a>, providing numerous candidate regulators of essential developmental functions. Organogenesis of the rodent kidney can be studied in organ culture, and many reports have used this approach to analyze outcomes of either applying candidate proteins or knocking down the expression of candidate genes using siRNA or morpholinos. However, the applicability of organ culture to the study of signaling that regulates stem/progenitor cell differentiation versus renewal in the developing kidney is limited as cultured organs contain a compact extracellular matrix limiting diffusion of macromolecules and virus particles. To study the cell signaling events that influence the stem/progenitor cell niche in the kidney we have developed a primary cell system that establishes the nephrogenic zone or progenitor cell niche of the developing kidney ex vivo in isolation from the epithelial inducer of differentiation. Using limited enzymatic digestion, nephrogenic zone cells can be selectively liberated from developing kidneys at E17.5. Following filtration, these cells can be cultured as an irregular monolayer using optimized conditions. Marker gene analysis demonstrates that these cultures contain a distribution of cell types characteristic of the nephrogenic zone in vivo, and that they maintain appropriate marker gene expression during the culture period. These cells are highly accessible to small molecule and recombinant protein treatment, and importantly also to viral transduction, which greatly facilitates the study of candidate stem/progenitor cell regulator effects. Basic cell biological parameters such as proliferation and cell death as well as changes in expression of molecular markers characteristic of nephron stem/progenitor cells in vivo can be successfully used as experimental outcomes. Ongoing work in our laboratory using this novel primary cell technique aims to uncover basic mechanisms governing the regulation of self-renewal versus differentiation in nephron stem/progenitor cells.

In this report we describe a method for the isolation and culture of the progenitor cell niche from the embryonic mouse kidney that can be used to study signaling pathways regulating stem/progenitor cells of the developing kidney. These cultured cells are highly accessible to small molecule and recombinant protein treatment, and importantly also to viral transduction, which allows efficient manipulation of candidate pathways.

Isolierung und Kultivierung von Zellen aus dem Nephrogene Zone der embryonalen Maus Niere

Embryonic development of the kidney has been extensively studied both as a model for epithelial-mesenchymal interaction in organogenesis and  to gain ...

Metabolic Labeling of Newly Transcribed RNA for High Resolution Gene Expression Profiling of RNA Synthesis, Processing and Decay in Cell Culture

The development of whole-transcriptome microarrays and next-generation sequencing has revolutionized our understanding of the complexity of cellular gene expression. Along with a better understanding of the involved molecular mechanisms, precise measurements of the underlying kinetics have become increasingly important. Here, these powerful methodologies face major limitations due to intrinsic properties of the template samples they study, i.e. total cellular RNA. In many cases changes in total cellular RNA occur either too slowly or too quickly to represent the underlying molecular events and their kinetics with sufficient resolution. In addition, the contribution of alterations in RNA synthesis, processing, and decay are not readily differentiated.
We recently developed high-resolution gene expression profiling to overcome these limitations. Our approach is based on metabolic labeling of newly transcribed RNA with 4-thiouridine (thus also referred to as 4sU-tagging) followed by rigorous purification of newly transcribed RNA using thiol-specific biotinylation and streptavidin-coated magnetic beads. It is applicable to a broad range of organisms including vertebrates, Drosophila, and yeast. We successfully applied 4sU-tagging to study real-time kinetics of transcription factor activities, provide precise measurements of RNA half-lives, and obtain novel insights into the kinetics of RNA processing. Finally, computational modeling can be employed to generate an integrated, comprehensive analysis of the underlying molecular mechanisms.

Total cellular RNA provides a poor template for studying short-term changes in RNA synthesis and decay as well as the kinetics of RNA processing. Here, we describe metabolic labeling of newly transcribed RNA with 4-thiouridine followed by thiol-specific biotinylation and purification of newly transcribed RNA allowing to overcome these limitations.

Metabolische Markierung der neu transkribierten RNA für High Resolution Gene Expression Profiling von RNA Synthese, Verarbeitung und Decay in Zellkultur

The development of whole-transcriptome microarrays and next-generation sequencing has revolutionized our understanding of the complexity of cellular gene ...

Analysis of Embryonic and Larval Zebrafish Skeletal Myofibers from Dissociated Preparations

The zebrafish has proven to be a valuable model system for exploring skeletal muscle function and for studying human muscle diseases. Despite the many advantages offered by in vivo analysis of skeletal muscle in the zebrafish, visualizing the complex and finely structured protein milieu responsible for muscle function, especially in whole embryos, can be problematic. This hindrance stems from the small size of zebrafish skeletal muscle (60 &mu;m) and the even smaller size of the sarcomere. Here we describe and demonstrate a simple and rapid method for isolating skeletal myofibers from zebrafish embryos and larvae. We also include protocols that illustrate post preparation techniques useful for analyzing muscle structure and function. Specifically, we detail the subsequent immunocytochemical localization of skeletal muscle proteins and the qualitative analysis of stimulated calcium release via live cell calcium imaging. Overall, this video article provides a straight-forward and efficient method for the isolation and characterization of zebrafish skeletal myofibers, a technique which provides a conduit for myriad subsequent studies of muscle structure and function.

Zebrafish are an emerging system for modeling human disorders of the skeletal muscle. We describe a fast and efficient method to isolate skeletal muscle myofibers from embryonic and larval zebrafish. This method yields a high-density myofiber preparation suitable for study of single skeletal muscle fiber morphology, protein subcellular localization, and muscle physiology.

Analyse der embryonalen Zebrafisch-Larven-und Skelett Muskelfasern aus Dissoziierte Vorbereitungen

The zebrafish has  proven to be a valuable model system for exploring skeletal muscle function and  for studying human muscle diseases. Despite  the many ...

Affinity-based Isolation of Tagged Nuclei from Drosophila Tissues for Gene Expression Analysis

Drosophila melanogaster embryonic and larval tissues often contain a highly heterogeneous mixture of cell types, which can complicate the analysis of gene expression in these tissues. Thus, to analyze cell-specific gene expression profiles from Drosophila tissues, it may be necessary to isolate specific cell types with high purity and at sufficient yields for downstream applications such as transcriptional profiling and chromatin immunoprecipitation. However, the irregular cellular morphology in tissues such as the central nervous system, coupled with the rare population of specific cell types in these tissues, can pose challenges for traditional methods of cell isolation such as laser microdissection and fluorescence-activated cell sorting (FACS). Here, an alternative approach to characterizing cell-specific gene expression profiles using affinity-based isolation of tagged nuclei, rather than whole cells, is described. Nuclei in the specific cell type of interest are genetically labeled with a nuclear envelope-localized EGFP tag using the Gal4/UAS binary expression system. These EGFP-tagged nuclei can be isolated using antibodies against GFP that are coupled to magnetic beads. The approach described in this protocol enables consistent isolation of nuclei from specific cell types in the Drosophila larval central nervous system at high purity and at sufficient levels for expression analysis, even when these cell types comprise less than 2% of the total cell population in the tissue. This approach can be used to isolate nuclei from a wide variety of Drosophila embryonic and larval cell types using specific Gal4 drivers, and may be useful for isolating nuclei from cell types that are not suitable for FACS or laser microdissection.

Affinity-based Isolation of Tagged Nuclei from Drosophila Tissues for Gene Expression Analysis

Drosophila tissues often contain a heterogeneous mixture of cell types.&#160;To examine gene expression in specific cell types from a particular tissue, nuclei can be genetically tagged and subsequently isolated using an affinity-based approach. Isolated nuclei can be used for downstream applications such as gene expression analysis and chromatin immunoprecipitation.

Affinity-basierte Isolierung von Tagged Kerne aus<em&gt; Drosophila</em&gt; Tücher für Genexpressionsanalyse

Drosophila melanogaster embryonic and larval tissues often contain a highly heterogeneous mixture of cell types, which can complicate the analysis of gene ...

Analysis of Global RNA Synthesis at the Single Cell Level following Hypoxia

Hypoxia or lowering of the oxygen availability is involved in many physiological and pathological processes. At the molecular level, cells initiate a particular transcriptional program in order to mount an appropriate and coordinated cellular response. The cell possesses several oxygen sensor enzymes that require molecular oxygen as cofactor for their activity. These range from prolyl-hydroxylases to histone demethylases. The majority of studies analyzing cellular responses to hypoxia are based on cellular populations and average studies, and as such single cell analysis of hypoxic cells are seldom performed. Here we describe a method of analysis of global RNA synthesis at the single cell level in hypoxia by using Click-iT RNA imaging kits in an oxygen controlled workstation, followed by microscopy analysis and quantification.&nbsp; Using cancer cells exposed to hypoxia for different lengths of time, RNA is labeled and measured in each cell. This analysis allows the visualization of temporal and cell-to-cell changes in global RNA synthesis following hypoxic stress.

We describe a technique for analysis of global RNA synthesis in hypoxia using imaging. Click-chemistry labeling of RNA has not previously been performed under hypoxia and allows visualization of global RNA changes at the single cell level. This approach complements the existing averaged RNA techniques, allowing direct visualization of cell-to-cell changes in global RNA synthesis.

Analyse der globalen RNA-Synthese auf der Einzelzellebene folgende Hypoxie

Hypoxia or lowering of the oxygen availability is involved in many physiological and pathological processes. At the molecular level, cells initiate a ...

Targeted RNA Sequencing Assay to Characterize Gene Expression and Genomic Alterations

RNA sequencing (RNAseq) is a versatile method that can be utilized to detect and characterize gene expression, mutations, gene fusions, and noncoding RNAs. Standard RNAseq requires 30 - 100 million sequencing reads and can include multiple RNA products such as mRNA and noncoding RNAs. We demonstrate how targeted RNAseq (capture) permits a focused study on selected RNA products using a desktop sequencer. RNAseq capture can characterize unannotated, low, or transiently expressed transcripts that may otherwise be missed using traditional RNAseq methods. Here we describe the extraction of RNA from cell lines, ribosomal RNA depletion, cDNA synthesis, preparation of barcoded libraries, hybridization and capture of targeted transcripts and multiplex sequencing on a desktop sequencer. We also outline the computational analysis pipeline, which includes quality control assessment, alignment, fusion detection, gene expression quantification and identification of single nucleotide variants. This assay allows for targeted transcript sequencing to characterize gene expression, gene fusions, and mutations.

We describe a targeted RNA sequencing-based method that includes preparation of indexed cDNA libraries, hybridization and capture with custom probes and data analysis to interrogate selected transcripts for gene expression, mutations, and gene fusions. Targeted RNAseq permits cost-effective, rapid evaluation of selected transcripts on a desktop sequencer.

RNA-Sequenzierung Assay Gezieltes Genexpression und Genomic Änderungen an Charakterisieren

RNA sequencing (RNAseq) is a versatile method that can be utilized to detect and characterize gene expression, mutations, gene fusions, and noncoding ...