Diese Arbeit wurde durch die NIH und PKD Stiftung ZS unterstützt. Alle Tierexperimente wurden nach Yale Tiere Resources Center (YARC) und Institutional Animal Care und Verwenden Committee (IACUC) Richtlinien durchgeführt.

Teil 1: Herstellung von Mikropipetten und die Mikroinjektion Kammerplatten <ol><li> Fertigen Mikropipetten durch Erhitzen und Ziehen Borosilikatglas Kapillaren (World Precision Instruments, Inc., 1B100-4) in einer Mikropipette Abziehvorrichtung (Sutter Instruments Inc., Flaming / Brown P-97). Shop in einer Petrischale auf der kleinen Menge von Ton oder Klebeband. </li><li> Gießen Sie 1,5% Agarose (American Bioanlytical, Inc., AB00972-00500) in 1x E3 Medium-Platten mit keilförmigen Rinnen, die als eine einfache Methode zur Aufnahme des Embryos während der Injektion dienen (wie in &quot;Der Zebrafisch Book&quot; beschrieben) wird geformt 1. Lassen Agar Kammerplatten erstarren vor dem Gebrauch und Lagerung bei 4 º C. </li></ol> Teil 2: Herstellung von RNA Ein leistungsfähiges Konzept für die Gen-Funktions-Studien ist es, in vitro transkribiert capped RNA in Zebrafisch-Embryonen microinject. Capped RNA verhält sich ähnlich wie eukaryotischen mRNAs in vivo durch die Anwesenheit der GAP analog gefunden. Zebrafisch Forscher routinemäßig nutzen diese Methode, um überexprimieren oder misexpress ihre Gen von Interesse. In dieser Demonstration werden wir microinject eines EGFP-markierten Transkript und Nutzung leben ganzen Embryo GFP-Expression als eine sichtbare Anzeige für eine erfolgreiche Injektion. <ol><li> Führen Sie eine In-vitro-CAP RNA-Transkription Reaktion auf Ihrem Transkript des Interesses. In unserem Labor haben wir routinemäßig legen Sie eine cDNA von Interesse in einen pCS2 + Vektor, und führen Sie ein in vitro-Synthese-Reaktion von großen Mengen von capped RNA mit dem mMessage mMachine SP6 Kit (Ambion, Inc., AM1340). </li><li> Purify der RNA-Probe, indem Sie es durch die RNeasy Mini Kit (Qiagen, Inc., 74104) oder durch Phenol: Chloroform-Extraktion und Isopropanol-Fällung. </li><li> Sorgfältig bestimmen die Konzentration der RNA-Präparation und Lagerung bei -80 º C bis zur Verwendung. </li><li> Am Tag der Injektion, tauen die RNA-Probe, Wirbel leicht und Spin-down kurz. </li><li> Bereiten Sie eine funktionierende Lösung mit sterilem Wasser und eine endgültige Konzentration von 0,025 bis 0,050% Phenolrot (Sigma-Aldrich Co., P0290). Phenolrot dient als sichtbare Markierung für die Injektion der Lösung in den Embryo. In diesem Artikel werden wir eine funktionierende Lösung von 100 ng / ul EGFP mRNA mit 0,050% Phenolrot vorzubereiten. </li><li> Halten Sie arbeiten Probe auf Eis und zurück RNA Lager bis -80 ° C. </li><li> Fahren Sie mit Teil 4 als bereit, diese Probe zu injizieren. </li></ol> Teil 3: Herstellung von Morpholino Morpholino Antisense-Oligonukleotide sind weit verbreitet, um die Genexpression durch die Blockierung Übersetzung eines Zielproteins oder durch die Änderung pre-mRNA-Spleißen 2,3 zu ändern. Morpholinos in der Zebrafisch als leistungsfähige reversen Genetik Werkzeug dienen, indem man den Gen-Funktion. In diesem Artikel werden wir microinject eine Morpholino Oligo gezielt auf die Translation zur Website von PKD2 (5&#39;-AGGACGAACGCGACTGGAGCTCATC-3 &#39;). Basierend auf vorher festgelegten Arbeiten erwarten wir, dass die injizierten Embryonen phänotypisch imitieren PKD2 mutierten Fische 4. <ol><li> Wir routinemäßig um 300 nmol eines Morpholino Oligo speziell für ein Gen von Interesse von Gene Tools, LLC (Philomath, OR) entwickelt. </li><li> Add 100 uL sterilem Wasser zu einer 3 mM-Stammlösung zu machen. Aliquot der Lösung und bei -20 ° C bis zur Verwendung. </li><li> Am Tag der Injektion Wärme der Morpholino-Lösung bei 65 ° C für 5 Minuten. Snap kühl auf Eis sofort und Spin kurz. Dieser Schritt denaturiert alle sekundären Strukturen in der Oligo und sorgt dafür, dass die Lösung vollständig gelöst. </li><li> Bereiten Sie eine funktionierende Lösung durch Verdünnen der Morpholino-Lösung in sterilem Wasser und eine endgültige Konzentration von 0,025 bis 0,050% Phenolrot. In dieser Demonstration werden wir vorbereiten eine funktionierende Lösung von 0,50 mM PKD2 Morpholino mit 0,050% Phenolrot. </li><li> Keep funktionierende Lösung bei Raumtemperatur. </li><li> Fahren Sie mit Teil 4 als bereit, diese Probe zu injizieren .---- </li></ol> Teil 4: Füllen der Mikropipette mit Ihrem funktionierende Lösung <ol><li> Cut der distalen Spitze einer Mikropipette mit einer Pinzette oder einer chirurgischen Rasierklinge, um eine Öffnung, die gerade noch sichtbar unter einem Binokular (Nikon Instruments, Inc., SM2645) bei 50X Vergrößerung ist zu schaffen. </li><li> Platz 2 uL Ihrer Gebrauchslösung wie ein Tropfen auf einem Deckglas. </li><li> Befestigen Sie die Rückseite einer Mikropipette auf eine 5 ml-Spritze mit Schlauch auf einer Injektionsnadel und leicht untertauchen der distalen Spitze der Mikropipette in die Tropfen funktionierende Lösung ausgestattet. Achten Sie darauf, die Spitze der Mikropipette zu brechen. </li><li> Siphon der Arbeitslösung durch das distale Ende der Mikropipette, indem Sie den Kolben der Spritze. </li></ol> Teil 5: Kalibrierung der Mikropipette Injektionsvolumen <ol><li> Geben Sie einen Tropfen Mineralöl (American Bioanalytische, Inc., AB00921-00025) auf einem Mikrometer slide (Fisher, 12-561-SM1). </li><li> Schalten Sie die Stromversorgung und Luftzufuhr, um den Druck-gepulsten Mikro Injektorvorrichtung (World Precision Instruments Inc., PV830). </li><li> Bringen Sie die Mikropipette auf die Mikropipette Inhaber der Mikro Injektorvorrichtung. Die Mikro-Injektor wird der Druck reguliert und Entladungen werden durch Drücken des Pedals aktiviert. </li><li> Unter dem Dissektionsmikroskop, testen das Injektionsvolumen mit dem Mikro-Injektor zu einem Rückgang der funktionierende Lösung auf den Mikrometer-Öl statt. Messen Sie den Durchmesser der Tropfen, wie sie als eine Kugel auf der Oberseite des Öl schwimmt. </li><li> Stellen Sie die Dauer und der Druck der Injektion sorgfältig kalibrieren Ihr Volumen der Injektion. Dieser Schritt hilft bei der Reproduzierbarkeit der Mikroinjektion Experiment. In dieser Demonstration werden alle microinjections mit einem Tropfen Durchmesser von 0,15 mm (ungefähr 1,76 nL in Volumen) durchgeführt werden. </li><li> Sobald Ihr Injektionsvolumen kalibriert wurde, verwenden Sie die &quot;Hold&quot;-Knopf auf der Mikro-Injektor zur Verfüllung und undichte der Mikropipette zu verhindern. </li></ol> Teil 6: Vorbereiten befruchtete Zebrafisch-Embryos für die Mikroinjektion <ol><li> Zebrafische nach dem Zufallsprinzip in den ersten Stunden des Morgens mate. Sammeln Embryonen im 1-Zell-Stadium und legen Sie sie in 1x E3 Medium. </li><li> Mit einem 3 mL Transfer-Pipette (Becton Dickinson Labware, 357524), ordnen Sie die Embryonen an der keilförmigen Rinnen in die Mikroinjektion Kammerplatten. </li><li> Entfernen Sie das Medium so, dass die Embryonen flach sind untergetaucht und nicht überflutet. Dieser Schritt hilft bei der Lösung des Embryos an der Unterseite der Tröge sowie in der Durchdringung des Chorion durch die Mikropipette. </li></ol> Teil 7: Mikroinjektion durch das Chorion <ol><li> Bearbeiten Sie die Embryonen mit der Mikropipette, so dass das Zytoplasma der 1-Zell-Stadium Embryos sichtbar unter dem Binokular ist. Achten Sie darauf, die Spitze der Mikropipette zu brechen. </li><li> Dringen in die Chorion und dann das Eigelb mit der Mikropipette, um in den Embryo zu injizieren. In dieser Demonstration werden wir zunächst Mikroinjektion in den Dotter direkt unterhalb der Zelle sein, und erlauben zytoplasmatische Strömung und Diffusion an die funktionierende Lösung in die Zelle zu bringen. Dieser Fluss wird sichtbar durch die Phenolrot hinzugefügt, um die funktionierende Lösung. </li><li> Wir werden auch zeigen, direkte Injektion in das Zytoplasma. Die direkte Mikroinjektion in die Zelle ist robuster, aber zeitaufwendig, da richtige Embryo Orientierung und Mikroinjektionstechnik erforderlich ist. Da die Zellmembran ist strenger als die Dotterhaut, ist es oft schneller auf die Mikropipette durch das Eigelb geben, um Zytoplasma der Zelle zu erreichen. Die Ausrichtung der animalen Pol in Richtung Boden der Wanne und die Arbeit mit ruhige Hände können bei dieser Methode der Injektion zu unterstützen. </li><li> Nach Mikroinjektion, legen Sie die Embryonen in einer Petrischale mit E3 mittel-und inkubieren sie bei 28,5 ° C für eine normale Entwicklung. </li><li> Im Laufe der nächsten Stunden und Tage der Embryonalentwicklung, beobachten die Embryonen für Ihre Phänotypen von Interesse. </li></ol> Teil 8: Repräsentative Ergebnisse EGFP mRNA-Überexpression: Um zu überprüfen, den Erfolg der Mikroinjektion, überwachen wir die Expression von GFP in den sich entwickelnden Embryonen ab Schild Stufe (~ 6 hpf) durch in vivo whole-Embryo-Fluoreszenzmikroskopie (Leica Microsystems GmbH, MZFLIII). Expression des Konstrukts ist am starken während der frühen Ereignisse der embryonalen Entwicklung und wird oft während der Entwicklung schwinden, da die injizierten capped RNA wird allmählich abgebaut und hängt von der Stabilität des exprimierten Proteins. PKD2 translationale-blocking Morpholino: Basierend auf den bisher veröffentlichten Ergebnissen erwarten wir, dass die PKD2 morphants zum dorsalen Körperachse Krümmung wie in PKD2 mutierte Zebrafische und Gegenwart Nierenzysten bei etwa 2 zu imitieren - 3 dpf 4. <img src="/files/ftp_upload/1113/1113fig1.png" alt="Abbildung 1" /> Abbildung 1: Repräsentative Ergebnisse aus Mikroinjektion von EGFP mRNA und PKD2 August Morpholino. (A) TAB Embryonen wurden bei der 1-Zell-Stadium mit 0,17 ng EGFP mRNA mikroinjiziert und visualisiert bei 1 dpf für in vivo GFP-Expression. (B, c) TAB Embryonen wurden bei der 1-Zell-Stadium mit ~ 1,7 nl einer PKD2 translationale blockiert Morpholino bei 0,50 mM mikroinjiziert und erzielte für die dorsale Körper Krümmung bei 4 dpf.

<ol>
	<li>Westerfield, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The zebrafish book. A guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio). , (2000).</li><li>Nasevicius, A., Ekker, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effective+targeted+gene+'knockdown'+in+zebrafish.">Effective targeted gene 'knockdown' in zebrafish.</a> Nat Genet. 26, 216-220 (2000).</li><li>Draper, B., Morcos, P., Kimmel, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+zebrafish+fgf8+pre-mRNA+splicing+with+morpholino+oligos:+a+quantifiable+method+for+gene+knockdown.">Inhibition of zebrafish fgf8 pre-mRNA splicing with morpholino oligos: a quantifiable method for gene knockdown.</a> Genesis. 30, 154-156 (2001).</li><li>Sun, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+genetic+screen+in+zebrafish+identifies+cilia+genes+as+a+principal+cause+of+cystic+kidney.">A genetic screen in zebrafish identifies cilia genes as a principal cause of cystic kidney.</a> Development. 131, 4085-4093 (2004).</li><li>Stuart, G., McMurray, J., Westerfield, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Replication,+integration+and+stable+germ-line+transmission+of+foreign+sequences+injected+into+early+zebrafish+embryos.">Replication, integration and stable germ-line transmission of foreign sequences injected into early zebrafish embryos.</a> Development. 103, 403-412 (1988).</li><li>Stuart, G., Vielkind, J., McMurray, J., Westerfield, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stable+lines+of+transgenic+zebrafish+exhibit+reproducible+patterns+of+transgene+expression.">Stable lines of transgenic zebrafish exhibit reproducible patterns of transgene expression.</a> Development. 109, 577-584 (1990).</li><li>Culp, P., N&#252;sslein-Volhard, C., Hopkins, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-frequency+germ-line+transmission+of+plasmid+DNA+sequences+injected+into+fertilized+zebrafish+eggs.">High-frequency germ-line transmission of plasmid DNA sequences injected into fertilized zebrafish eggs.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 88, 7953-7957 (1991).</li><li>Strehlow, D., Heinrich, G., Gilbert, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+fates+of+the+blastomeres+of+the+16-cell+zebrafish+embryo.">The fates of the blastomeres of the 16-cell zebrafish embryo.</a> Development. 120, 1791-1798 (1994).</li><li>Helde, K., Wilson, E., Cretekos, C., Grunwald, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Contribution+of+early+cells+to+the+fate+map+of+the+zebrafish+gastrula.">Contribution of early cells to the fate map of the zebrafish gastrula.</a> Science. 265, 517-520 (1994).</li><li>Lin, S., Long, W., Chen, J., Hopkins, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+germ-line+chimeras+in+zebrafish+by+cell+transplants+from+genetically+pigmented+to+albino+embryos.">Production of germ-line chimeras in zebrafish by cell transplants from genetically pigmented to albino embryos.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 89, 4519-4523 (1992).</li><li>Long, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GATA-1+expression+pattern+can+be+recapitulated+in+living+transgenic+zebrafish+using+GFP+reporter+gene.">GATA-1 expression pattern can be recapitulated in living transgenic zebrafish using GFP reporter gene.</a> Development. 124, 4105-4111 (1997).</li><li>Murphey, R., Zon, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small+molecule+screening+in+the+zebrafish.">Small molecule screening in the zebrafish.</a> Methods. 39, 255-261 (2006).</li></ol>

Mikroinjektion in Zebrafisch-Embryonen ist eine gut etablierte und robuste Technik für die Erkundung der Rolle eines bestimmten Gens in der Entwicklung. Zu den Anwendungen gehören Überexpression misexpression und Knockdown Assays Ihrer Gen von Interesse als auch epistatisch Analyse zwischen mehreren Genen. Mikroinjektion in Zebrafisch wurde weithin für die Erzeugung transgener Tiere und Mapping-Zell-Schicksal in frühen Blastula Embryonen 5,6,7,8,9 verwendet. Darüber hinaus dient die Anwendung dieser Tec...

Alle anderen Materialien werden im Protokoll aufgelistet.

microinjection of mrna and morpholino antisense oligonucleotides in zebrafish embryos.

Ein wesentliches Werkzeug zur Untersuchung der Rolle eines Gens während der Entwicklung ist die Fähigkeit, Gen Knockdown, Überexpression und misexpression Studien durchzuführen. In Zebrafisch (<em&gt; Danio rerio</em&gt;), Bietet die Mikroinjektion von RNA, DNA, Proteine, Antisense-Oligonukleotide und andere kleine Moleküle in den sich entwickelnden Embryo Forscher eine schnelle und robuste Assay für die Erkundung der Genfunktion<em&gt; In vivo</em&gt;. In diesem Video-Artikel werden wir zeigen, wie die Vorbereitung und microinject<em&gt; In-vitro-</em&gt; Synthetisiert EGFP mRNA und eine translatorische-blocking Morpholino Oligo gegen<em&gt; PKD2</em&gt;, Ein Gen mit autosomal dominante polyzystische Nierenerkrankung (ADPKD), in 1-Zell-Stadium Zebrafischembryonen verbunden. Wir werden dann analysiert den Erfolg der mRNA und Morpholino microinjections durch Überprüfung der GFP-Expression und Phänotyp-Analyse. Broad Anwendungen dieser Technik gehören Erzeugung transgener Tiere und Keimbahn-Chimären, Zell-Schicksal-Mapping und Gen-Screening. Hier beschreiben wir ein Protokoll für die Überexpression von EGFP und Knockdown von<em&gt; PKD2</em&gt; Durch mRNA und Morpholino Oligonukleotid Injektion.

Watch this Scientific Journal Video about Microinjection of mRNA and Morpholino Antisense Oligonucleotides in Zebrafish Embryos. at JoVE.com

Microinjection of mRNA and Morpholino Antisense Oligonucleotides in Zebrafish Embryos.

Mikroinjektion ist eine gut etablierte und effektive Methode für die Einführung von Fremdstoffen in befruchtete Zebrafisch-Embryos. Hier zeigen wir eine robuste Mikroinjektionstechnik für die Durchführung von mRNA-Überexpression und Morpholino-Oligonukleotid-Gen Knockdown Studien im Zebrafisch.

Mikroinjektion von mRNA und Morpholino Antisense Oligonukleotide in Zebrafisch-Embryonen.

An essential tool for investigating the role of a gene during development is the ability to perform gene knockdown, overexpression, and misexpression ...

microinjection-mrna-morpholino-antisense-oligonucleotides-zebrafish

Research

JoVE Journal

Biology

36.5K Aufrufe.  Yale University School of Medicine. Mikroinjektion ist eine gut etablierte und effektive Methode für die Einführung von Fremdstoffen in befruchtete Zebrafisch-Embryos. Hier zeigen wir eine robuste Mikroinjektionstechnik für die Durchführung von mRNA-Überexpression und Morpholino-Oligonukleotid-Gen Knockdown Studien im Zebrafisch.

Serie: Microinjection of mRNA and Morpholino Antisense Oligonucleotides in Zebrafish Embryos.

Microinjection of A. aegypti Embryos to Obtain Transgenic Mosquitoes

In this video, Nijole Jasinskiene demonstrates the methodology employed to generate transgenic Aedes aegypti mosquitoes, which are vectors for dengue fever.  The techniques for correctly preparing microinjection needles, dessicating embryos, and performing microinjection are demonstrated.

In this video, Nijole Jasinskiene demonstrates the methodology employed to generate transgenic Aedes aegypti mosquitoes, which are vectors for dengue fever. The techniques for correctly preparing microinjection needles, dessicating embryos, and performing microinjection are demonstrated.

Mikroinjektion von A. aegypti Embryonen, um transgene Moskitos erhalten

In this video, Nijole Jasinskiene demonstrates the methodology employed to generate transgenic Aedes aegypti mosquitoes, which are vectors for dengue ...

Forschung

Biologie

Microinjection of Zebrafish Embryos to Analyze Gene Function

One of the advantages of studying zebrafish is the ease and speed of manipulating protein levels in the embryo.  Morpholinos, which are synthetic oligonucleotides with antisense complementarity to target RNAs, can be added to the embryo to reduce the expression of a particular gene product.  Conversely, processed mRNA can be added to the embryo to increase levels of a gene product.  The vehicle for adding either mRNA or morpholino to an embryo is microinjection.  Microinjection is efficient and rapid, allowing for the injection of hundreds of embryos per hour.  This video shows all the steps involved in microinjection.  Briefly, eggs are collected immediately after being laid and lined up against a microscope slide in a Petri dish.  Next, a fine-tipped needle loaded with injection material is connected to a microinjector and an air source, and the microinjector controls are adjusted to produce a desirable injection volume.  Finally, the needle is plunged into the embryo's yolk and the morpholino or mRNA is expelled.

This video shows how morpholino or mRNA can be injected into zebrafish embryos at the one-cell stage to decrease or increase the level of specific gene products during subsequent development.

Mikroinjektion von Zebrafisch-Embryos, um Gene Function Analyze

One of the advantages of studying zebrafish is the ease and speed of manipulating protein levels in the embryo.  Morpholinos, which are synthetic ...

Two-photon axotomy and time-lapse confocal imaging in live zebrafish embryos

Zebrafish have long been utilized to study the cellular and molecular mechanisms of development by time-lapse imaging of the living transparent embryo. Here we describe a method to mount zebrafish embryos for long-term imaging and demonstrate how to automate the capture of time-lapse images using a confocal microscope. We also describe a method to create controlled, precise damage to individual branches of peripheral sensory axons in zebrafish using the focused power of a femtosecond laser mounted on a two-photon microscope. The parameters for successful two-photon axotomy must be optimized for each microscope. We will demonstrate two-photon axotomy on both a custom built two-photon microscope and a Zeiss 510 confocal/two-photon to provide two examples.

Zebrafish trigeminal sensory neurons can be visualized in a transgenic line expressing GFP driven by a sensory neuron specific promoter 1. We have adapted this zebrafish trigeminal model to directly observe sensory axon regeneration in living zebrafish embryos. Embryos are anesthetized with tricaine and positioned within a drop of agarose as it solidifies. Immobilized embryos are sealed within an imaging chamber filled with phenylthiourea (PTU) Ringers. We have found that embryos can be continuously imaged in these chambers for 12-48 hours. A single confocal image is then captured to determine the desired site of axotomy. The region of interest is located on the two-photon microscope by imaging the sensory axons under low, non-damaging power. After zooming in on the desired site of axotomy, the power is increased and a single scan of that defined region is sufficient to sever the axon. Multiple location time-lapse imaging is then set up on a confocal microscope to directly observe axonal recovery from injury.

Here we describe a method for mounting zebrafish embryos for long-term imaging, two-photon imaging and tissue-damage techniques, and time-lapse confocal imaging.

Zwei-Photonen-Axotomie und Zeitraffer-konfokale Bildgebung in lebenden Zebrafisch-Embryonen

Zebrafish have long been utilized to study the cellular and molecular mechanisms of development by time-lapse imaging of the living transparent embryo.  ...

Generating Chimeric Zebrafish Embryos by Transplantation

One of the most powerful tools used to gain insight into complex developmental processes is the analysis of chimeric embryos. A chimera is defined as an organism that contains cells from more than one animal; mosaics are one type of chimera in which cells from more than one genotype are mixed, usually wild-type and mutant. In the zebrafish, chimeras can be readily made by transplantation of cells from a donor embryo into a host embryo at the appropriate embryonic stage. Labeled donor cells are generated by injection of a lineage marker, such as a fluorescent dye, into the one-cell stage embryo. Labeled donor cells are removed from donor embryos and introduced into unlabeled host embryos using an oil-controlled glass pipette mounted on either a compound or dissecting microscope. Donor cells can in some cases be targeted to a specific region or tissue of the developing blastula or gastrula stage host embryo by choosing a transplantation site in the host embryo based on well-established fate maps.

A step-by-step guide to generating targeted chimeric zebrafish embryos by transplantation at the blastula or gastrula stage.

Generieren Chimäre Zebrafischembryonen durch Transplantation

One of the most powerful tools used to gain insight into complex developmental processes is the analysis of chimeric embryos. A chimera is defined as an ...

Two-Photon-Based Photoactivation in Live Zebrafish Embryos

Photoactivation of target compounds in a living organism has proven a valuable approach to investigate various biological processes such as embryonic development, cellular signaling and adult physiology. In this respect, the use of multi-photon microscopy enables quantitative photoactivation of a given light responsive agent in deep tissues at a single cell resolution. As zebrafish embryos are optically transparent, their development can be monitored in vivo. These traits make the zebrafish a perfect model organism for controlling the activity of a variety of chemical agents and proteins by focused light. Here we describe the use of two-photon microscopy to induce the activation of chemically caged fluorescein, which in turn allows us to follow cell's destiny in live zebrafish embryos. We use embryos expressing a live genetic landmark (GFP) to locate and precisely target any cells of interest. This procedure can be similarly used for precise light induced activation of proteins, hormones, small molecules and other caged compounds.

Multiphoton microscopy allows control of low energy photons with deep optical penetration and reduced phototoxicity. We describe the use of this technology for live cell labeling in zebrafish embryos. This protocol can be readily adapted for photo-induction of various light-responsive molecules.

Zwei-Photonen-Based Photoaktivierung in Live Zebrafischembryonen

Photoactivation of target compounds in a living organism has proven a valuable approach to investigate various biological processes such as embryonic ...

Microinjection of Medaka Embryos for use as a Model Genetic Organism

In this video, we demonstrate the technique of microinjection into one-cell stage medaka embryos. Medaka is a small egg-laying freshwater fish that allows both genetic and embryological analyses and is one of the vertebrate model organisms in which genome-wide phenotype-driven mutant screens were carried out 1, as in zebrafish and the mouse. Divergence of functional overlap of related genes between medaka and zebrafish allows identification of novel phenotypes that are unidentifiable in a single species 2, thus medaka and zebrafish are complementary for genetic dissection of vertebrate genome functions.
To take advantage of medaka fish whose embryos are transparent and develop externally, microinjection is an essential technique to inject cell-tracers for labeling cells, mRNAs or anti-sense oligonucleotides for over-expressing and knocking-down genes of interest, and DNAs for making transgenic lines.

Medaka and zebrafish are complementary for genetic dissection of vertebrate genome functions. This protocol highlights the key points for successful microinjection into medaka embryos, an important technique for embryological and genetic analysis using medaka and zebrafish in a laboratory.

Mikroinjektion von Medaka Embryonen für die Verwendung als Modell Genetic Organism

In this video, we demonstrate the technique of microinjection into one-cell stage medaka embryos. Medaka is a small egg-laying freshwater fish that allows ...

Analysis of mRNA Nuclear Export Kinetics in Mammalian Cells by Microinjection

In eukaryotes, messenger RNA (mRNA) is transcribed in the nucleus and must be exported into the cytoplasm to access the translation machinery. Although the nuclear export of mRNA has been studied extensively in Xenopus oocytes1 and genetically tractable organisms such as yeast2 and the Drosophila derived S2 cell line3, few studies had been conducted in mammalian cells. Furthermore the kinetics of mRNA export in mammalian somatic cells could only be inferred indirectly4,5. In order to measure the nuclear export kinetics of mRNA in mammalian tissue culture cells, we have developed an assay that employs the power of microinjection coupled with fluorescent in situ hybridization (FISH). These assays have been used to demonstrate that in mammalian cells, the majority of mRNAs are exported in a splicing dependent manner6,7, or in manner that requires specific RNA sequences such as the signal sequence coding region (SSCR) 6. In this assay, cells are microinjected with either in vitro synthesized mRNA or plasmid DNA containing the gene of interest. The microinjected cells are incubated for various time points then fixed and the sub-cellular localization of RNA is assessed using FISH. In contrast to transfection, where transcription occurs several hours after the addition of nucleic acids, microinjection of DNA or mRNA allows for rapid expression and allows for the generation of precise kinetic data.

Here we describe an assay that employs the power of microinjection coupled with fluorescent in situ hybridization in order to accurately measure the nuclear export kinetics of mRNA in mammalian somatic cells.

Die Analyse der mRNA Nuclear Export Kinetics in Säugerzellen durch Mikroinjektion

In eukaryotes, messenger RNA (mRNA) is transcribed in the nucleus and must be exported into the cytoplasm to access the translation machinery. Although ...

Imaging Glycans in Zebrafish Embryos by Metabolic Labeling and Bioorthogonal Click Chemistry

Imaging glycans in vivo has recently been enabled using a bioorthogonal chemical reporter strategy by treating cells or organisms with azide- or alkyne-tagged monosaccharides1, 2. The modified monosaccharides, processed by the glycan biosynthetic machinery, are incorporated into cell surface glycoconjugates. The bioorthogonal azide or alkyne tags then allow covalent conjugation with fluorescent probes for visualization, or with affinity probes for enrichment and glycoproteomic analysis. This protocol describes the procedures typically used for noninvasive imaging of fucosylated glycans in zebrafish embryos, including: 1) microinjection of one-cell stage embryos with GDP-5-alkynylfucose (GDP-FucAl), 2) labeling fucosylated glycans in the enveloping layer of zebrafish embryos with azide-conjugated fluorophores via biocompatible Cu(I)-catalyzed azide-alkyne cycloaddition (CuAAC), and 3) imaging by confocal microscopy3. The method described here can be readily extended to visualize other classes of glycans, e.g. glycans containing sialic acid4 and N-acetylgalactosamine5, 6, in developing zebrafish and in other living organisms.

A click-chemistry based method that allows for the rapid, noninvasive, and robust labeling of alkyne-tagged glycans in zebrafish embryos is described. Fucosylated glycans in the enveloping layer of zebrafish embryos in the late gastrulation stage were imaged in this study.

Imaging Glykane in Zebrafisch-Embryonen durch metabolische Markierung und Bioorthogonale Click-Chemie

Imaging glycans in vivo has recently been enabled using a bioorthogonal chemical reporter strategy by treating cells or organisms with azide- or ...

Metabolic Profile Analysis of Zebrafish Embryos

A growing goal in the field of metabolism is to determine the impact of genetics on different aspects of mitochondrial function. Understanding these relationships will help to understand the underlying etiology for a range of diseases linked with mitochondrial dysfunction, such as diabetes and obesity. Recent advances in instrumentation, has enabled the monitoring of distinct parameters of mitochondrial function in cell lines or tissue explants. Here we present a method for a rapid and sensitive analysis of mitochondrial function parameters in vivo during zebrafish embryonic development using the Seahorse bioscience XF 24 extracellular flux analyser. This protocol utilizes the Islet Capture microplates where a single embryo is placed in each well, allowing measurement of bioenergetics, including: (i) basal respiration; (ii) basal mitochondrial respiration (iii) mitochondrial respiration due to ATP turnover; (iv) mitochondrial uncoupled respiration or proton leak and (iv) maximum respiration. Using this approach embryonic zebrafish respiration parameters can be compared between wild type and genetically altered embryos (mutant, gene over-expression or gene knockdown) or those manipulated pharmacologically. It is anticipated that dissemination of this protocol will provide researchers with new tools to analyse the genetic basis of metabolic disorders in vivo in this relevant vertebrate animal model.

Zebrafish represent a powerful vertebrate model that has been under-utilised for metabolic studies. Here we describe a rapid way to measure the in vivo metabolic profile of developing zebrafish that allows the comparison of different mitochondrial function parameters between genetically or pharmacologically manipulated embryos, thereby increasing the applicability of this organism.

Metabolic-Profil-Analyse von Zebrafischembryonen

A growing goal in the field of metabolism is to determine the impact of genetics on different aspects of mitochondrial function. Understanding these ...

Analysis of Oxidative Stress in Zebrafish Embryos

High levels of reactive oxygen species (ROS) may cause a change of cellular redox state towards oxidative stress condition. This situation causes oxidation of molecules (lipid, DNA, protein) and leads to cell death. Oxidative stress also impacts the progression of several pathological conditions such as diabetes, retinopathies, neurodegeneration, and cancer. Thus, it is important to define tools to investigate oxidative stress conditions not only at the level of single cells but also in the context of whole organisms. Here, we consider the zebrafish embryo as a useful in vivo system to perform such studies and present a protocol to measure in vivo oxidative stress. Taking advantage of fluorescent ROS probes and zebrafish transgenic fluorescent lines, we develop two different methods to measure oxidative stress in vivo: i) a &#8220;whole embryo ROS-detection method&#8221; for qualitative measurement of oxidative stress and ii) a &#8220;single-cell&#160;ROS detection method&#8221; for quantitative measurements of oxidative stress. Herein, we demonstrate the efficacy of these procedures by increasing oxidative stress in tissues by oxidant agents and physiological or genetic methods. This protocol is amenable for forward genetic screens and it will help address cause-effect relationships of ROS in animal models of oxidative stress-related pathologies such as neurological disorders and cancer.

Here we report a protocol to measure oxidative stress in living zebrafish embryos. This procedure allows reactive oxygen species (ROS) detection in both whole embryo tissues and single-cell populations. This protocol will accomplish both qualitative and quantitative analyses.