Die Aufstellung von Linsenepithelzellen Explantate hat sich von Methoden im Labor von Dr. John McAvoy 9 entstanden angepasst. Diese Arbeit wird von der National Eye Institute, Intramural Research Program Z01-EY000238-22 finanziert

Teil 1: Entfernen von Objektiven Materialien und Reagenzien: <ol><li> Micro-Präparierscheren, gekrümmte, stumpfe Spitzen, (wie as.RS-5983, Roboz Surgical Instrument Co., Inc., Gaithersburg, MD), Mikro-Sezieren Pinzette, gebogene Spitze (wie Roboz # RS5137). </li><li> Suspensionsmedium: Medium 199 mit 0,1% Rinderserumalbumin, 100 Einheiten / ml Penicillin, 100μg/ml Streptomycin, 2,5 ug / ml Amphotericin B. Die Reagenzien sind von Invitrogen, Carlsbad, CA zur Verfügung. </li></ol> Vorgehensweise: <ol><li> Euthanize neugeborenen Ratten (Alter 2-4 Tage) in Übereinstimmung mit den Richtlinien von den National Institutes of Health, Bethesda, MD zur Verfügung gestellt. </li><li> Entfernen Sie die Augenlider mit chirurgischer Schere. Drücken Sie vorsichtig mit gebogenen Pinzette auf den gegenüberliegenden Seiten der Augenhöhle auf das Auge zu wölben nach außen gerichtete Kraft. Machen Sie einen kleinen Schnitt an der hinteren Seite des Auges mit der Schere. Durch Drücken mit der Pinzette an der Seite des Auges gegenüber dem Schnitt kann das Objektiv und eine kleine Menge der angeschlossenen Glaskörper dann durch den Bruch erzwungen werden, so dass das Objektiv mit gebogenen Pinzette abgeholt werden. Es sollte darauf geachtet werden, dass die Linsenkapsel zu brechen. </li><li> Verwenden Sie die gebogene Pinzette, um die Linsen zu einem 60mm Kunststoff Gewebekultur Schale mit 5 ml warme, sterile Suspension Medium zu übertragen. </li></ol> Teil 2: Mikrodissektion von Explantaten Materialien und Reagenzien: <ol><li> Micro Dissecting Pinzette, 0,1 mm Spitzen, (wie Roboz RS-4976). Wir verwenden Dumostar Legierung wegen der Flexibilität der Spitze, aber auch andere Stahllegierungen sind auch akzeptabel. Pinzetten mit Spitzen dünner als 0,1 mm sind nicht empfehlenswert, da sie zu brechen oder während dieses Vorgangs Kurve neigen. </li><li> Suspensionsmedium (siehe Teil 1) </li><li> Unsupplementierte Ham &#39;s F12 Medium oder Medium 199 (Invitrogen, Carlsburg, CA) </li></ol> Vorgehensweise: <ol><li> Die folgenden Schritte sollten in einem sauberen, zugfreien Umgebung mit sterilen Sezieren Werkzeuge und sterile Medium durchgeführt werden. </li><li> Mit einem Stereo-Binokular, reinigen Sie die Linsen eventuell anhaftende Gewebe mit der 0,1 mm Spitze Pinzette und übertragen Sie sie auf eine zweite 60mm Kulturschale mit 5 ml sterile Suspensionsmedium (dieser Schritt hilft, zur Verringerung der Kontaminierung). Mit der Pinzette, übertragen Sie die gewünschte Anzahl von Linsen zu einer 35-mm Kulturschale mit 5 ml sterile, unsupplementierte Medium. (Wir verwenden oft Ham &#39;s F12 (Invitrogen) für diesen Schritt, weil die untere Farbstoffkonzentration macht Dissektion leichter, jedoch ist Medium 199 auch akzeptabel Keine Antibiotika oder andere Zusätze in diesem Schritt benötigt werden..) Bis zu 12 Explantate gemacht werden können in der Mitte eines Tellers dieser Größe. Allerdings sollte eine 35 mm-Schale verwendet, auch wenn weniger Explantate gemacht werden, da die Zerlegung-Werkzeuge können nicht einfach in eine kleinere Schüssel manipuliert werden sollen. Übertragen Sie die Schale mit den restlichen Linsen zu einer Gewebekultur-Inkubator bei 37 ° C, bis sie benötigt werden. </li><li> Identifizieren der hinteren Seite der Linse. Es gibt viele Wege, dies zu erkennen: 1) Die hintere ist runder als die vorderen, die leicht abgeflacht ist, 2) neugeborenen Ratte Linsen bilden kalte Grauen Star, wie sie auf Raumtemperatur abkühlen während der Präparation. Wenn die kalte Grauen Star hat nicht ganz die Linse gefüllt ist, wird die hintere Seite die Seite aus dem opaken Bereich am weitesten. Wenn Sie die Deckkraft hat die Linse gefüllt, Erwärmung der Schüssel auf 37 ° C für ein paar Minuten wird es umgekehrt. Die hintere Seite kann als die Katarakt-Reformen beim Abkühlen identifiziert werden. 3) Spuren der Tunica vasculosa lentis kann sichtbar auf der hinteren Seite. 4) Die hintere Naht sichtbar sein an der hinteren Seite. Die Ermittlung der hinteren Seite korrekt ist wichtig, da hier die Kapsel geöffnet werden. Eröffnung der Linse auf der Vorderseite reißt das Epithel. </li><li> Sobald der hinteren Seite identifiziert worden ist, schalten Sie ihn nach oben und greifen die Linse in der linken Pinzette (für einen Rechtshänder Arbeiter). Dann klemmen Sie das hintere Kapsel mit der rechten Pinzette, eine kleine Falte zu erzeugen. </li><li> Halten Sie die hintere Kapsel mit der rechten Pinzette fassen die Falte der Kapsel mit der linken Pinzette und ziehen Sie die beiden Pinzetten in entgegengesetzte Richtungen, um einen kleinen Riss in der Kapsel zu machen. </li><li> Fassen Sie den Rand des Zurückziehen Kapsel mit der Pinzette, ziehen Sie es nach unten, zuerst auf der einen Seite, dann auf der anderen, Einpressen in den Kunststoff der Schale mit der Pinzette. Wiederholen Sie dies einige Male, bewegt rund um den Äquator der Linse, bis die Kapsel ist fest mit der Platte an vielen Stellen angebracht. Halten Sie die Kapsel in Ort mit der linken Pinzette, schaukeln die Fasermasse mit der rechten Pinzette die Bindung zwischen der Faser und Epithelzellen an der Linsenäquator brechen. Dann drücken Sie die Fasermasse entfernt, rollt ihn aus der Kapsel / Epithel, das an der Unterseite der bleibtGericht. Setzen Sie diesen Vorgang mit allen Objektiven in die Schüssel. Entfernen und Entsorgen der Fasermassen (oder speichern Sie sie als eine Quelle der Linsenproteinen für weitere Untersuchungen eingefroren). </li></ol> Teil 3: Mikrodissektion und Kultur von zentraler Explantate Materialien und Reagenzien: <ol><li> Sterile Einweg-Skalpell Nr. 15 Klinge, (Cincinnati Surgical Co. Cincinnati, OH) </li><li> Sterile Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung mit Calcium und Magnesium (Invitrogen, Carlsbad, CA) </li><li> Kulturmedium: Suspension Medium mit 100ng/ml FGF-2 (Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO). </li></ol> Vorgehensweise: <ol><li> Mit einem sterilen Skalpell, wegschneiden der peripheren Epithel (PE), die Zellen enthält in den frühen Stadien der Differenzierung (Abbildung 1A), so dass ein zentraler Platz ca. 2,0 mm auf einer Seite, bestehend aus zentralen Epithelzellen nur (CE) (Abbildung 1B). </li><li> Übertragen Sie die Schale mit dem zentralen Explantate eine Biosicherheitswerkbank. 3 x waschen mit sterilem PBS mit Calcium und Magnesium und einmal mit 1 ml frisch, äquilibriert (37 ° C, 5% CO 2) Suspensionsmedium. Diese wäscht erheblich reduzieren die Wahrscheinlichkeit einer Kontamination. </li><li> Add 2 ml Kulturmedium zu einer Differenzierung 1 zu induzieren, und legen die Explantate in einem befeuchteten, Gewebekultur-Inkubator bei 37 ° C, 5% CO 2. Kultur Perioden kann so kurz wie ein paar Stunden oder zu verlängern, solange zwei vor drei Wochen, je nach Parameter untersucht. Medium sollte alle zwei vor drei Tagen sein. </li></ol> Teil 4: Die Ernte der Explantate für die Analyse von Ereignissen mit der Differenzierung verbunden 1. Harvesting Explantate für die Analyse von Protein-oder RNA Materialien: <ol><li> Microdissecting Pinzette </li><li> SDS-Lysepuffer oder RNA-später </li></ol> Vorgehensweise: <ol><li> Am Ende der Inkubationszeit, entfernen Sie das Kulturmedium. </li><li> Mit dem Stereo-Binokular, sanft lockern die Kanten der einzelnen Explantation. </li><li> Heben Sie jedes Explantat mit der Pinzette und überträgt es auf ein Rohr mit etwa 100 &amp;mgr; SDS Lysepuffer (für Protein-Analyse) oder RNA-später (für RNA-Analyse). Man schüttelt die Spitze der Pinzette in die Lösung, um sicherzustellen, dass die Explantation nicht die Pinzetten-Stick. </li></ol> 2. Harvesting Explantate für Immunfluoreszenz Materialien und Reagenzien: <ol><li> Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung mit Calcium und Magnesium (Invitrogen, Carlsbad, CA) </li><li> Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung (ohne Calcium und Magnesium) (Invitrogen, Carlsbad, CA) </li><li> 4% Paraformaldehyd (Boston Bioproducts, Worcester, MA) </li><li> Microdissecting Pinzette </li><li> Hydrophobe Markierstift </li><li> Glasobjektträger </li><li> 0,25% Triton X-100 in Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung. </li></ol> Vorgehensweise: <ol><li> Spülen Explantate kurz in PBS mit Calcium und Magnesium. </li><li> Fix Gewebe durch Zugabe von 4% Paraformaldehyd für 30 Minuten bei Raumtemperatur. </li><li> Entfernen Sie das Fixativ und ersetzen mit Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung. Feste Explantate werden etwas steif, so dass sie aufgehoben und übertragen werden Glasträger für Immunfärbung. </li><li> Legen Sie einen kleinen Tropfen PBS (ohne Calcium und Magnesium) auf der Folie in die richtige Position des Gewebes und verhindern, Eisstockschießen. Mit microdissecting Pinzette, heben Sie die Explantation und fügen Sie ihn in die Tropfen auf dem Objektträger. Ohne Berührung der Explantation, entfernen Sie vorsichtig die Flüssigkeit mit einem Papiertuch Docht auf dem Explantat auf dem Glas flach und lassen das Gewebe trocknen an der Luft bei Raumtemperatur für 3 bis 5 Minuten. </li></ol><img src="/files/ftp_upload/1519/fig1.jpg" alt="Abbildung 1" /> Abbildung 1 A. Die periphere Epithel drückt Differenzierungs-spezifischen Proteinen. Das Explantat gezeigt wurde für N-Cadherin unmittelbar nach Mikrodissektion immungefärbt. Expression ist in einem Band von Zellen im peripheren Epithel zu sehen, was darauf hinweist, dass die Zellen in dieser Region haben damit begonnen, zu unterscheiden. B. Die periphere Epithel weg getrimmt werden kann, um Zellen zu entfernen, die zum Ausdruck N-Cadherin und andere Differenzierungs-spezifischen Proteinen. Der rote Ring steht für die Lage von Zellen, die zum Ausdruck N-Cadherin, während das kleine Quadrat in grau skizzierte die Quadranten des Epithels in Panel 1A gezeigt ist. Die periphere Epithel kann durch vier Skalpell Schnitte entfernt werden, wobei ein zentraler Platz, dass nur Zellen, die noch nicht begonnen haben, zu unterscheiden, enthält.

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	<li>McAvoy, J. W., Chamberlain, C. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fibroblast+growth+factor+(FGF)+induces+different+responses+in+lens+epithelial+cells+depending+on+its+concentration.">Fibroblast growth factor (FGF) induces different responses in lens epithelial cells depending on its concentration.</a> Development. 107 (2), 221-228 (1989).</li><li>Campbell, M. T., McAvoy, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Onset+of+fibre+differentiation+in+cultured+rat+lens+epithelium+under+the+influence+of+neural+retina-conditioned+medium.">Onset of fibre differentiation in cultured rat lens epithelium under the influence of neural retina-conditioned medium.</a> Exp Eye Res. 39 (1), 83-94 (1984).</li><li>Lovicu, F. J., McAvoy, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+analysis+of+lens+epithelial+explants+induced+to+differentiate+into+fibres+by+fibroblast+growth+factor+(FGF).">Structural analysis of lens epithelial explants induced to differentiate into fibres by fibroblast growth factor (FGF).</a> Exp Eye Res. 49 (3), 479-494 (1989).</li><li>Golestaneh, N., Fan, J., Fariss, R. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lens+major+intrinsic+protein+(MIP)/aquaporin+0+expression+in+rat+lens+epithelia+explants+requires+fibroblast+growth+factor-induced+ERK+and+JNK+signaling.">Lens major intrinsic protein (MIP)/aquaporin 0 expression in rat lens epithelia explants requires fibroblast growth factor-induced ERK and JNK signaling.</a> J Biol Chem. 279 (30), 31813-31822 (2004).</li><li>Saravanamuthu, S. S., Gao, C. Y., Zelenka, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Notch+signaling+is+required+for+lateral+induction+of+Jagged1+during+FGF-induced+lens+fiber+differentiation.">Notch signaling is required for lateral induction of Jagged1 during FGF-induced lens fiber differentiation.</a> Dev Biol. 332 (1), 166-176 (2009).</li><li>Lovicu, F. J., McAvoy, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FGF-induced+lens+cell+proliferation+and+differentiation+is+dependent+on+MAPK+(ERK1/2)+signalling.">FGF-induced lens cell proliferation and differentiation is dependent on MAPK (ERK1/2) signalling.</a> Development. 128 (24), 5075-5084 (2001).</li><li>Dirks, R. P., Kraft, H. J., Van Genesen, S. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+cooperation+between+two+silencers+creates+an+enhancer+element+that+controls+both+the+lens-preferred+and+the+differentiation+stage-specific+expression+of+the+rat+beta+B2-crystallin+gene.">The cooperation between two silencers creates an enhancer element that controls both the lens-preferred and the differentiation stage-specific expression of the rat beta B2-crystallin gene.</a> Eur J Biochem. 239 (1), 23-32 (1996).</li><li>Yang, Y., Stopka, T., Golestaneh, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+alphaA-crystallin+via+Pax6,+c-Maf,+CREB+and+a+broad+domain+of+lens-specific+chromatin.">Regulation of alphaA-crystallin via Pax6, c-Maf, CREB and a broad domain of lens-specific chromatin.</a> The EMBO journal. 25 (10), 2107-2118 (2006).</li><li>McAvoy, J. W., T, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural+retinas+promote+cell+division+and+fibre+differentiation+in+lens+epithelial+explants.">Neural retinas promote cell division and fibre differentiation in lens epithelial explants.</a> Curr Eye Res. 3 (6), 827-834 (1984).</li></ol>

Die Ratte Objektiv Explantation System wurde erfolgreich durch eine Reihe von Labors zur terminalen Differenzierung der Linse Epithelzellen zu Linsenfasern 21,3,4,5 Studie verwendet. Wenn an FGF-2 bei 100ng/ml ausgesetzt die Explantate werden beginnen, Veränderungen in Signalisierung innerhalb weniger Minuten 6 zeigen, mit den Veränderungen in der Morphologie und Genexpression erscheinen nacheinander über mehrere Tage 3,4,5. Die Kulturen bleiben für 2-3 Wochen lebensfähig, wenn darauf geachtet wird, um eine Kontamination zu verhindern. Die zentrale Explantate in diesem Protokoll beschriebenen sind besonders nützlich für die Untersuchung der Abfolge der Ereignisse mit der Differenzierung verbunden, da sie wenige oder gar keine Zellen, die Differenzierung Marker vor FGF-2 Express 1,5 hinzugefügt wird enthalten. Die Zellen werden dann synchron zu differenzieren, wie eine Kohorte, die es ermöglicht, den zeitlichen Verlauf der Signalisierungs-und Transkriptions-Veranstaltungen mit der Differenzierung verbundene folgen. Die Kultivierung Explantate für unterschiedliche Zeitspannen somit genaue zeitliche Informationen über die Reihenfolge Ereignisse. Spezifische Inhibitoren kann zum Kulturmedium zugegeben werden, um relevante Signalwege zu identifizieren. Explantate verwendet werden, um die Proteinexpression durch SDS-Gelelektrophorese und Immunoblot analysieren oder Expression spezifischer mRNAs mittels RT-PCR analysiert werden. Protein liefert Bereich von 20-50 g / Explantation und RNA-Ausbeute ist etwa 200 bis 600 ng / Explantation, abhängig von der Länge der Kulturzeit. Wir in der Regel feststellen, dass 5-6 Explantate pro Gericht wird ausreichend Protein oder RNA für mehrere Untersuchungen liefern. RNA aus Explantaten kann auch verwendet werden, um cDNA für die Beurteilung der Genexpression durch Microarray-Analyse, die neue Gene, die entscheidend für die Differenzierung kann identifizieren können vorbereitet werden. Explantate können auch transfiziert werden. Obwohl Transfektionseffizienz generell gering ist, genügt es für die Bestimmung von Reportergene 4; 7; 8. Immunfluoreszenzmikroskopie der Explantate bietet eine sinnvolle Ergänzung zu biochemischen Methoden durch die Bestimmung der subzellulären Lokalisation der Proteine ​​von Interesse. Somit stellt die Vorbereitung und die Kultur der Ratte Objektiv Explantate ein leistungsfähiges System für die Untersuchung Terminal Linse Differenzierung bei Säugetieren, die in vivo-Techniken, wie zB Erzeugung von transgenen und knock-out Mäuse ergänzen können.

preparation and culture of rat lens epithelial explants for studying terminal differentiation

Die vordere Fläche der Augenlinse wird durch eine Monolage von Epithelzellen, die in einer ringförmigen Zone zugrunde liegenden Ziliarkörper vermehren abgedeckt. Nach Division, diese Zellen nach hinten wandern, wo FGF diffundieren aus der Retina induziert sie in eine hintere Reihe von länglichen Linse Faserzellen, die den Großteil der Linse komponieren zu unterscheiden. Die Differenzierung der Linsen-Epithel-Zellen in Linsenfasern kann in vitro durch Kultivierung von Explantaten der zentrale Bereich des vorderen Epithels in Gegenwart von FGF-2 induziert werden. Explantate aus Linsen neugeborenen Ratten durch das Entfernen der Linse aus dem Auge und Greifen der Linsenkapsel an der hinteren Seite mit Sezieren einer Pinzette vorbereitet. Die hintere Kapsel wird dann vorsichtig aufgerissen und ab in die Kunststoff-Unterseite eines Gewebes Kulturschale gedrückt. Die peripheren Regionen der Explantation sind mit einem Skalpell entfernt und der zentrale Bereich wird dann in Anwesenheit von 100ng/ml FGF-2, solange 2-3 Wochen kultiviert, abhängig von der zu untersuchenden Parameter. Da Epithelzellen in kultivierten Explantate in annähernd synchron zu differenzieren über einen Zeitraum von Tagen bis Wochen kann der zeitliche Verlauf der Signalisierung und die Genexpression anhand molekulare, biochemische und pharmakologische Techniken. Immunfluoreszenz-Mikroskopie ist eine leistungsstarke Ergänzung zu diesen Methoden, wie sie die subzelluläre Lokalisierung von Proteinen von Interesse zeigt, und können die physiologischen Folgen der experimentellen Manipulationen der Signalwege zu offenbaren.

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Preparation and Culture of Rat Lens Epithelial Explants for Studying Terminal Differentiation

Explantate der zentralen Region von Ratten Objektiv Epithelien synchron zu unterscheiden, wenn in Gegenwart von FGF-2 kultiviert. Immunfluoreszenzmikroskopie solcher Kulturen stellt neue Informationen über Genexpression und Signaltransduktion mit der terminalen Differenzierung verbunden.

Vorbereitung und Kultur der Rat Linsenepithelzellen Explantate für ein Studium der terminalen Differenzierung

The anterior surface of the ocular lens is covered by a monolayer of epithelial cells, which proliferate in an annular zone underlying the ciliary body.  ...

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Research

JoVE Journal

Biology

12.6K Aufrufe.  National Eye Institute (NEI), National Institutes of Health (NIH). Explantate der zentralen Region von Ratten Objektiv Epithelien synchron zu unterscheiden, wenn in Gegenwart von FGF-2 kultiviert. Immunfluoreszenzmikroskopie solcher Kulturen stellt neue Informationen über Genexpression und Signaltransduktion mit der terminalen Differenzierung verbunden.

Serie: Preparation and Culture of Rat Lens Epithelial Explants for Studying Terminal Differentiation

Organotypic Slice Culture of E18 Rat Brains

Organotypic slice cultures from embryonic rodent brains are widely used to study brain development. While there are often advantages to an in-vivo system, organotypic slice cultures allow one to perform a number of manipulations that are not presently feasible in-vivo. To date, organtotypic embryonic brain slice cultures have been used to follow individual cells using time-lapse microscopy, manipulate the expression of genes in the ganglionic emanances (a region that is hard to target by in-utero electroporation), as well as for pharmacological studies. In this video protocol we demonstrate how to make organotypic slice cultures from rat embryonic day 18 embryos. The protocol involves dissecting the embryos, embedding them on ice in low melt agarose, slicing the embedded brains on the vibratome, and finally plating the slices onto filters in culture dishes. This protocol is also applicable in its present form to making organotypic slice cultures from different embryonic ages for both rats and mice. 

Organotypischen Kultur der E18 Gehirn von Ratten

Organotypic slice cultures from embryonic rodent brains are widely used to study brain development. While there are often advantages to an in-vivo system, ...

Forschung

Biologie

Primary Human Bronchial Epithelial Cells Grown from Explants

Human bronchial epithelial cells are needed for cell models of disease and to investigate the effect of excipients and pharmacologic agents on the function and structure of human epithelial cells. Here we describe in detail the method of growing bronchial epithelial cells from bronchial airway tissue that is harvested by the surgeon at the times of lung surgery (e.g. lung cancer or lung volume reduction surgery). With ethics approval and informed consent, the surgeon takes what is needed for pathology and provides us with a bronchial portion that is remote from the diseased areas. The tissue is then used as a source of explants that can be used for growing primary bronchial epithelial cells in culture. Bronchial segments about 0.5-1cm long and &le;1cm in diameter are rinsed with cold EBSS and excess parenchymal tissue is removed. Segments are cut open and minced into 2-3mm3 pieces of tissue. The pieces are used as a source of primary cells. After coating 100mm culture plates for 1-2 hr with a combination of collagen (30 &mu;g/ml), fibronectin (10 &mu;g/ml), and BSA (10 &mu;g/ml), the plates are scratched in 4-5 areas and tissue pieces are placed in the scratched areas, then culture medium (DMEM/Ham F-12 with additives) suitable for epithelial cell growth is added and plates are placed in an incubator at 37&deg;C in 5% CO2 humidified air. The culture medium is changed every 3-4 days. The epithelial cells grow from the pieces forming about 1.5 cm diameter rings in 3-4 weeks. Explants can be re-used up to 6 times by moving them into new pre-coated plates. Cells are lifted using trypsin/EDTA, pooled, counted, and re-plated in T75 Cell Bind flasks to increase their numbers. T75 flasks seeded with 2-3 million cells grow to 80% confluence in 4 weeks. Expanded primary human epithelial cells can be cultured and allowed to differentiate on air-liquid interface. Methods described here provide an abundant source of human bronchial epithelial cells from freshly isolated tissues and allow for studying these cells as models of disease and for pharmacology and toxicology screening.

Here we describe a detailed method for growing primary human bronchial epithelial cells from explants of human bronchial airway tissue including differentiated growth on an air-liquid interface. This method provides an abundant source of primary cells for investigating the role of the airway epithelium in human lung health and disease.

Primären humanen bronchialen Epithelzellen aus Explantaten Grown

Human bronchial epithelial cells are needed for cell models of disease and to investigate the effect of excipients and pharmacologic agents on the ...

A System for Culturing Iris Pigment Epithelial Cells to Study Lens Regeneration in Newt

Salamanders like newt and axolotl possess the ability to regenerate many of its lost body parts such as limbs, the tail with spinal cord, eye, brain, heart, the jaw 1. Specifically, newts are unique for its lens regeneration capability. Upon lens removal, IPE cells of the dorsal iris transdifferentiate to lens cells and eventually form a new lens in about a month 2,3. This property of regeneration is never exhibited by the ventral iris cells. The regeneration potential of the iris cells can be studied by making transplants of the in vitro cultured IPE cells. For the culture, the dorsal and ventral iris cells are first isolated from the eye and cultured separately for a time period of 2 weeks (Figure 1). These cultured cells are reaggregated and implanted back to the newt eye. Past studies have shown that the dorsal reaggregate maintains its lens forming capacity whereas the ventral aggregate does not form a lens, recapitulating, thus the in vivo process (Figure 2) 4,5. This system of determining regeneration potential of dorsal and ventral iris cells is very useful in studying the role of genes and proteins involved in lens regeneration.

In newt, the lens regenerates always from the dorsal iris by transdifferentiation of the iris pigmented epithelial cells (IPEs). Here we describe a procedure to culture dorsal and ventral newt IPE cells and their implantation to the newt eye. The implanted cells are then studied by tissue sectioning and immunohistochemistry.

Ein System zur Kultivierung Iris Pigmentepithelzellen nach Lens Regeneration in Newt Study

Salamanders like newt and axolotl possess the ability to regenerate many of its lost body parts such as limbs, the tail with spinal cord, eye, brain, ...

A Novel Method for the Culture and Polarized Stimulation of Human Intestinal Mucosa Explants

Few models currently exist to realistically simulate the complex human intestine's micro-environment, where a variety of interactions take place. Proper homeostasis directly depends on these interactions, as they shape an entire immunological response inducing tolerance against food antigens while at the same time mounting effective immune responses against pathogenic microbes accidentally ingested with food.
Intestinal homeostasis is preserved also through various complex interactions between the microbiota (including food-associated beneficial bacterial strains) and the host, that regulate the attachment/degradation of mucus, the production of antimicrobial peptides by the epithelial barrier, and the "education" of epithelial cells' that controls the tolerogenic or immunogenic phenotype of unique, gut-resident lymphoid cells' populations. These interactions have been so far very difficult to reproduce with in vitro assays using either cultured cell lines or peripheral blood mononuclear cells. In addition, mouse models differ substantially in components of the intestinal mucosa (mucus layer organization, commensal bacteria community) with respect to the human gut. Thus, studies of a variety of treatments to be brought in the clinics for important stress-related or pathological conditions such as irritable bowel syndrome, inflammatory bowel disease or colorectal cancer have been difficult to carry out.
To address these issues, we developed a novel system that enables us to stimulate explants of human intestinal mucosa that retain their in situ conditioning by the host microbiota and immune response, in a polarized fashion. Polarized apical stimulation is of great importance for the outcome of the elicited immune response. It has been repeatedly shown that the same stimuli can produce completely different responses when they bypass the apical face of the intestinal epithelium, stimulating epithelial cells basolaterally or coming into direct contact with lamina propria components, switching the phenotype from tolerogenic to immunogenic and causing unnecessary and excessive inflammation in the area.
We achieved polarized stimulation by gluing a cave cylinder which delimited the area of stimulation on the apical face of the mucosa as will be described in the protocol. We used this model to examine, among others, differential effects of three different Lactobacilli strains. We show that this model system is very powerful to assess the immunomodulatory properties of probiotics in healthy and disease conditions.

We introduce a novel method for the maintenance of human intestinal mucosa in culture and monitoring of the response to various types of stimuli over at least 24 hrs. With our method, the polarity of the tissue is maintained, allowing for a physiological stimulation via the apical route.

Eine neue Methode für die Kultur und polarisierte Stimulation der menschlichen Darmschleimhaut Explantate

Few models currently exist to realistically simulate the complex human intestine's micro-environment, where a variety of interactions take place. Proper ...

Preparation of Rat Serum Suitable for Mammalian Whole Embryo Culture

Mammalian whole embryo culture (WEC) is a widely used technique for examining pharmacological toxicity in developing mouse and rat embryos and for investigating the mechanisms of developmental processes. Immediately centrifuged (IC) rat serum is commonly used for WEC and is essential for the growth and development of cultured mouse and rat embryos ex vivo. For the culture of midgestation embryos (i.e., E8.0-12.5 for the mouse, and E10.0-14.5 for the rat), 100% rat serum is the best media for supporting the growth of the embryo ex vivo. To prepare rat serum suitable for WEC, the collected blood should be centrifuged immediately to separate the blood cells from the plasma fraction. After centrifugation, the fibrin clot forms in the upper layer; this clot should be squeezed gently using a pair of sterile forceps and subsequently centrifuged to completely separate the blood cells from the serum. In this video article, we demonstrate our standard protocol for the preparation of optimal IC rat serum, including blood collection from the abdominal aorta of male rats and extraction of the serum by centrifugation.

Mammalian whole embryo culture (WEC) is widely used in teratology and developmental biology. Immediately centrifuged rat serum is commonly provided as a medium for both mouse and rat WEC. In this video, we demonstrate our standard protocol for the preparation of high-quality rat serum suitable for mammalian WEC.

Herstellung von Ratten Serum Geeignet für Säugetier Whole Embryo Culture

Mammalian whole embryo culture (WEC) is a widely used technique for examining pharmacological toxicity in developing mouse and rat embryos and for ...

Lens-free Video Microscopy for the Dynamic and Quantitative Analysis of Adherent Cell Culture

Here, we demonstrate that lens-free video microscopy enables us to simultaneously capture the kinetics of thousands of cells directly inside the incubator and that it is possible to monitor and quantify single cells along several cell cycles. We describe the full protocol used to monitor and quantify a HeLa cell culture for 2.7 days. First, cell culture acquisition is performed with a lens-free video microscope, and then the data is analyzed following a four-step process: multi-wavelength holographic reconstruction, cell-tracking, cell segmentation and cell division detection algorithms. As a result, we show that it is possible to gather a dataset featuring more than 10,000 cell cycle tracks and more than 2 x 106 cell morphological measurements.

Lens-free video microscopy enables us to monitor cell cultures directly inside the incubator. Here we describe the full protocol used to acquire and analyze a 2.7 day long acquisition of cultured HeLa cells, leading to a dataset of 2.2 x 106 measurements of individual cell morphology and 10584 cell cycle tracks.

Objektiv-kostenlose Videomikroskopie für die Dynamik und Quantitative Analyse der adhärente Zellkultur

Here, we demonstrate that lens-free video microscopy enables us to simultaneously capture the kinetics of thousands of cells directly inside the incubator ...

Isolation, Purification, and Differentiation of Osteoclast Precursors from Rat Bone Marrow

Osteoclasts are large, multinucleated, and bone-resorbing cells of the monocyte-macrophage lineage that are formed by the fusion of monocytes or macrophage precursors. Excessive bone resorption is one the most significant cellular mechanisms leading to osteolytic diseases, including osteoporosis, periodontitis, and periprosthetic osteolysis. The main physiological function of osteoclasts is to absorb both the hydroxyapatite mineral component and the organic matrix of bone, generating the characteristic resorption appearance on the surface of bones. There are relatively few osteoclasts compared to other cells in the body, especially in adult bones. Recent studies have focused on how to obtain more mature osteoclasts in less time, which has always been a problem. Several improvements in the isolation and culture techniques have developed in laboratories in order to obtain more mature osteoclasts. Here, we introduce a method that isolates bone marrow in less time and with less effort compared to the traditional procedure, using a special and simple device. With the use of density gradient centrifugation, we obtain large amounts of fully differentiated osteoclasts from rat bone marrow, which are identified by classical methods.

Osteoclasts are tissue-specific macrophage polykaryons derived from the monocyte-macrophage lineage of hematopoietic stem cells. This protocol describes how to isolate bone marrow cells so that large quantities of osteoclasts are obtained while reducing the risk of accidents found in traditional methods.

Isolierung, Reinigung und Differenzierung von Osteoclast-Laufläufern aus der Rattenmarkierung

Osteoclasts are large, multinucleated, and bone-resorbing cells of the monocyte-macrophage lineage that are formed by the fusion of monocytes or ...

Isolation and Enrichment of Human Lung Epithelial Progenitor Cells for Organoid Culture

Epithelial organoid models serve as valuable tools to study the basic biology of an organ system and for disease modeling. When grown as organoids, epithelial progenitor cells can self-renew and generate differentiating progeny that exhibit cellular functions similar to those of their in vivo counterparts. Herein we describe a step-by-step protocol to isolate region-specific progenitors from human lung and generate 3D organoid cultures as an experimental and validation tool. We define proximal and distal regions of the lung with the goal of isolating region-specific progenitor cells. We utilized a combination of enzymatic and mechanical dissociation to isolate total cells from the lung and trachea. Specific progenitor cells were then fractionated from the proximal or distal origin cells using fluorescence associated cell sorting (FACS) based on cell type-specific surface markers, such as NGFR&#160;for sorting basal cells and HTII-280 for sorting alveolar type II cells. Isolated basal or alveolar type II progenitors were used to generate 3D organoid cultures. Both distal and proximal progenitors formed organoids with a colony forming efficiency of 9-13% in distal region and 7-10% in proximal region when plated 5000 cell/well on day 30. Distal organoids maintained HTII-280+ alveolar type II cells in culture whereas proximal organoids differentiated into ciliated and secretory cells by day 30. These 3D organoid cultures can be used as an experimental tool for studying the cell biology of lung epithelium and epithelial mesenchymal interactions, as well as for the development and validation of therapeutic strategies targeting epithelial dysfunction in a disease.

This article provides a detailed methodology for tissue dissociation and cellular fractionation approaches allowing enrichment of viable epithelial cells from proximal and distal regions of the human lung. Herein these approaches are applied for the functional analysis of lung epithelial progenitor cells through the use of 3D organoids culture models.

Isolierung und Anreicherung menschlicher Lungenepithel-Vorläuferzellen für Organoidkulturen

Epithelial organoid models serve as valuable tools to study the basic biology of an organ system and for disease modeling. When grown as organoids, ...

Untersuchung der Proteinexpression während der Entwicklung von Hühnerlinsen

Microinjection of Recombinant RCAS(A) Retrovirus into Embryonic Chicken Lens

Embryonic chicken (Gallus domesticus) is a well-established animal model for the study of lens development and physiology, given its high degree of similarity with the human lens. RCAS(A) is a replication-competent chicken retrovirus that infects dividing cells, which serves as a powerful tool to study the in situ expression and function of wild-type and mutant proteins during lens development by microinjection into the empty lumen of lens vesicle at early developmental stages, restricting its action to surrounding proliferating lens cells. Compared to other approaches, such as transgenic models and ex vivo cultures, the use of an RCAS(A) replication-competent avian retrovirus provides a highly effective, rapid, and customizable system to express exogenous proteins in chick embryos. Specifically, targeted gene transfer can be confined to proliferative lens fiber cells without the need for tissue-specific promoters. In this article, we will briefly overview the steps needed for recombinant retrovirus RCAS(A) preparation, provide a detailed, comprehensive overview of the microinjection procedure, and provide sample results of the technique.

Autor im Rampenlicht: Untersuchung der Linsenentwicklung und -funktion durch Mikroinjektion des RCAS(A)-Retrovirus in embryonaler Hühnerlinse 

This protocol paper describes the methodology of embryonic chicken lens microinjection of an RCAS(A) retrovirus as a tool for studying in situ function and expression of proteins during lens development.

Mikroinjektion von rekombinantem RCAS(A)-Retrovirus in embryonale Hühnerlinse

Embryonic chicken (Gallus domesticus) is a well-established animal model for the study of lens development and physiology, given its high degree of ...