Einführung Organismen müssen ein breites Spektrum von Verhaltensweisen, um bedrohliche Reize und Veränderungen in der Umwelt zu reagieren. Die autonome Reaktion ist auch bei Wirbeltieren wie der Kampf oder Flucht-Reaktion, in denen das sympathische Nervensystem physiologisch bereitet die internen Umwelt (.; Nicholls et al, 2001 Carpenter, 1976) untersucht. Es ist durch physiologische Veränderungen, die ein Organismus kann die Stress-Reaktion zu regulieren und zu verändern Verhalten auf einen bevorstehenden Angriff oder Veränderungen der Umwelt reagieren. Es zeigt sich, dass die Herz-Kreislauf-System ist eng mit der Atmungsorgane so dass das interne Umfeld zu reagieren und Umsetzung einer Reaktion verbunden. Es ist bekannt, dass die autonome Kontrolle der Atemwege und des Herz-Kreislauf-Systeme können die Verfügbarkeit von Sauerstoff und Nährstoffen zu bestimmten Zielgewebe für eine drohende Verhaltensreaktion nötig zu regulieren. Bei Wirbeltieren ist das autonome und physiologische Reaktion so gut entwickelt, es scheint wahrscheinlich, dass komplexe Wirbellose würde ähnlich besitzen ein entwickeltes Response System (Schapker et al, 2002;. Zavarzin, 1941). Obwohl Wirbeltieren und Wirbellosen sehr unterschiedlich sind systematisch, hoch entwickelten wirbellosen Tieren erfordern die schnelle Herz-Kreislauf-und Atemwegserkrankungen Reaktion auf in einem Kampf oder Flucht zu reagieren. Für viele Wirbellose, kann eine sympathische wie physiologische Reaktion quantifiziert werden. Aus dem Jahre 1927, haben viele der ganz frühen Studien bei Wirbellosen durchgeführt worden, und zwar mit Arthropoden im Allgemeinen (Alexandrowicz, 1932; Orlow, 1927; Zavarzin, 1941). Crayfish sind dafür bekannt, eine breite Palette an schnellen Verhaltensweisen sowie die Fähigkeit zu beurteilen und zu reagieren auf Umweltreize aufweisen. Sehr frühe Studien haben eine sympathische wie Reaktion der eine sofortige und schnelle Reaktion der Verteidigung Pose (; Huxley, 1880; Shuranova et al, 2006;. Wiersma, 1961 Bethe, 1897) zur Kenntnis genommen. Die erwachsenen Krebse Herz ist neurogenen seit dem Beat und Rhythmus durch das zentrale Nervensystem (Alexandrowicz, 1932; Yamagishi und Hirose, 1997;. Yamagishi et al, 1997; Wilkens, 1999) gesteuert werden. Routinemäßig liefert die Messung eines Tieres die Herzfrequenz (HR) ein direktes Maß für die Erregbarkeit und die Bereitschaft des inneren Milieus. In Krebse, ist eine Erhöhung der HR bei der Verteidigung Gehabe beachten, wenn sie mit einer wahrgenommenen bedrohlichen Reiz (Listerman et al., 2000) vorgestellt. Diese Art des Nervensystems Resonanz war auch in Langusten (Yazawa und Katsuyama, 2001) gezeigt. Die Beatmung ist auch neuronal mit einer Beatmung central pattern generator (VPG) verantwortlich für die Sauerstoffaufnahme über die Kiemen durch die Pumpwirkung von zwei spezialisierten Anhängsel bezeichnet scaphognathites (Mendelson, 1971) gesteuert. Ein einziger scaphognathite wohnt in jedem branchial Kammer an der vorderen Enden und zieht Wasser in die Kiemen von einer rhythmischen Bewegung (Pasztor, 1968). Die VPG, wie mit dem Herzen, moduliert werden kann durch viele Faktoren. Frühere Arbeiten in der Krabbe, zeigt Cancer magister Herz-und Beatmung Rhythmus durch die zentrale Steuerung durch Befehl Neuronen (Wilkens et al., 1974) können verändert werden. Darüber hinaus ist die Tätigkeit der VPG, die bekanntermaßen mit Veränderungen in der inneren Reaktion und mit sozialen Interaktionen oder Veränderungen der Umwelt in Krebstieren (Burmistrov und Shuranova, 1996 ändern; Cuadras, 1979, 1980; Li et al, 2000;. Listerman et al. , 2000; McMahon und Wilkens, 1983; Schapker et al, 2002;. Shuranova et al, 2002;. Wilkens, 1976). Wie in der Krebse gesehen hat, kann Beatmung Aktivität (VR) je nach den internen Zustand und Veränderungen in der VR kann während unerwartete äußere Reize (Shuranova et al, 1993.; Shuranova et al, 2002.) Aufgezeichnet werden. Aufgrund der Zuverlässigkeit und Durchführbarkeit von HR und VR Maßnahmen, sind die Zukunft Fragen, die gestellt werden endlos. Wie bereits erwähnt, hat die Arbeit getan, um die autonome Reaktion bei sozialen Interaktionen und ökologische Störungen zu untersuchen. Interessanterweise sind viele Bereiche links nach wie Prüfung der autonomen Reaktion während des natürlichen hormonellen Veränderungen und / oder andere physiologische Vorgänge im Organismus erforscht werden. Mögliche zukünftige Richtungen kann auch prüfen, sympathisch-wie Reaktionen während der Paarung und olfaktorischen chemische Rezeption. Am wichtigsten ist, können physiologische Reaktionen besseren Einblick in einen Organismus als Reaktion auf die Umwelt, wenn sie Verhaltensbeobachtungen im Vergleich da die Tiere nicht immer im Verhalten zu reagieren, wenn sie bereiten sich intern stellen. Somit stellt die physiologische Messung eines biologischen Index für die Beurteilung eines Organismus den internen Zustand der allgemeinen Veränderungen in einem Organismus kann zu erklären. Methoden Vor Beginn einer Krebs-Draht, ist die Vorbereitung der Drähte erforderlich. Cut zwei isolierte Edelstahl-Draht (Durchmesser 0,005 Zoll und mit der Beschichtung 0,008 Zoll; AM Systems, Carlsburg, WA) lang genug, um in die Krebse einfügen und ausreichend erreicht eine Impedanz-Detektor (UFI, Modell 2991). Entfernen Isolierung (~ 0,5 mm) durch ein Feuer an den Enden der beiden Drähte, die in dem Panzer eingesetzt werden. Achten Sie darauf, nicht entfernen zu viel Isolierung als blanker Draht auf der Außenseite des Tieres muss neu beschichtet, um einen Kurzschluss-Impedanz-Aufnahmen zu verhindern. Dann mit einer Pinzette biegen Sie die verbrannten Enden der Drähte in einem Winkel von 90 ° für die Platzierung in den Panzer. Achten Sie darauf, dass die eingefügten Teil des Drahtes nicht zu lang ist, da diese Schäden an inneren Organen tun konnte. Für Machbarkeit Einlegen der Drähte in einem Kunststoffrohr (das schützt die Drähte), ist es am besten lose verdrehen die Drähte zusammen. Wenn die Aufnahme Herz-und Lüftungs-Raten, wiederholen Sie die obigen Schritte ein zweites Mal und die beiden Sätze von Drähten kann locker miteinander verflochten vor der Platzierung in den Kunststoffschlauch. Achten Sie darauf, die Drähte für Herz-und Lüftungs-Rate so bezeichnen, um nicht zu verwirren, die Drähte an die Impedanzdetektor legen für die Aufnahme. Es ist am besten, um die Drähte Etikett oder schneiden Sie ein Paar kürzer als die anderen in der Anfang. Um durchführbar und sicher wire die Krebse, ist es am besten, die Klauen und Beine (wobei die Rückseite und eine Seite ausgesetzt) ​​in feuchten Tuch oder Küchenpapier wickeln, um Verletzungen der Person und / oder Krebse (Abbildung 1) zu beseitigen. <img src="/files/ftp_upload/1594/1594fig1.jpg" style="float:left;" alt="Abbildung 1" /> Abbildung 1. Wrapping der chelipeds und Beine der Krebse. Wrapping die Krebse in einem nassen Papiertuch wird Verletzungen der Person und die Krebse zu verhindern. Die Verpackung wird behindert die Fähigkeit des Krebses auf die chelipeds und Beine zu bewegen. Zu Beginn der Verkabelung Prozess, ist es am besten in den Kiemen Kammer beginnen, da Panzer Dicke variiert mit jedem Krebse und überschüssige Kraft kann Schäden an inneren Organen verursacht, also durch Beginn in den Kiemen Kammer wird Überdruck weniger wahrscheinlich, dass die Krebse als töten im Vergleich zu den Brust-Kammer. Das erste Loch wird durch die Verwendung einer feinen Spitze Skalpell und gerade groß genug für einen Draht unter der Kutikula im rostralen Bereich der Kiemen Kammer (.; Schapker et al, 2002 also, prebranchial Kammer Beatmung Rate Monitor) eingefügt hat. Ein großes Loch haben übermäßige Hämolymphe Verlust und sitzt nicht richtig und das wird die Wahrscheinlichkeit der Drähte nicht noch in den dafür vorgesehenen Loch zu erhöhen. Nachdem der Draht in Ort, lassen Sie eine kleine Menge Kleber (Cyanacrylat-Ester) und Beschleuniger (HobbyTown USA, Lexington, KY) auf den Draht. Der Einsatz der schnell trocknende Leim reduziert Umgang mit Stress der Tiere. Achten Sie darauf, nur eine kleine Menge des Beschleunigers auf die Nagelhaut statt, da diese giftig für die Krebse und zum Tod führen. Am besten ist es sofort abwischen überschüssiges Gas aus mit einem Papiertuch. Wiederholen Sie diese Schritte für den zweiten Draht in den Kiemen Kammer. Diese beiden Leitungen sind gelegt, die scaphognathite (Atmungsorgan) span zu einem starken genaue Impedanz messen bei jedem scaphognathite Bewegung (Abbildung 2) zu versichern. Um eine genaue Aufzeichnung, sicher sein, dass der zweite Draht nicht außerhalb der Kiemen Kammer und in der Brust-Kammer platziert. <img src="/files/ftp_upload/1594/1594fig2.jpg" style="float:left;" alt="Abbildung 2" /> Abbildung 2. Platzierung von Draht aus nichtrostendem Stahl in den Kiemen Kammer. Die weißen Punkte auf dem Panzer darstellen Punkte für die Edelstahl-Drähte unter der Oberhaut platziert werden. Die Drähte überspannen die scaphognathite und messen Bewegung durch dynamische Impedanz. Die Schritte für die Verkabelung der Herzfrequenz in der Brust-Kammer ist die gleiche wie oben, nur die Drähte unter dem dorsalen Panzer direkt über dem Herzen und span Herzen in einer rostral-kaudale Anordnung (Abbildung 3) platziert. Diese Platzierung wird eine starke genaue Impedanz messen bei jedem Herzkontraktion (Listerman et al., 2001) zu gewährleisten. <img src="/files/ftp_upload/1594/1594fig3.jpg" style="float:left;" alt="Abbildung 3" /> Abbildung 3. Platzierung von Draht aus nichtrostendem Stahl in der Brust-Kammer. Die weißen Punkte auf dem Panzer darstellen Punkte für die Edelstahl-Drähte unter der Oberhaut platziert werden. Die Drähte span Herzen in einer rostral-kaudale Anordnung. Dies wird für Maßnahmen von Herzkontraktion durch dynamische Impedanz ermöglichen. Nach Platzierung aller vier Drähte abgeschlossen ist, mischen Sie einen Sekundenkleber (Eastman, 5-min Trocknung epoxy) und Mantel die Löcher für jeden Standort sowie die Drähte. Sobald die Leitungen und Bohrungen ausreichend abgedeckt sind, die verbleibenden Epoxy den Kunststoffschlauch auf der Rückseite des Krebses zu halten. Dadurch wird sichergestellt, dass die Drähte nicht aus den Löchern in Zukunft Handhabungen gezogen werden. Da die Epoxid dauert ein paar Minuten, um zu trocknen, zu halten oder Ort die Krebse in einem Behälter ohne Wasser, bis das Epoxidharz nicht mehr klebrig anfühlt. Sobald das Epoxidharz ist trocken, waschen Sie die Krebse im Wasser, um überschüssige Chemikalien zu entfernen und sie wieder in ein wässriges Milieu. Um zu gewährleisten, die Gesundheit der Krebse, ist es am besten, um das Wasser in ca. 1 Stunde ändern, um alle Chemikalien, die nicht zuvor entfernt zu entfernen. Wie aus früheren Ermittler darauf hingewiesen, fanden wir, dass eine längere Behandlung verändert die physiologischen Messungen durch Belastung für eine Zeitdauer von 24 h bis 3 Tage (Wilkens et al, 1985.) Daher, die Tiere sollten 2 bis 3 Tage vor jedem Experiment . So zeichnen EKGs, verbinden Sie das Kabel von der Languste bis zum Impedanz-Detektoren. Die beiden Drähte überspannt das Herz (Maßnahme HR) sich auf einen einzigen Impedanzdetektor angebracht werden und ebenfalls für die beiden Drähte überspannt die scaphognathite (Maßnahme VR). Die Impedanz Detektor misst dynamische Widerstand zwischen den beiden Edelstahl-Drähte. Diese Signale werden durch die Verbindung des Detektors on-line zu einem PowerLab über eine PowerLab/4SP Schnittstelle (AD Instruments) aufgezeichnet. Alle Veranstaltungen werden gemessen und kalibriert mit dem PowerLab Diagramm-Software Version 5.5.6 (AD Instruments, Australien). Um zu beginnen, setzen eine Akquisition bei 4 kHz. Die großen Ausschläge vertreten Herzschlag und Luftwechselrate. Zur Erleichterung beim Zählen jedes HR / VR, eine Glättung Funktion, um die Datenmenge angewendet werden können. Wenn 100 Punkte wurden geglättet (dh gemittelt) die resultierende Spur wird zeigen nur die Herzschläge. Die Herzfrequenzen können durch direkte zählt jeder Schlag über 10-s-Intervallen bestimmt werden und dann zu Schlägen pro Minute (BPM) umgewandelt.

<ol>
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A., Izbrannye, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Ocherki po evol utsionnoj gistologii nervnoj sistemy (Essays on the evolutionary histology of the nervous system). III, (1950).</li></ol>

<table border="1">
<tbody>
<tr>
<td>Material Name</td>
<td>Type</td>
<td>Company</td>
<td>Catalogue Number</td>
</tr>	
<tr>
<td>Scalpel (Stainless steel surgical blades No. 11 for No. 3 handle)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
</tr>
<tr>
<td>Stainless steel wire (diameter 0.005 inches with the coating 0.008 inches; A-M Systems, Carlsburg, WA)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
</tr>
<tr>
<td>Impedance detector (UFI, model 2991)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
</tr>
<tr>
<td>Plastic tubing (Tygon Tubing ID .0812, OD .1492, Cole-Parmer Instrument Company)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
</tr>
<tr>
<td>Fast-drying glue (cyanoacrylate ester, HobbyTown USA, Lexington, KY)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
</tr>
<tr>
<td>Accelerator (HobbyTown USA, Lexington, KY)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
</tr>
<tr>
<td>Adhesive (Eastman, 5-min drying epoxy)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
</tr>
<tr>
<td><a href="http://www.adinstruments.com/products/hardware/corporate/product/ML866/" target="_blank">PowerLab via a PowerLab/4SP interface (AD Instruments)</a>.</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
</tr>
<tr>
<td><a href="http://www.adinstruments.com/products/software/research/LabChart-Software/" target="_blank">PowerLab Chart software version 5.5.6 (AD Instruments, Australia)</a></td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
</tr>
<tr>
<td><a href="http://www.adinstruments.com/products/software/research/LabChart-Software/" target="_blank">Chart software version 3.5.6 (AD Instruments, Australia)</a></td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
</tr>
</tbody>
		</table>

measures of heart and ventilatory rates in freely moving crayfish

Die Angst, Flucht oder Kampf Antwort dient als grundlegende physiologische Grundlage für die Prüfung eines Organismus das Bewusstsein für ihre Umgebung unter einem drohenden Raubtier anzugreifen. Obwohl nicht bekannt ist, ob wirbellose Tiere besitzen ein autonomes Nervensystem identisch mit dem der Wirbeltiere, zeigt Beweise Wirbellosen haben eine sympathische wie Antwort auf die internen Umwelt und bereit den Organismus zu ihrem Verhalten zu handeln, um eine bestimmte Reize regulieren. Darüber hinaus kann diese physiologische Reaktion durchführbar gemessen werden, und es wirkt wie ein biologischer Index für das Tier den internen Zustand. Messungen der physiologischen Reaktion kann direkt an interne und externe Stressoren im Zusammenhang mit Veränderungen im zentralen Nervensystem gesteuert Koordination des Herz-Kreislauf-und Atmungssystem. Genauer gesagt, die Überwachung Herz und Belüftungsraten quantifizierbare Maßnahmen der Stress-Reaktion nicht immer im Verhalten beobachtet. Crayfish sind gute Modellorganismen für Herz-und Beatmungs-Rate-Messungen durch, um die Durchführbarkeit der Aufnahme, sowie die reiche Geschichte der Morphologie des Krebses bekannt ist, stammt aus Huxley im Jahre 1888, und den gut untersuchten typischen Verhaltensweisen.

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Measures of Heart and Ventilatory Rates in Freely Moving Crayfish

Wirbellose zeigen eine autonome sympathische wie Reaktion ähnlich wie bei Wirbeltieren beschrieben. Die Koordination des Herz-Kreislauf-und Beatmungs-Systemen ermöglicht die Messung eines biologischen Index, in dem ein Organismus internen Zustand zu beurteilen.

Maßnahmen der Herz-und Ventilatorische Preise bei frei laufenden Crayfish

The fear, flight or fight response serves as the fundamental physiological basis for examining an organism's awareness of its environment under an ...

measures-of-heart-and-ventilatory-rates-in-freely-moving-crayfish

Research

JoVE Journal

Biology

15.2K Aufrufe.  University of Kentucky. Wirbellose zeigen eine autonome sympathische wie Reaktion ähnlich wie bei Wirbeltieren beschrieben. Die Koordination des Herz-Kreislauf-und Beatmungs-Systemen ermöglicht die Messung eines biologischen Index, in dem ein Organismus internen Zustand zu beurteilen.

Serie: Measures of Heart and Ventilatory Rates in Freely Moving Crayfish

Implantation of Engineered Tissue in the Rat Heart

Rodent surgery is often an important component in assessing the utility of engineered tissues. A wide variety of surgical procedures can be performed in common laboratory rats or mice and these quite frequently serve as an intermediate step between bench-top experiments and large animal testing or human trials. Given that rodents provide an established, cost-effective, and physiologically-relevant model system in which to test novel combinations of scaffolding materials and cells, they are particularly well-suited for cardiovascular tissue engineering studies. Presently, we describe an open-heart surgical procedure to implant engineered tissue containing myogenic progenitor cells in the atrioventricular (AV) groove of a rat heart. These implants are intended to create an electrical conduit between the right atrium and right ventricle with the ultimate goal of providing an alternative treatment to conventional pacemaker implantation in pediatric patients with complete heart block[1]. The engineered tissue is implanted in the AV-groove by means of a thoracotomy. For our purposes, Lewis rats are anesthetized and invasively ventilated to maintain positive airway pressure during the sterile surgical procedure. The approach to the heart is performed by a right thoracotomy through an antero-lateral incision at the 5th intercostal space. The tissue construct is fixed in the AV groove using a single 7-0 Prolene suture and positioned between the right ventricle and atrium at the ventral portion of the heart. The epicardium is partially removed to allow direct contact between the recipient myocardial cells and those contained in the engineered tissue. Following implantation, the chest wall is closed in layers, any pneumothorax is evacuated, and the animal is extubated and treated with analgesic.

Here, we describe a cardiac surgical procedure to implant engineered tissue in the atrioventricular (AV)-groove of an adult Lewis rat.

Die Implantation von Engineered Tissue in der Ratte Herz

Rodent surgery is often an important component in assessing the utility of engineered tissues. A wide variety of surgical procedures can be performed in ...

Forschung

Biologie

Recordings of Neural Circuit Activation in Freely Behaving Animals

The relationship between patterns of neural activity and corresponding behavioral expression is difficult to establish in unrestrained animals. Traditional non-invasive methods require at least partially restrained research subjects, and they only allow identification of large numbers of simultaneously activated neurons. On the other hand, small ensembles of neurons or individual neurons can only be measured using single-cell recordings obtained from largely reduced preparations. Since the expression of natural behavior is limited in restrained and dissected animals, the underlying neural mechanisms that control such behavior are difficult to identify. 
Here, I present a non-invasive physiological technique that allows measuring neural circuit activation in freely behaving animals. Using a pair of wire electrodes inside a water-filled chamber, the bath electrodes record neural and muscular field potentials generated by juvenile crayfish during natural or experimentally evoked escape responses. The primary escape responses of crayfish are mediated by three different types of tail-flips which move the animals away from the point of stimulation. Each type of tail-flip is controlled by its own neural circuit; the two fastest and most powerful escape responses require activation of different sets of large &#8220;command&#8221; neurons. In combination with behavioral observations, the bath electrode recordings allow unambiguous identification of these neurons and the associated neural circuits. Thus activity of neural circuitry underlying naturally occurring behavior can be measured in unrestrained animals and in different behavioral contexts.

Non-invasive measurements of neural activity patterns in freely behaving animals are obtained by combining neurophysiological recordings with high speed videography.

Recordings of Neural Circuits Aktivierung in Frei Behaving Tiere

The relationship between patterns of neural activity and corresponding behavioral expression is difficult to establish in unrestrained animals. ...

Visualizing the Beating Heart in Drosophila

The Drosophila heart has recently emerged as a good model system for examining the genetic, cellular, and molecular mechanisms underlying function in myogenic hearts. A key step in examining heart function in the fly is finding a way to access the heart in a manner that preserves its myogenic function while still allowing the beating heart organ to be observed and recorded. Two different methods for observing and recording the beating heart in both larva and adult Drosophila are described here. Our semi-intact preparation using adult flies allows clear visualization of the abdominal heart without interference from the pigmented cuticle and overlying fat bodies. To record larval heart beats it is necessary to immobilize the larva, which minimizes body wall movements thereby reducing heart movements that are not associated with myocardial contractions. Our methodologies produce stable adult and larval heart preparations that can beat for hours at rates of 1-3 Hz.

Visualizing the Beating Heart in Drosophila

Technique required for visualizing the beating heart in larval and adult Drosophila are presented. Each life stage requires a different methodology.

Visualisierung des schlagenden Herzens in Drosophila</em

The Drosophila heart has recently emerged as a good model system for examining the genetic, cellular, and molecular mechanisms underlying function in ...

Historical View and Physiology Demonstration at the NMJ of the Crayfish Opener Muscle

Here we present some of the key important discoveries made with the opener neuromuscular (NMJ) preparation of crustaceans and illustrate that there is still much to learn from this model preparation. In understanding the history one can appreciate why even today this NMJ still offers a rich playground to address questions regarding pre- and post-synaptic function and plasticity. The viability and ease of access to the terminal for intracellular as well as extracellular electrophysiology and imaging are significant advantages. The mechanisms behind the modulation of vesicular kinetics and fusion within the high- and low-output terminals are begging for investigation. The preparation also offers a testable model system for computational assessments and manipulations to examine key variables in theoretical models of synaptic function, for example calcium dynamics during short-term facilitation. The synaptic complexity of active zone and statistical nature of quantal release is also an open area for future investigation both experimentally and computationally.

The opener muscle of the crayfish leg is presented for its historical importance and experimental versatility in muscle phenotype, synaptic physiology and plasticity.

Historische Ansicht und Physiologie Demonstration am NMJ der Crayfish Opener Muscle

Here we present some of the key important discoveries made with the opener neuromuscular (NMJ) preparation of crustaceans and illustrate that there is ...

Preparation of embryos for Electron Microscopy of the Drosophila embryonic heart tube

The morphogenesis of the Drosophila embryonic heart tube has emerged as a valuable model system for studying cell migration, cell-cell adhesion and cell shape changes during embryonic development. One of the challenges faced in studying this structure is that the lumen of the heart tube, as well as the membrane features that are crucial to heart tube formation, are difficult to visualize in whole mount embryos, due to the small size of the heart tube and intra-lumenal space relative to the embryo. The use of transmission electron microscopy allows for higher magnification of these structures and gives the advantage of examining the embryos in cross section, which easily reveals the size and shape of the lumen. In this video, we detail the process for reliable fixation, embedding, and sectioning of late stage Drosophila embryos in order to visualize the heart tube lumen as well as important cellular structures including cell-cell junctions and the basement membrane.

Preparation of embryos for Electron Microscopy of the Drosophila embryonic heart tube

We describe a process for fixation, embedding, sectioning, and imaging of late stage Drosophila embryos for Trasmission Electron Microscopy of the embryonic heart tube. This technique allows for the visualization of the heart tube lumen as well as the basement membrane, which lines the lumen of the heart.

Vorbereitung der Embryonen für Elektronenmikroskopie der Drosophila Embryonale Herz Rohr

The morphogenesis of the Drosophila  embryonic heart tube has emerged as a valuable model system for studying cell migration, cell-cell adhesion and cell ...

Quantification of &gamma;H2AX Foci in Response to Ionising Radiation

DNA double-strand breaks (DSBs), which are induced by either endogenous metabolic processes or by exogenous sources, are one of the most critical DNA lesions with respect to survival and preservation of genomic integrity. An early response to the induction of DSBs is phosphorylation of the H2A histone variant, H2AX, at the serine-139 residue, in the highly conserved C-terminal SQEY motif, forming &gamma;H2AX1. Following induction of DSBs, H2AX is rapidly phosphorylated by the phosphatidyl-inosito 3-kinase (PIKK) family of proteins, ataxia telangiectasia mutated (ATM), DNA-protein kinase catalytic subunit and ATM and RAD3-related (ATR)2. Typically, only a few base-pairs (bp) are implicated in a DSB, however, there is significant signal amplification, given the importance of chromatin modifications in DNA damage signalling and repair. Phosphorylation of H2AX mediated predominantly by ATM spreads to adjacent areas of chromatin, affecting approximately 0.03% of total cellular H2AX per DSB2,3. This corresponds to phosphorylation of approximately 2000 H2AX molecules spanning ~2 Mbp regions of chromatin surrounding the site of the DSB and results in the formation of discrete &gamma;H2AX foci which can be easily visualized and quantitated by immunofluorescence microscopy2. The loss of &gamma;H2AX at DSB reflects repair, however, there is some controversy as to what defines complete repair of DSBs; it has been proposed that rejoining of both strands of DNA is adequate however, it has also been suggested that re-instatement of the original chromatin state of compaction is necessary4-8. The disappearence of &gamma;H2AX involves at least in part, dephosphorylation by phosphatases, phosphatase 2A and phosphatase 4C5,6. Further, removal of &gamma;H2AX by redistribution involving histone exchange with H2A.Z has been implicated7,8. Importantly, the quantitative analysis of &gamma;H2AX foci has led to a wide range of applications in medical and nuclear research. Here, we demonstrate the most commonly used immunofluorescence method for evaluation of initial DNA damage by detection and quantitation of &gamma;H2AX foci in &gamma;-irradiated adherent human keratinocytes9.

Quantification of &amp;#947;H2AX Foci in Response to Ionising Radiation

Quantification of DNA double-strand streaks using &gamma;H2AX formation as a molecular marker has become an invaluable tool in radiation biology. Here we demonstrate the use of an immunofluorescence assay for quantification of &gamma;H2AX foci after exposure of cells to radiation.

Die Quantifizierung der γH2AX Foci in Response to ionisierender Strahlung

DNA double-strand breaks (DSBs), which are induced by either endogenous metabolic processes or by exogenous sources, are one of the most critical DNA ...

Evaluation of the Spatial Distribution of &gamma;H2AX following Ionizing Radiation

An early molecular response to DNA double-strand breaks (DSBs) is phosphorylation of the Ser-139 residue within the terminal SQEY motif of the histone H2AX1,2. This phosphorylation of H2AX is mediated by the phosphatidyl-inosito 3-kinase (PI3K) family of proteins, ataxia telangiectasia mutated (ATM), DNA-protein kinase catalytic subunit and ATM and RAD3-related (ATR)3. The phosphorylated form of H2AX, referred to as &gamma;H2AX, spreads to adjacent regions of chromatin from the site of the DSB, forming discrete foci, which are easily visualized by immunofluorecence microscopy3. Analysis and quantitation of &gamma;H2AX foci has been widely used to evaluate DSB formation and repair, particularly in response to ionizing radiation and for evaluating the efficacy of various radiation modifying compounds and cytotoxic compounds4.
Given the exquisite specificity and sensitivity of this de novo marker of DSBs, it has provided new insights into the processes of DNA damage and repair in the context of chromatin. For example, in radiation biology the central paradigm is that the nuclear DNA is the critical target with respect to radiation sensitivity. Indeed, the general consensus in the field has largely been to view chromatin as a homogeneous template for DNA damage and repair. However, with the use of &gamma;H2AX as molecular marker of DSBs, a disparity in &gamma;-irradiation-induced &gamma;H2AX foci formation in euchromatin and heterochromatin has been observed5-7. Recently, we used a panel of antibodies to either mono-, di- or tri- methylated histone H3 at lysine 9 (H3K9me1, H3K9me2, H3K9me3) which are epigenetic imprints of constitutive heterochromatin and transcriptional silencing and lysine 4 (H3K4me1, H3K4me2, H3K4me3), which are tightly correlated actively transcribing euchromatic regions, to investigate the spatial distribution of &gamma;H2AX following ionizing radiation8. In accordance with the prevailing ideas regarding chromatin biology, our findings indicated a close correlation between &gamma;H2AX formation and active transcription9. Here we demonstrate our immunofluorescence method for detection and quantitation of &gamma;H2AX foci in non-adherent cells, with a particular focus on co-localization with other epigenetic markers, image analysis and 3D-modeling.

Evaluation of the Spatial Distribution of &amp;#947;H2AX following Ionizing Radiation

Microscopic analysis of &gamma;H2AX foci, which form following the phosphorylation of H2AX at Ser-139 in response to DNA double-strand breaks, has become an invaluable tool in radiation biology. Here we used an antibody to mono-methylated histone H3 at lysine 4 as an epigenetic marker of actively transcribing euchromatin, to evaluate the spatial distribution of radiation-induced &gamma;H2AX formation within the nucleus.

Auswertung der räumlichen Verteilung der γH2AX folgenden ionisierender Strahlung

An early molecular response to DNA double-strand breaks (DSBs) is phosphorylation of the Ser-139 residue within the terminal SQEY motif of the histone ...

Assessment of Calcium Sparks in Intact Skeletal Muscle Fibers

Maintaining homeostatic Ca2+ signaling is a fundamental physiological process in living cells. Ca2+ sparks are the elementary units of Ca2+ signaling in the striated muscle fibers that appear as highly localized Ca2+ release events mediated by ryanodine receptor (RyR) Ca2+ release channels on the sarcoplasmic reticulum (SR) membrane. Proper assessment of muscle Ca2+ sparks could provide information on the intracellular Ca2+&#160;handling properties of healthy and diseased striated muscles. Although Ca2+ sparks events are commonly seen in resting cardiomyocytes, they are rarely observed in resting skeletal muscle fibers; thus there is a need for methods to generate and analyze sparks in skeletal muscle fibers.
Detailed here is an experimental protocol for measuring Ca2+ sparks in isolated flexor digitorm brevis (FDB) muscle fibers using fluorescent Ca2+ indictors and laser scanning confocal microscopy. In this approach, isolated FDB fibers are exposed to transient hypoosmotic stress followed by a return to isotonic physiological solution. Under these conditions, a robust Ca2+ sparks response is detected adjacent to the sarcolemmal membrane in young healthy FDB muscle fibers. Altered Ca2+ sparks response is detected in dystrophic or aged skeletal muscle fibers. This approach has recently demonstrated that membrane-delimited signaling involving cross-talk between inositol (1,4,5)-triphosphate receptor (IP3R) and RyR contributes to Ca2+ spark activation in skeletal muscle. In summary, our studies using osmotic stress induced Ca2+ sparks showed that this intracellular response reflects a muscle signaling mechanism in physiology and aging/disease states, including mouse models of muscle dystrophy (mdx mice) or amyotrophic lateral sclerosis (ALS model).

Described here is a method to directly measure calcium sparks, the elementary units of Ca2+ release from sarcoplasmic reticulum&#160;in intact skeletal muscle fibers. This method utilizes osmotic-stress-mediated triggering of Ca2+ release from ryanodine receptor in isolated muscle fibers. The dynamics and homeostatic capacity of intracellular Ca2+ signaling can be employed to assess muscle function in health and disease.

Bewertung von Calcium in Sparks Intact Skelettmuskelfasern

Maintaining homeostatic Ca2+ signaling is a fundamental physiological process in living cells. Ca2+ sparks are the elementary units of Ca2+ signaling in ...

Measurement of mRNA Decay Rates in Saccharomyces cerevisiae Using rpb1-1 Strains

mRNA steady state levels vary depending on environmental conditions. Regulation of the steady state accumulation levels of an mRNA ensures that the correct amount of protein is synthesized for the cell&#8217;s specific growth conditions. One approach for measuring mRNA decay rates is inhibiting transcription and subsequently monitoring the disappearance of the already present mRNA. The rate of mRNA decay can then be quantified, and an accurate half-life can be determined utilizing several techniques. In S. cerevisiae, protocols that measure mRNA half-lives have been developed and include inhibiting transcription of mRNA using strains that harbor a temperature sensitive allele of RNA polymerase II, rpb1-1. Other techniques for measuring mRNA half-lives include inhibiting transcription with transcriptional inhibitors such as thiolutin or 1,10-phenanthroline, or alternatively, by utilizing mRNAs that are under the control of a regulatable promoter such as the galactose inducible promoter and the TET-off system. Here, we describe measurement of S. cerevisiae mRNA decay rates using the temperature sensitive allele of RNA polymerase II. This technique can be used to measure mRNA decay rates of individual mRNAs or genome-wide.

Measurement of mRNA Decay Rates in Saccharomyces cerevisiae Using rpb1-1 Strains

The steady state level of specific mRNAs is determined by the rate of synthesis and decay of the mRNA. Genome-wide mRNA degradation rates or the decay rates of specific mRNAs can be measured by determining mRNA half-lives. This protocol focuses on measurement of mRNA decay rates in Saccharomyces cerevisiae.

Die Messung der mRNA-Abbau Preise in<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em&gt; Verwenden<em&gt; Rpb1-1</em&gt; Die Stämme

mRNA steady state levels vary depending on environmental conditions. Regulation of the steady state accumulation levels of an mRNA ensures that the ...

Genetic and Biochemical Approaches for In Vivo and In Vitro Assessment of Protein Oligomerization: The Ryanodine Receptor Case Study

Oligomerization is often a structural requirement for proteins to accomplish their specific cellular function. For instance, tetramerization of the ryanodine receptor (RyR) is necessary for the formation of a functional Ca2+ release channel pore. Here, we describe detailed protocols for the assessment of protein self-association, including yeast two-hybrid (Y2H), co-immunoprecipitation (co-IP) and chemical cross-linking assays. In the Y2H system, protein self-interaction is detected by &#946;-galactosidase assay in yeast co-expressing GAL4 bait and target fusions of the test protein. Protein self-interaction is further assessed by co-IP using HA- and cMyc-tagged fusions of the test protein co-expressed in mammalian HEK293 cells. The precise stoichiometry of the protein homo-oligomer is examined by cross-linking and SDS-PAGE analysis following expression in HEK293 cells. Using these different but complementary techniques, we have consistently observed the self-association of the RyR N-terminal domain and demonstrated its intrinsic ability to form tetramers. These methods can be applied to protein-protein interaction and homo-oligomerization studies of other mammalian integral membrane proteins.

Genetic and Biochemical Approaches for In Vivo and In Vitro Assessment of Protein Oligomerization: The Ryanodine Receptor Case Study

Oligomerization of the ryanodine receptor, a homo-tetrameric ion channel mediating Ca2+ release from intracellular stores, is critical for skeletal and cardiac muscle contraction. Here, we present complementary in vivo and in vitro methods to detect protein self-association and determine homo-oligomer stoichiometry.

Genetische und biochemische Ansätze für<em&gt; In Vivo</em&gt; und<em&gt; In Vitro</em&gt; Beurteilung von Protein Oligomerisierung: Der Ryanodinrezeptor Case Study

Oligomerization is often a structural requirement for proteins to accomplish their specific cellular function. For instance, tetramerization of the ...