Présentation Les organismes doivent présenter un large éventail de comportements à répondre aux stimuli menaçant et changements dans l&#39;environnement. La réponse autonome est bien étudié chez les vertébrés comme la lutte ou de fuite dans laquelle le système nerveux sympathique se prépare physiologiquement l&#39;environnement interne (Carpenter, 1976;. Nicholls et al, 2001). C&#39;est grâce à des changements physiologiques qui peuvent réguler un organisme de la réponse au stress et modifier le comportement de réagir à une attaque imminente ou de changer d&#39;environnement. L&#39;expérience montre que le système cardio-vasculaire est étroitement lié au système respiratoire permettant ainsi à l&#39;environnement interne de réagir et de mettre en œuvre une réponse. Il est bien connu que le contrôle autonome des systèmes respiratoire et cardiovasculaire peut réguler la disponibilité en oxygène et de nutriments aux tissus cibles spécifiques nécessaires pour une réponse imminente de comportement. Chez les vertébrés, la réponse physiologique est autonome et si bien évolué, il semble probable que les invertébrés complexe serait similaire possèdent un système de réponse développée (Schapker et al, 2002;. Zavarzin, 1941). Même si les vertébrés et les invertébrés sont très différents de manière systématique; invertébrés très développés nécessitent l&#39;intervention rapide cardiovasculaires et respiratoires à répondre dans un combat ou d&#39;une manière vol. Pour de nombreux invertébrés, une réponse favorable de type physiologique peut être quantifiée. Datant de 1927, beaucoup d&#39;études très tôt ont été menées chez les invertébrés, en particulier en utilisant des arthropodes en général (Alexandrowicz, 1932; Orlov, 1927; Zavarzin, 1941). Les écrevisses sont connus pour présenter un large éventail de comportements rapide ainsi que la capacité d&#39;évaluer et de réagir aux stimuli environnementaux. Très tôt les études ont noté une réponse sympathique ressemblant d&#39;une réponse immédiate et rapide de la posture de défense (Bethe, 1897; Huxley, 1880; Shuranova et al, 2006;. Wiersma, 1961). Le cœur d&#39;écrevisses adultes est neurogène depuis le beat et le rythme sont contrôlées par le système nerveux central (Alexandrowicz, 1932; Yamagishi et Hirose, 1997;. Yamagishi et al, 1997; Wilkens, 1999). Régulièrement, la mesure de la fréquence cardiaque d&#39;un animal (RH) fournit une mesure directe de l&#39;excitabilité et la préparation de l&#39;environnement interne. Dans les écrevisses, une augmentation de la RH est noté au cours posture de défense lorsqu&#39;ils sont présentés avec un stimulus perçu menaçants (Listerman et al., 2000). Ce type de réponse du système nerveux a également été démontré dans les langoustes (Yazawa et Katsuyama, 2001). Le système ventilatoire est également contrôlée neuronale avec un générateur de motif central ventilatoire (VPG) responsable de l&#39;absorption d&#39;oxygène par les branchies par l&#39;action de pompage de deux appendices spécialisés scaphognathites qualifié (Mendelson, 1971). Une seule scaphognathite réside dans chaque chambre branchiale aux extrémités antérieure et tire l&#39;eau à travers les branchies par un mouvement rythmique (Pasztor, 1968). Le VPG, comme avec le coeur, peut être modulée par de nombreux facteurs. Des travaux antérieurs dans le crabe, Cancer magister montre rythme cardiaque et respiratoire peut être altérée par le contrôle central par les neurones de commande (Wilkens et al., 1974). En outre, l&#39;activité de l&#39;VPG est connu pour le changement avec des changements dans la réponse interne et avec les interactions sociales ou les changements environnementaux dans les crustacés (Burmistrov et Shuranova, 1996; Cuadras, 1979, 1980; Li et al, 2000;. Listerman et al. , 2000; McMahon et Wilkens, 1983; Schapker et al, 2002;. Shuranova et al, 2002;. Wilkens, 1976). Comme vu dans l&#39;écrevisse, l&#39;activité ventilatoire (VR) peuvent varier en fonction de l&#39;état interne et les changements de VR peuvent être enregistrées au cours des stimuli externes imprévus (Shuranova et al, 1993;. Shuranova et al, 2002).. En raison de la fiabilité et la faisabilité de mesures RH et VR, les futures questions à se poser sont infinies. Comme noté précédemment, le travail a été fait pour examiner la réponse autonome au cours des interactions sociales et des perturbations environnementales. Fait intéressant, de nombreuses zones sont laissées à être explorées, comme l&#39;examen de la réponse autonome au cours naturel des changements hormonaux et / ou d&#39;autres processus physiologiques qui se produisent dans l&#39;organisme. Les orientations futures possibles peuvent également examiner sympathiques-comme des réponses pendant l&#39;accouplement et la réception chimiques olfactifs. Plus important encore, les réponses physiologiques peuvent fournir un meilleur aperçu dans une réponse de l&#39;organisme à l&#39;environnement par rapport à l&#39;observation du comportement, puisque les animaux ne réagissent pas toujours quand ils comportemental se préparent intérieurement. Ainsi, la mesure physiologique fournit un indice biologique pour évaluer l&#39;état interne d&#39;un organisme qui peut expliquer les changements globaux dans un organisme. Méthodes Avant de commencer à câbler une écrevisse, la préparation des fils est nécessaire. Coupez deux fils isolés en acier inoxydable (diamètre 0,005 pouce et avec le revêtement 0,008 pouces; Systèmes AM, Carlsburg, WA) assez longtemps pour l&#39;insérer dans l&#39;écrevisse et adéquatement parvenir à un détecteur de l&#39;impédance (UFI, modèle 2991). Retirez l&#39;isolation (~ 0,5 mm) par le feu sur les extrémités des deux fils qui sera inséré dans la carapace. Attention à ne pas enlever l&#39;isolant trop comme un fil nu à l&#39;extérieur de l&#39;animal doit être recouvert pour éviter les courts enregistrements impédance de circuit. Puis, en utilisant une pince plier les extrémités des fils brûlés dans un angle de 90 pour le placement dans la carapace. Soyez sûr que la partie insérée sur le fil n&#39;est pas trop longtemps car cela pourrait causer des dommages aux organes internes. Pour la faisabilité de l&#39;insertion des fils dans un tube en plastique (qui protège les fils), il est préférable de vaguement torsadez les fils ensemble. Si le cœur de l&#39;enregistrement et le taux de ventilation, répétez les étapes ci-dessus une deuxième fois et les deux ensembles de fils peut être vaguement tressés ensemble avant le placement dans le tube de plastique. Soyez sûr de désigner le fils pour le coeur et le taux de ventilation de façon à ne pas confondre ce qui attachent les fils du détecteur d&#39;impédance qui pour l&#39;enregistrement. Il est préférable d&#39;étiqueter les fils ou couper une paire plus courte que l&#39;autre au début. À mener à bien et en toute sécurité de fil de l&#39;écrevisse, il est préférable d&#39;envelopper les griffes et les jambes (en laissant le dos et un côté exposé) en chiffon humide ou du papier absorbant pour éliminer le dommage causé à la personne et / ou d&#39;écrevisses (figure 1). <img src="/files/ftp_upload/1594/1594fig1.jpg" style="float:left;" alt="Figure 1" /> Figure 1. Emballage de l&#39;chélipèdes et les jambes de l&#39;écrevisse. Emballage de l&#39;écrevisse dans une serviette en papier humide sera de prévenir les blessures à la personne et l&#39;écrevisse. L&#39;emballage sera entraver la capacité de l&#39;écrevisse de déplacer les chélipèdes et les jambes. Pour commencer le processus de câblage, il est préférable de commencer dans la chambre branchiale puisque l&#39;épaisseur de carapace varie avec chaque écrevisses et une force excessive peut causer des dommages aux organes internes, ce qui en commençant dans la chambre branchiale, une pression excessive est moins susceptible de tuer les écrevisses par rapport à la chambre thoracique. Le premier trou est fait en utilisant une fine pointe de scalpel et juste assez grand pour un fil à insérer sous la cuticule de la région rostrale de la chambre branchiale (ie, la chambre prebranchial de surveiller le taux ventilatoire;. Schapker et al, 2002). Un grand trou aura une perte hémolymphe excessive et ne sont pas étanches, ce qui augmentera la probabilité de ne pas rester les fils dans le trou désigné. Une fois que le fil est en place, déposer une petite quantité de colle (cyanoacrylate ester) et de l&#39;accélérateur (HobbyTown Etats-Unis, Lexington, KY) sur le fil. L&#39;utilisation de la colle à séchage rapide permet de réduire le stress de manipulation des animaux. Soyez prudent de placer une petite quantité d&#39;accélérateur sur la cuticule car cela est toxique pour les écrevisses et causer la mort. Il est préférable d&#39;essuyer immédiatement tout accélérateur de l&#39;excès avec une serviette en papier. Répétez ces étapes pour le deuxième fil dans la chambre branchiale. Ces deux fils sont placés pour enjamber le scaphognathite (organe respiratoire) pour assurer une mesure précise impédance forte lors de chaque mouvement scaphognathite (figure 2). Pour obtenir un enregistrement précis, être sûr que le deuxième fil n&#39;est pas placée à l&#39;extérieur de la chambre branchiale et dans la chambre thoracique. <img src="/files/ftp_upload/1594/1594fig2.jpg" style="float:left;" alt="Figure 2" /> Figure 2. Placement des fils en acier inoxydable dans la chambre branchiale. Les points blancs sur la carapace représentent des points pour les fils en acier inoxydable pour être placé sous la cuticule. Les fils de la durée et le mouvement scaphognathite mesure par impédance dynamique. Les étapes de la fréquence cardiaque de câblage dans la chambre thoracique est le même que ci-dessus, sauf les fils sont placés sous la carapace dorsale directement sur le cœur et la durée du coeur dans un arrangement rostrale-caudale (figure 3). Ce placement sera d&#39;assurer une mesure d&#39;impédance forte précis pendant chaque contraction cardiaque (Listerman et al., 2001). <img src="/files/ftp_upload/1594/1594fig3.jpg" style="float:left;" alt="Figure 3" /> Figure 3. Placement des fils en acier inoxydable dans la chambre thoracique. Les points blancs sur la carapace représentent des points pour les fils en acier inoxydable pour être placé sous la cuticule. Les fils couvrent le coeur dans un arrangement rostrale-caudale. Cela permettra de prendre des mesures de contraction du cœur grâce à impédance dynamique. Une fois le placement de tous les quatre fils est terminée, le mélange d&#39;un adhésif instantané (Eastman, 5-min e séchagepoxy) et enduire les trous pour chaque emplacement ainsi que les fils. Une fois les fils et les trous forés sont convenablement couverts, l&#39;utilisation de l&#39;époxy restant à maintenir le tuyau en plastique à l&#39;arrière de l&#39;écrevisse. Cela permettra d&#39;assurer que les fils ne sera pas retiré des trous dans les manutentions avenir. Depuis l&#39;époxy prend que quelques minutes pour sécher, de conserver ou placer les écrevisses dans un récipient sans eau jusqu&#39;à ce que l&#39;époxy n&#39;est plus collant au toucher. Une fois que l&#39;époxyde est sèche, laver la langouste dans l&#39;eau pour éliminer les produits chimiques en excès et les remettre dans un milieu aquatique. Pour assurer la santé de l&#39;écrevisse, il est préférable de changer l&#39;eau en une heure environ pour enlever les produits chimiques non encore enlevés. Comme noté par les enquêteurs précédents, nous avons constaté que d&#39;une manipulation prolongée altère les mesures physiologiques du stress dû pour une durée de 24 h à 3 jours (Wilkens et al, 1985.), Donc, les animaux devraient être laissés pendant 2 à 3 jours avant toute expérimentation . Pour enregistrer les ECG, brancher les fils de l&#39;écrevisse à des détecteurs d&#39;impédance. Les deux fils s&#39;étendant du cœur (RH mesure) doit être joint à un détecteur d&#39;impédance simple et de même pour les deux fils enjambe la scaphognathite (mesure VR). Le détecteur mesure la résistance d&#39;impédance dynamique entre les deux fils d&#39;acier inoxydable. Ces signaux sont captés par le détecteur de connexion en ligne pour une PowerLab via une interface PowerLab/4SP (Instruments AD). Tous les événements sont mesurés et calibrés avec la version 5.5.6 logiciel Chart PowerLab (AD Instruments, Australie). Pour commencer, fixer un taux d&#39;acquisition à 4 kHz. Les grands déplacements représenteront rythme cardiaque et le taux de ventilation. Pour plus de facilité dans le comptage de chaque HR / VR, une fonction de lissage peut s&#39;appliquer à l&#39;ensemble des données. Si 100 points ont été lissées (c&#39;est à dire en moyenne) la trace résultante sera que représentent les battements du coeur. Le rythme cardiaque peut être déterminé par dénombrement direct de chaque battement de plus de 10 s intervalles, puis convertie en battements par minute (BPM).

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<table border="1">
<tbody>
<tr>
<td>Material Name</td>
<td>Type</td>
<td>Company</td>
<td>Catalogue Number</td>
</tr>	
<tr>
<td>Scalpel (Stainless steel surgical blades No. 11 for No. 3 handle)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
</tr>
<tr>
<td>Stainless steel wire (diameter 0.005 inches with the coating 0.008 inches; A-M Systems, Carlsburg, WA)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
</tr>
<tr>
<td>Impedance detector (UFI, model 2991)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
</tr>
<tr>
<td>Plastic tubing (Tygon Tubing ID .0812, OD .1492, Cole-Parmer Instrument Company)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
</tr>
<tr>
<td>Fast-drying glue (cyanoacrylate ester, HobbyTown USA, Lexington, KY)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
</tr>
<tr>
<td>Accelerator (HobbyTown USA, Lexington, KY)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
</tr>
<tr>
<td>Adhesive (Eastman, 5-min drying epoxy)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
</tr>
<tr>
<td><a href="http://www.adinstruments.com/products/hardware/corporate/product/ML866/" target="_blank">PowerLab via a PowerLab/4SP interface (AD Instruments)</a>.</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
</tr>
<tr>
<td><a href="http://www.adinstruments.com/products/software/research/LabChart-Software/" target="_blank">PowerLab Chart software version 5.5.6 (AD Instruments, Australia)</a></td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
</tr>
<tr>
<td><a href="http://www.adinstruments.com/products/software/research/LabChart-Software/" target="_blank">Chart software version 3.5.6 (AD Instruments, Australia)</a></td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
</tr>
</tbody>
		</table>

measures of heart and ventilatory rates in freely moving crayfish

La réaction de peur, la fuite ou combat sert de base physiologique fondamental pour examiner la sensibilisation d&#39;un organisme de son environnement sous une attaque par un prédateur imminente. Bien qu&#39;il ne sait pas si les invertébrés possèdent un système nerveux autonome identique à celui des vertébrés, les invertébrés ont preuve démontre une réponse sympathique ressemblant à réguler l&#39;environnement interne et préparer l&#39;organisme à agir comportemental à un stimulus donné. De plus, cette réponse physiologique peuvent réalistement être mesurée et il agit comme un indice biologique d&#39;état interne de l&#39;animal. Les mesures de la réponse physiologique peut être directement liés aux facteurs de stress internes et externes grâce à des changements dans la coordination du système nerveux central contrôlé des systèmes cardio-vasculaire et respiratoire. Plus précisément, la surveillance cardiaque et les taux de ventilation de fournir des mesures quantifiables de la réponse au stress n&#39;est pas toujours comportemental observé. Les écrevisses sont des organismes modèles bon pour le cœur et les mesures de fréquence respiratoire due à la faisabilité de l&#39;enregistrement, ainsi que la riche histoire connue de la morphologie de l&#39;écrevisse, datant de Huxley en 1888, et les comportements typiques bien étudiés.

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Measures of Heart and Ventilatory Rates in Freely Moving Crayfish

Invertébrés montrent une sympathie autonomique de type réponse similaire à celle décrite pour les vertébrés. La coordination des systèmes cardio-vasculaire et respiratoire permet de mesurer un indice biologique permettant d&#39;évaluer un état internes de l&#39;organisme.

Les mesures de la fréquence cardiaque et ventilatoire déplaçant librement écrevisses

The fear, flight or fight response serves as the fundamental physiological basis for examining an organism's awareness of its environment under an ...

measures-of-heart-and-ventilatory-rates-in-freely-moving-crayfish

Research

JoVE Journal

Biology

15.2K vues.  University of Kentucky. Invertébrés montrent une sympathie autonomique de type réponse similaire à celle décrite pour les vertébrés. La coordination des systèmes cardio-vasculaire et respiratoire permet de mesurer un indice biologique permettant d'évaluer un état internes de l'organisme.

Vidéo: Measures of Heart and Ventilatory Rates in Freely Moving Crayfish

Implantation of Engineered Tissue in the Rat Heart

Rodent surgery is often an important component in assessing the utility of engineered tissues. A wide variety of surgical procedures can be performed in common laboratory rats or mice and these quite frequently serve as an intermediate step between bench-top experiments and large animal testing or human trials. Given that rodents provide an established, cost-effective, and physiologically-relevant model system in which to test novel combinations of scaffolding materials and cells, they are particularly well-suited for cardiovascular tissue engineering studies. Presently, we describe an open-heart surgical procedure to implant engineered tissue containing myogenic progenitor cells in the atrioventricular (AV) groove of a rat heart. These implants are intended to create an electrical conduit between the right atrium and right ventricle with the ultimate goal of providing an alternative treatment to conventional pacemaker implantation in pediatric patients with complete heart block[1]. The engineered tissue is implanted in the AV-groove by means of a thoracotomy. For our purposes, Lewis rats are anesthetized and invasively ventilated to maintain positive airway pressure during the sterile surgical procedure. The approach to the heart is performed by a right thoracotomy through an antero-lateral incision at the 5th intercostal space. The tissue construct is fixed in the AV groove using a single 7-0 Prolene suture and positioned between the right ventricle and atrium at the ventral portion of the heart. The epicardium is partially removed to allow direct contact between the recipient myocardial cells and those contained in the engineered tissue. Following implantation, the chest wall is closed in layers, any pneumothorax is evacuated, and the animal is extubated and treated with analgesic.

Here, we describe a cardiac surgical procedure to implant engineered tissue in the atrioventricular (AV)-groove of an adult Lewis rat.

Implantation de l&#39;ingénierie tissulaire dans le coeur de rat

Rodent surgery is often an important component in assessing the utility of engineered tissues. A wide variety of surgical procedures can be performed in ...

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Biologie

Recordings of Neural Circuit Activation in Freely Behaving Animals

The relationship between patterns of neural activity and corresponding behavioral expression is difficult to establish in unrestrained animals. Traditional non-invasive methods require at least partially restrained research subjects, and they only allow identification of large numbers of simultaneously activated neurons. On the other hand, small ensembles of neurons or individual neurons can only be measured using single-cell recordings obtained from largely reduced preparations. Since the expression of natural behavior is limited in restrained and dissected animals, the underlying neural mechanisms that control such behavior are difficult to identify. 
Here, I present a non-invasive physiological technique that allows measuring neural circuit activation in freely behaving animals. Using a pair of wire electrodes inside a water-filled chamber, the bath electrodes record neural and muscular field potentials generated by juvenile crayfish during natural or experimentally evoked escape responses. The primary escape responses of crayfish are mediated by three different types of tail-flips which move the animals away from the point of stimulation. Each type of tail-flip is controlled by its own neural circuit; the two fastest and most powerful escape responses require activation of different sets of large &#8220;command&#8221; neurons. In combination with behavioral observations, the bath electrode recordings allow unambiguous identification of these neurons and the associated neural circuits. Thus activity of neural circuitry underlying naturally occurring behavior can be measured in unrestrained animals and in different behavioral contexts.

Non-invasive measurements of neural activity patterns in freely behaving animals are obtained by combining neurophysiological recordings with high speed videography.

Enregistrements de l&#39;activation des circuits neuronaux dans les Librement Behaving Animaux

The relationship between patterns of neural activity and corresponding behavioral expression is difficult to establish in unrestrained animals. ...

Visualizing the Beating Heart in Drosophila

The Drosophila heart has recently emerged as a good model system for examining the genetic, cellular, and molecular mechanisms underlying function in myogenic hearts. A key step in examining heart function in the fly is finding a way to access the heart in a manner that preserves its myogenic function while still allowing the beating heart organ to be observed and recorded. Two different methods for observing and recording the beating heart in both larva and adult Drosophila are described here. Our semi-intact preparation using adult flies allows clear visualization of the abdominal heart without interference from the pigmented cuticle and overlying fat bodies. To record larval heart beats it is necessary to immobilize the larva, which minimizes body wall movements thereby reducing heart movements that are not associated with myocardial contractions. Our methodologies produce stable adult and larval heart preparations that can beat for hours at rates of 1-3 Hz.

Visualizing the Beating Heart in Drosophila

Technique required for visualizing the beating heart in larval and adult Drosophila are presented. Each life stage requires a different methodology.

Visualiser le cœur battant Drosophile</em

The Drosophila heart has recently emerged as a good model system for examining the genetic, cellular, and molecular mechanisms underlying function in ...

Historical View and Physiology Demonstration at the NMJ of the Crayfish Opener Muscle

Here we present some of the key important discoveries made with the opener neuromuscular (NMJ) preparation of crustaceans and illustrate that there is still much to learn from this model preparation. In understanding the history one can appreciate why even today this NMJ still offers a rich playground to address questions regarding pre- and post-synaptic function and plasticity. The viability and ease of access to the terminal for intracellular as well as extracellular electrophysiology and imaging are significant advantages. The mechanisms behind the modulation of vesicular kinetics and fusion within the high- and low-output terminals are begging for investigation. The preparation also offers a testable model system for computational assessments and manipulations to examine key variables in theoretical models of synaptic function, for example calcium dynamics during short-term facilitation. The synaptic complexity of active zone and statistical nature of quantal release is also an open area for future investigation both experimentally and computationally.

The opener muscle of the crayfish leg is presented for its historical importance and experimental versatility in muscle phenotype, synaptic physiology and plasticity.

Voir historique et démonstration de physiologie à l&#39;JNM du muscle Opener écrevisses

Here we present some of the key important discoveries made with the opener neuromuscular (NMJ) preparation of crustaceans and illustrate that there is ...

Preparation of embryos for Electron Microscopy of the Drosophila embryonic heart tube

The morphogenesis of the Drosophila embryonic heart tube has emerged as a valuable model system for studying cell migration, cell-cell adhesion and cell shape changes during embryonic development. One of the challenges faced in studying this structure is that the lumen of the heart tube, as well as the membrane features that are crucial to heart tube formation, are difficult to visualize in whole mount embryos, due to the small size of the heart tube and intra-lumenal space relative to the embryo. The use of transmission electron microscopy allows for higher magnification of these structures and gives the advantage of examining the embryos in cross section, which easily reveals the size and shape of the lumen. In this video, we detail the process for reliable fixation, embedding, and sectioning of late stage Drosophila embryos in order to visualize the heart tube lumen as well as important cellular structures including cell-cell junctions and the basement membrane.

Preparation of embryos for Electron Microscopy of the Drosophila embryonic heart tube

We describe a process for fixation, embedding, sectioning, and imaging of late stage Drosophila embryos for Trasmission Electron Microscopy of the embryonic heart tube. This technique allows for the visualization of the heart tube lumen as well as the basement membrane, which lines the lumen of the heart.

Préparation d&#39;embryons pour la microscopie électronique des Drosophile Tube cardiaque embryonnaire

The morphogenesis of the Drosophila  embryonic heart tube has emerged as a valuable model system for studying cell migration, cell-cell adhesion and cell ...

Quantification of &gamma;H2AX Foci in Response to Ionising Radiation

DNA double-strand breaks (DSBs), which are induced by either endogenous metabolic processes or by exogenous sources, are one of the most critical DNA lesions with respect to survival and preservation of genomic integrity. An early response to the induction of DSBs is phosphorylation of the H2A histone variant, H2AX, at the serine-139 residue, in the highly conserved C-terminal SQEY motif, forming &gamma;H2AX1. Following induction of DSBs, H2AX is rapidly phosphorylated by the phosphatidyl-inosito 3-kinase (PIKK) family of proteins, ataxia telangiectasia mutated (ATM), DNA-protein kinase catalytic subunit and ATM and RAD3-related (ATR)2. Typically, only a few base-pairs (bp) are implicated in a DSB, however, there is significant signal amplification, given the importance of chromatin modifications in DNA damage signalling and repair. Phosphorylation of H2AX mediated predominantly by ATM spreads to adjacent areas of chromatin, affecting approximately 0.03% of total cellular H2AX per DSB2,3. This corresponds to phosphorylation of approximately 2000 H2AX molecules spanning ~2 Mbp regions of chromatin surrounding the site of the DSB and results in the formation of discrete &gamma;H2AX foci which can be easily visualized and quantitated by immunofluorescence microscopy2. The loss of &gamma;H2AX at DSB reflects repair, however, there is some controversy as to what defines complete repair of DSBs; it has been proposed that rejoining of both strands of DNA is adequate however, it has also been suggested that re-instatement of the original chromatin state of compaction is necessary4-8. The disappearence of &gamma;H2AX involves at least in part, dephosphorylation by phosphatases, phosphatase 2A and phosphatase 4C5,6. Further, removal of &gamma;H2AX by redistribution involving histone exchange with H2A.Z has been implicated7,8. Importantly, the quantitative analysis of &gamma;H2AX foci has led to a wide range of applications in medical and nuclear research. Here, we demonstrate the most commonly used immunofluorescence method for evaluation of initial DNA damage by detection and quantitation of &gamma;H2AX foci in &gamma;-irradiated adherent human keratinocytes9.

Quantification of &amp;#947;H2AX Foci in Response to Ionising Radiation

Quantification of DNA double-strand streaks using &gamma;H2AX formation as a molecular marker has become an invaluable tool in radiation biology. Here we demonstrate the use of an immunofluorescence assay for quantification of &gamma;H2AX foci after exposure of cells to radiation.

Quantification des γH2AX Foci en réponse aux radiations ionisantes

DNA double-strand breaks (DSBs), which are induced by either endogenous metabolic processes or by exogenous sources, are one of the most critical DNA ...

Evaluation of the Spatial Distribution of &gamma;H2AX following Ionizing Radiation

An early molecular response to DNA double-strand breaks (DSBs) is phosphorylation of the Ser-139 residue within the terminal SQEY motif of the histone H2AX1,2. This phosphorylation of H2AX is mediated by the phosphatidyl-inosito 3-kinase (PI3K) family of proteins, ataxia telangiectasia mutated (ATM), DNA-protein kinase catalytic subunit and ATM and RAD3-related (ATR)3. The phosphorylated form of H2AX, referred to as &gamma;H2AX, spreads to adjacent regions of chromatin from the site of the DSB, forming discrete foci, which are easily visualized by immunofluorecence microscopy3. Analysis and quantitation of &gamma;H2AX foci has been widely used to evaluate DSB formation and repair, particularly in response to ionizing radiation and for evaluating the efficacy of various radiation modifying compounds and cytotoxic compounds4.
Given the exquisite specificity and sensitivity of this de novo marker of DSBs, it has provided new insights into the processes of DNA damage and repair in the context of chromatin. For example, in radiation biology the central paradigm is that the nuclear DNA is the critical target with respect to radiation sensitivity. Indeed, the general consensus in the field has largely been to view chromatin as a homogeneous template for DNA damage and repair. However, with the use of &gamma;H2AX as molecular marker of DSBs, a disparity in &gamma;-irradiation-induced &gamma;H2AX foci formation in euchromatin and heterochromatin has been observed5-7. Recently, we used a panel of antibodies to either mono-, di- or tri- methylated histone H3 at lysine 9 (H3K9me1, H3K9me2, H3K9me3) which are epigenetic imprints of constitutive heterochromatin and transcriptional silencing and lysine 4 (H3K4me1, H3K4me2, H3K4me3), which are tightly correlated actively transcribing euchromatic regions, to investigate the spatial distribution of &gamma;H2AX following ionizing radiation8. In accordance with the prevailing ideas regarding chromatin biology, our findings indicated a close correlation between &gamma;H2AX formation and active transcription9. Here we demonstrate our immunofluorescence method for detection and quantitation of &gamma;H2AX foci in non-adherent cells, with a particular focus on co-localization with other epigenetic markers, image analysis and 3D-modeling.

Evaluation of the Spatial Distribution of &amp;#947;H2AX following Ionizing Radiation

Microscopic analysis of &gamma;H2AX foci, which form following the phosphorylation of H2AX at Ser-139 in response to DNA double-strand breaks, has become an invaluable tool in radiation biology. Here we used an antibody to mono-methylated histone H3 at lysine 4 as an epigenetic marker of actively transcribing euchromatin, to evaluate the spatial distribution of radiation-induced &gamma;H2AX formation within the nucleus.

Évaluation de la distribution spatiale des rayonnements ionisants suivantes γH2AX

An early molecular response to DNA double-strand breaks (DSBs) is phosphorylation of the Ser-139 residue within the terminal SQEY motif of the histone ...

Assessment of Calcium Sparks in Intact Skeletal Muscle Fibers

Maintaining homeostatic Ca2+ signaling is a fundamental physiological process in living cells. Ca2+ sparks are the elementary units of Ca2+ signaling in the striated muscle fibers that appear as highly localized Ca2+ release events mediated by ryanodine receptor (RyR) Ca2+ release channels on the sarcoplasmic reticulum (SR) membrane. Proper assessment of muscle Ca2+ sparks could provide information on the intracellular Ca2+&#160;handling properties of healthy and diseased striated muscles. Although Ca2+ sparks events are commonly seen in resting cardiomyocytes, they are rarely observed in resting skeletal muscle fibers; thus there is a need for methods to generate and analyze sparks in skeletal muscle fibers.
Detailed here is an experimental protocol for measuring Ca2+ sparks in isolated flexor digitorm brevis (FDB) muscle fibers using fluorescent Ca2+ indictors and laser scanning confocal microscopy. In this approach, isolated FDB fibers are exposed to transient hypoosmotic stress followed by a return to isotonic physiological solution. Under these conditions, a robust Ca2+ sparks response is detected adjacent to the sarcolemmal membrane in young healthy FDB muscle fibers. Altered Ca2+ sparks response is detected in dystrophic or aged skeletal muscle fibers. This approach has recently demonstrated that membrane-delimited signaling involving cross-talk between inositol (1,4,5)-triphosphate receptor (IP3R) and RyR contributes to Ca2+ spark activation in skeletal muscle. In summary, our studies using osmotic stress induced Ca2+ sparks showed that this intracellular response reflects a muscle signaling mechanism in physiology and aging/disease states, including mouse models of muscle dystrophy (mdx mice) or amyotrophic lateral sclerosis (ALS model).

Described here is a method to directly measure calcium sparks, the elementary units of Ca2+ release from sarcoplasmic reticulum&#160;in intact skeletal muscle fibers. This method utilizes osmotic-stress-mediated triggering of Ca2+ release from ryanodine receptor in isolated muscle fibers. The dynamics and homeostatic capacity of intracellular Ca2+ signaling can be employed to assess muscle function in health and disease.

Évaluation de calcium Sparks dans intactes les fibres musculaires squelettiques

Maintaining homeostatic Ca2+ signaling is a fundamental physiological process in living cells. Ca2+ sparks are the elementary units of Ca2+ signaling in ...

Measurement of mRNA Decay Rates in Saccharomyces cerevisiae Using rpb1-1 Strains

mRNA steady state levels vary depending on environmental conditions. Regulation of the steady state accumulation levels of an mRNA ensures that the correct amount of protein is synthesized for the cell&#8217;s specific growth conditions. One approach for measuring mRNA decay rates is inhibiting transcription and subsequently monitoring the disappearance of the already present mRNA. The rate of mRNA decay can then be quantified, and an accurate half-life can be determined utilizing several techniques. In S. cerevisiae, protocols that measure mRNA half-lives have been developed and include inhibiting transcription of mRNA using strains that harbor a temperature sensitive allele of RNA polymerase II, rpb1-1. Other techniques for measuring mRNA half-lives include inhibiting transcription with transcriptional inhibitors such as thiolutin or 1,10-phenanthroline, or alternatively, by utilizing mRNAs that are under the control of a regulatable promoter such as the galactose inducible promoter and the TET-off system. Here, we describe measurement of S. cerevisiae mRNA decay rates using the temperature sensitive allele of RNA polymerase II. This technique can be used to measure mRNA decay rates of individual mRNAs or genome-wide.

Measurement of mRNA Decay Rates in Saccharomyces cerevisiae Using rpb1-1 Strains

The steady state level of specific mRNAs is determined by the rate of synthesis and decay of the mRNA. Genome-wide mRNA degradation rates or the decay rates of specific mRNAs can be measured by determining mRNA half-lives. This protocol focuses on measurement of mRNA decay rates in Saccharomyces cerevisiae.

Mesure de la dégradation de l&#39;ARNm Tarifs en<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em&gt; Utilisation<em&gt; Rpb1-1</em&gt; Les souches

mRNA steady state levels vary depending on environmental conditions. Regulation of the steady state accumulation levels of an mRNA ensures that the ...

Genetic and Biochemical Approaches for In Vivo and In Vitro Assessment of Protein Oligomerization: The Ryanodine Receptor Case Study

Oligomerization is often a structural requirement for proteins to accomplish their specific cellular function. For instance, tetramerization of the ryanodine receptor (RyR) is necessary for the formation of a functional Ca2+ release channel pore. Here, we describe detailed protocols for the assessment of protein self-association, including yeast two-hybrid (Y2H), co-immunoprecipitation (co-IP) and chemical cross-linking assays. In the Y2H system, protein self-interaction is detected by &#946;-galactosidase assay in yeast co-expressing GAL4 bait and target fusions of the test protein. Protein self-interaction is further assessed by co-IP using HA- and cMyc-tagged fusions of the test protein co-expressed in mammalian HEK293 cells. The precise stoichiometry of the protein homo-oligomer is examined by cross-linking and SDS-PAGE analysis following expression in HEK293 cells. Using these different but complementary techniques, we have consistently observed the self-association of the RyR N-terminal domain and demonstrated its intrinsic ability to form tetramers. These methods can be applied to protein-protein interaction and homo-oligomerization studies of other mammalian integral membrane proteins.

Genetic and Biochemical Approaches for In Vivo and In Vitro Assessment of Protein Oligomerization: The Ryanodine Receptor Case Study

Oligomerization of the ryanodine receptor, a homo-tetrameric ion channel mediating Ca2+ release from intracellular stores, is critical for skeletal and cardiac muscle contraction. Here, we present complementary in vivo and in vitro methods to detect protein self-association and determine homo-oligomer stoichiometry.

Approches génétiques et biochimiques pour<em&gt; In Vivo</em&gt; et<em&gt; In vitro</em&gt; Évaluation de Protein oligomérisation: Étude de cas Ryanodine Receptor

Oligomerization is often a structural requirement for proteins to accomplish their specific cellular function. For instance, tetramerization of the ...