Die Autoren bedanken sich bei Demêmes Danielle und Douglas Cotanche danken und für ihre Bemühungen in der Lehre uns die Methoden zur Isolierung von Corti-Organ. Darüber hinaus möchten wir Ishmael danken Stefanov-Wagner für das Engineering der Elektroporator Elektroden; Sherry Lin für ihre beitragen Grafik, um die Video-Animation, und Matthew Chana, Jason Meeker, und Kendra Marshall ( <a href="http://www.goodfightproductions.com">www.goodfightproductions.com</a> ) für die Produktion des Videos. Aus dem NIDCD Diese Arbeit wurde durch Stipendien (; RO1DC007174-Edge P30DC05209-MEEI Core Support für Hearing Research R03DC010065-Parker) finanziert.

Tag 1. Sterilisation und Beschichtung von Deckgläschen. <ol><li> Dry sterilisieren Glas-Deckgläsern in einem Autoklaven. </li><li> Setzen Sie den sterilisierten Deckgläschen in zwei Vertiefungen einer pre-sterilisiert vier gut Zellkulturschale. </li><li> Bestreichen Sie die Deckgläser mit 1:1 Poly-L-Ornithin und Laminin mit 20% fötalem Rinderserum (FBS) über Nacht bei 4 ° C ergänzt <ol class="lalpha"><li> 400 ul Poly-L-Ornithin (0,01% ige Lösung bei 4 ° C) </li><li> 400 ul Laminin (50 ug / ml Stammlösung in Aliquots bei -20 ° C gelagert) </li><li> 200 ul FBS (in Aliquots bei -20 ° C) </li></ol></li><li> Heat-Sterilisation die Zerlegung-Werkzeuge über Nacht in einem 150 ° C Inkubator. </li><li> Machen Kulturmedium mit 10% Serum und 10 mg / mL Ampicillin. <ol class="lalpha"><li> 90 ml Dulbecco Modified Eagle Medium </li><li> 5 ml FBS (in Aliquots bei -20 ° C) </li><li> 5 ml Pferdeserum (in Aliquots bei -20 ° C) </li><li> 10 l Ampicillin (10 mg / ml Stammlösung bei 4 ° C) </li></ol></li></ol> Tag 2. Die Isolierung des Corti-Organ. <ol><li> Sterilisieren Sie die positive flow Dissektion Kapuze. <ol class="lalpha"><li> wiederum auf UV-Licht für 20 min </li><li> Spray alle Oberflächen mit 70% Ethanol und warten Sie 5 min vor dem Gebrauch. </li></ol></li><li> Enthaupten Maus pup (P4) an der Basis des Foramen magnum mit Betriebssystem Schere. </li><li> Kurz spülen den Kopf in 10 cm Schüssel mit 70% Ethanol. </li><li> Entfernen Sie die Epidermis mit einem Skalpell. </li><li> Öffnen der Schädeldecke entlang der Sagittalnaht mit einem Skalpell und dann halbieren Vorderhirn. Bewahren Sie die Schwanzflosse Vorderhirn für die weitere Präparation. </li><li> Entfernen Sie das Vorderhirn, Kleinhirn und Hirnstamm mit stumpf. </li><li> Entfernen Sie den zeitlichen Knochen (Abb. 2A), tauchen sie kurz in 70% Ethanol, und übergeben sie an einem 3 mm Schale mit steriler HBSS. </li><li> Mit einer Pinzette entfernen Sie die Bulla und das umliegende Gewebe vor der Pars petrosa des Schläfenbeins. </li><li> Suchen Sie die Muschel geformt Cochlea (Abb. 2B) und trennen sie vom vestibulären System mit einer Pinzette. </li><li> In diesem Stadium der Entwicklung ist das knöcherne Labyrinth nicht vollständig verkalkt und ist leicht seziert mit einer Pinzette. Entfernen Sie die knöchernen Labyrinth der Cochlea durch sorgfältige Trennung ab dem basalen Ende und bewegt apikal mit einer Pinzette. </li><li> Das Ligamentum spirale und befestigt Corti-Organ befindet sich an der Spirale des Modiolus (Abb. 2C) gewickelt. Entfernen Sie vorsichtig das Corti-Organ durch die Sicherung der Ligamentum spirale am Haken Bereich des Bodens mit einer Pinzette und Abwickeln, wie Sie es apikal zu bewegen. </li><li> Beginnend an der Basis, entfernen Sie das Ligamentum spirale aus dem Corti-Organ mit Nr. 55 feinen Pinzette (Abb. 2D). Micro-Isolierung des Corti-Organ Sinnesepithel (Optional). </li><li> Entfernen Sie das Corti-Organ Haken Bereich der Basis mit zwei ½ cc Insulinspritzen mit fest angebrachten U-100 28G ½ Nadeln als Pinzette. </li><li> Beginnend an der Spitze, entfernen Sie die Spirale Limbus aus der Reihe der inneren Haarzellen und gehen basal (Abb. 2E-F). Plating Corti-Organ Explantation </li><li> Entfernen Sie die poly-L-ornithine/laminin/FBS Lösung aus dem Kultur-Wells und fügen 130 ul Kulturmedium. </li><li> Übertragen Sie die seziert Corti-Organ auf der beschichteten Deckglas in der Kultur gut und orientieren dem Explantat, so dass die Zilien der Haarzellen sind nach oben gerichtet. </li><li> Entfernen Sie das Medium in der Kultur auch mit einem 200-ul-Pipette. Stellen Sie sicher, dass die Basilarmembran festen Kontakt mit dem beschichteten Deckglas. </li><li> Vorsichtig 130 ul Kulturmedium der Corti-Organ mit einem 200-ml-Pipette. Tragen Sie zwei Tropfen auf die Oberfläche des Organs von Corti und dann langsam das restliche Volumen auf der Seite des Deckglases. Stellen Sie sicher, dass das Corti-Organ nicht in das Kulturmedium schwimmen, bleibt aber angebracht, um das Deckglas. </li><li> Inkubieren über Nacht bei 37 ° C in Anwesenheit von 5% CO 2. </li></ol> Tag 3. Elektroporation des Reportergens in kultivierte Corti-Organ. <ol><li> Entfernen Sie das Kulturmedium aus dem Corti-Organ Kultur. </li><li> Add 130 ul H 2 O für 1 min und entfernen Sie dann mit einem 200-ul-Pipette. </li><li> Add 30 ul DsRed Reporterplasmid (2 mg / mL H 2 O bei -20 ° C gelagert). </li><li> Schieben Sie die Elektroden des Elektroporator mit einem Mikromanipulator, so dass die Anode einnd Kathode sind auf beiden Seiten der Kultur. </li><li> Generieren Sie einen Impuls (27V, 30 ms Dauer, 10 Impulsfolgen) auf das Reporter-Gen in das Corti-Organ Explantation Kultur elektroporieren. <ol class="lalpha"><li> Optional: umpolen des Impulses der Elektroporation des Transgens sowohl auf der modiolar und Ligamentum spirale Seiten der Explantation zu gewährleisten. </li></ol></li><li> Warten Sie 5 min. </li><li> Add 130 ul der Fugene 6: DNA-Lösung (3 Teile Fugene zu 2 Teilen DNA). Diese Lösung sollte vor Beginn der Elektroporation (Schritt 20) mit einem 3 ml Rundboden Polystyrol Reagenzglas in einer Sterilbank vorbereitet werden. Zu dieser Lösung zu machen: <ol class="lalpha"><li> Add 2,4 ul der Opti-MEM (bei ​​4 ° C) in das Teströhrchen. </li><li> Add 0,6 ul der Fugene 6 Reagenz (bei 4 ° C) in das Teströhrchen. Achten Sie auf die Fugene direkt in die Opti-MEM und vermeiden Sie direkten Kontakt mit den Seiten des Reagenzglas. </li><li> Vortex für 1 Sekunde. </li><li> Inkubieren 5 min bei Raumtemperatur. </li><li> Fügen Sie 2,0 ul DsRed Reporterplasmid doppelsträngige DNA (bei ​​-20 ° C bei 100 ug DNA / mL H 2 O Aliquots). </li><li> Vortex für 1 Sekunde. </li><li> Inkubieren 15 min bei Raumtemperatur. </li><li> Geben Sie 200 ul Kulturmedium. </li><li> Vortex für 1 Sekunde. </li></ol></li><li> Inkubieren über Nacht bei 37 ° C in 5% CO 2. </li><li> Add 2 mL Kulturmedium, um die Kultur gut und Inkubation für 37 ° C für bis zu 10 Tage. </li></ol> Repräsentative Ergebnisse Wir stellen eine Methode zur Isolierung von Corti-Organ aus einer perinatalen Maus. Das Verfahren kann bei Mäusen im Alter von embryonalen Tag 16 bis etwa postnatalen Tag 6 verwendet werden, an welchem ​​Punkt der knöchernen Labyrinth ausreichend verkalkt zu machen das Sezieren umständlich. Sobald das Corti-Organ wird seziert, kann es überzogen und entweder in seiner Gesamtheit (Abb. 3) oder als Mikro-isoliert Sinnesepithel (Abb. 4) kultiviert werden. Wir haben weiter eine Technik, um exogene Gene in den kultivierten Organ Corti ausdrücken vorgestellt. Die organotypischen Kultur ist für viele andere Arten von Studien, wie die Analyse von Corti-Organ Genexpression mittels RT-PCR oder in situ Hybridisierung, Corti-Organ Co-Kultur mit Spirale Ganglienzellen oder exogene Stammzellen mit Hilfe der Mikro-Isolat nützlich 3, oder in vitro-Analyse von Haaren Zelltod und Regeneration. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1685/1685fig1.jpg"><img src="/files/ftp_upload/1685/1685fig1tmb.jpg" alt="Abbildung 1" border="0" /></a> Abbildung 1. Querschnitt der P4 murine Corti-Organ. (A) Ein Querschnitt aus der basalen Windung der Cochlea kryogeschnitten von einem P4 Maus erhalten veranschaulicht die allgemeinen Strukturen des murinen Cochlea in diesem Protokoll beschrieben. Die Scala media wird durch die Ligamentum spirale und Stria vascularis seitlich begrenzt, die Reissner Membran s superior, die Spirale Limbus medial und der Basilarmembran inferior. Die Box zeigte die Region in B. ausgebaut (B) Das Corti-Organ auf der überlegenen Seite der Basilarmembran befindet, und umfasst eine Reihe von inneren Haarzellen, drei Reihen von äußeren Haarzellen und ihre jeweiligen Stützzellen. Eine gestrichelte Linie 1 zeigt die Lage entlang der Basilarmembran, die während dieses Organ von Corti Dissektion entfernt wird. Eine gestrichelte Linie 2 zeigt die Lage entlang der Basilarmembran, die während der Mikro-Isolierung Verfahren entfernt wird. Grün bedeutet, immunhistochemische Markierung von Calbindin, die interdentalen Zellen der Spirale Limbus Haarzellen der Cochlea, Spiralganglions Neuronen, sowie Zellen des Ligamentum spirale und Stria vascularis 7 Etiketten. DAPI Kennzeichnung der Kerne ist in blau. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1685/1685fig2.jpg"><img src="/files/ftp_upload/1685/1685fig2tmb.jpg" alt="Abbildung 2" border="0" /></a> Abbildung 2. Corti-Organ Dissektion. Images aus den beigefügten Video des Corti-Organ Dissektion Highlight A) der Cochlea und vestibuläre System innerhalb der isolierten Schläfenbein (rot) befindet, B) das knöcherne Labyrinth der Cochlea, C) des Ligamentum spirale und die angeschlossenen Corti-Organ nach der Entfernung der knöchernen Labyrinth, D) Entfernung des Ligamentum spirale und Stria vascularis (rot) aus dem Corti-Organ, E) Mikro-Isolierung der Sinnesepithel aus der Spirale Limbus (rot) und F) die isoliert Spirale Limbus (links) und Sinnesepithel (rechts). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1685/1685fig3.jpg"><img src="/files/ftp_upload/1685/1685fig3tmb.jpg" alt="Abbildung 3" border="0" /></a> Abbildung 3. Cultured Corti-Organ Explantation. DIC Bild zeigt das Organ derCorti eines P4 Atoh1-nGFP Maus, isoliert, vergoldet, und kultiviert für fünf Tage, wie beschrieben wurde. Diese Maus wurde gentechnisch so, dass Zellen, die pro-Haarzelle exprimieren Atonal homolog 1 (Atoh1 aka Math1) weisen ein grün fluoreszierendes Protein, das den Kern 8 lokalisierte ist. Die Organe des Corti aus diesen Mäusen zeigen eine nukleare GFP-Markierung in allen Haar Zellkerne und ermöglichen somit eine einfache Visualisierung der Sinnesepithel mit einer epifluoreszenten Mikroskop. Die relativ große Spirale Limbus sichtbar seitlich der Sinnesepithel werden. Mesenchymalen Zellen, die aus dem Corti-Organ entstanden sein müssen weg von dem Explantat migriert. Blau nuklearen Etikett DAPI. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1685/1685fig4.jpg"><img src="/files/ftp_upload/1685/1685fig4tmb.jpg" alt="Abbildung 4" border="0" /></a> Abbildung 4. Micro-isoliert Sinnesepithel. Epifluoreszenz Bild aus dem Sinnesepithel, die von einem P4 murine Corti-Organ wurde wie beschrieben isoliert und über Nacht erhalten. Die Mikro-Isolat wurde dann in 4% Paraformaldehyd fixiert und für die Immunomarkierung von Myosin 7a, die Haarzellen der Cochlea-Etiketten. Beachten Sie das Fehlen der vergleichsweise größeren Spirale Limbus aus der Abbildung 3 dargestellt. Blau nuklearen Etikett DAPI. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1685/1685fig5.jpg"><img src="/files/ftp_upload/1685/1685fig5tmb.jpg" alt="Abbildung 5" border="0" /></a> Abbildung 5. Elektroporation von DsRed Reportergen in den kultivierten Corti-Organ. Whole Organe des Corti von P4 Atoh1-nGFP Maus Welpen wurden isoliert, vernickelt und dann mit dem Reportergen DsRed wie beschrieben und dann unter einem Mikroskop betrachtet epifluoreszenten elektroporiert. Zellen des Corti-Organ Explantation, dass die transgenen DsRed Reporter exprimiert zeigen eine rote Fluoreszenz und körpereigenen Zellen des Sinnesepithel weisen eine grüne Kernfluoreszenz. Transgene Zellen können durch die Spirale Limbus und Sinnesepithel gesehen werden.

<ol>
	<li>Sobkowicz, H. M., Bereman, B., Rose, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organotypic+Development+of+the+Organ+of+Corti+in+Culture.">Organotypic Development of the Organ of Corti in Culture.</a> Journal of Neurocytology. 119 (4), 543-543 (1975).</li><li>Zheng, J. L., Gao, W. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overexpression+of+Math1+induces+robust+production+of+extra+hair+cells+in+postnatal+rat+inner+ears.">Overexpression of Math1 induces robust production of extra hair cells in postnatal rat inner ears.</a> Nature Neuroscience. 3 (6), 580-580 (2000).</li><li>Martinez-Monedero, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=THE+POTENTIAL+ROLE+OF+ENDOGENOUS+STEM+CELLS+IN+REGENERATION+OF+THE+INNER+EAR.">THE POTENTIAL ROLE OF ENDOGENOUS STEM CELLS IN REGENERATION OF THE INNER EAR.</a> J Neurobiol. 66 (4), 319-319 (2006).</li><li>Saffer, L. D., Gu, R., Corwin, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+RT-PCR+analysis+of+mRNA+for+growth+factor+receptors+in+damaged+and+control+sensory+epithelia+of+rat+utricles.">An RT-PCR analysis of mRNA for growth factor receptors in damaged and control sensory epithelia of rat utricles.</a> Hearing Research. 94 (1,2), 14-14 (1996).</li><li>Zhang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation,+growth+and+differentiation+of+hair+cell+progenitors+from+the+newborn+rat+cochlear+greater+epithelial+ridge.">Isolation, growth and differentiation of hair cell progenitors from the newborn rat cochlear greater epithelial ridge.</a> Journal of Neuroscience Methods. 164 (2), 271-271 (2007).</li><li>Jones, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibitors+of+Differentiation+and+DNA+Binding+(Ids)+Regulate+Math1+and+Hair+Cell+Formation+during+the+Development+of+the+Organ+of+Corti.">Inhibitors of Differentiation and DNA Binding (Ids) Regulate Math1 and Hair Cell Formation during the Development of the Organ of Corti.</a> J. Neurosci. 26 (2), 550-550 (2006).</li><li>Daniela, B., Josef, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calbindin+and+S100+protein+expression+in+the+developing+inner+ear+in+mice.">Calbindin and S100 protein expression in the developing inner ear in mice.</a> The Journal of Comparative Neurology. 513 (5), 469-469 (2009).</li><li>Helms, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autoregulation+and+multiple+enhancers+control+Math1+expression+in+the+developing+nervous+system.">Autoregulation and multiple enhancers control Math1 expression in the developing nervous system.</a> Development. 127 (6), 1185-1185 (2000).</li><li>Zheng, J. L., Wei-Qiang, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+Damage+to+Auditory+Neurons+and+Hair+Cells+by+Ototoxins+and+Neuroprotection+by+Specific+Neurotrophins+in+Rat+Cochlear+Organotypic+Cultures.">Differential Damage to Auditory Neurons and Hair Cells by Ototoxins and Neuroprotection by Specific Neurotrophins in Rat Cochlear Organotypic Cultures.</a> European Journal of Neuroscience. 8 (9), 1897-1897 (1996).</li></ol>

Es gibt mehrere Details, die entscheidend für den Erfolg dieses Verfahrens sind. Je kürzer die Zeit vom Schläfenbein Trennung nach Corti-Organ Inkubationszeit, desto größer ist die Chance, dass die Organe werden dem Deckglas und Ergebnis in tragfähige Organkulturen befestigen. Deshalb ist es wichtig, die Zeitspanne zwischen Präparation und Platzierung der Organe in den Inkubator zu begrenzen. Die Wahl des Antibiotikums ist auch entscheidend, da viele Aminoglycosidantibiotika ototoxischen sind und bleiben im Haar zum Zelltod führen. Obwohl es vorzuziehen ist, den Einsatz von Antibiotika gänzlich zu verzichten, lässt diese die Möglichkeit offen, für Verunreinigungen. Daher empfehlen wir die Verwendung von 10 pg / mL Ampicillin in der Regel auf eine mögliche Kontamination Probleme zu überwinden. Die am schwierigsten Aspekt dieses und andere Verfahren für die primäre Kultur des Corti-Organ, ist die Tendenz der Organe zu schweben von den Platten während der Inkubation. Obwohl schwimmenden Organkulturen, kann es für 5-7 Tage lebensfähig, es gibt auch Nachteile der Kultivierung schwimmenden Organe. Zum Beispiel, schwimmende Organkulturen oft folden auf sich selbst nach 4-5 Tagen Rendering-Mikroskopie problematisch. Anschließend kann die strukturelle Integrität des Organs beeinträchtigt, wenn die Organe, die dem Deckglas angebracht worden ist verglichen zu werden. Wir haben festgestellt, dass die folgenden Techniken, um sicherzustellen, dass das Corti-Organ nicht in den Kulturmedien float helfen, bleibt aber auf dem Deckglas fixiert. Zunächst beschichten Deckgläschen in 1:1 Polyornithin / Laminin mit 20% FBS, wie beschrieben ergänzt. Die Inkubation über Nacht in diesem Protokoll genannten ist die minimale Zeit, dass die Platte beschichtet werden sollen. In unserem Labor haben wir oft Mantel alle Platten, die wir brauchen für eine Woche und halten sie bei 4 ° C bis zu dem Tag vor dem Gebrauch, wenn wir sie bewegen den Inkubator für eine Inkubation über Nacht. Zweitens, nachdem die Organe sind, um die beschichteten Deckgläsern transportiert, orient dem Explantat, so dass die Zilien der Haarzellen bis Gesicht. Diese Orientierung erleichtern die Einhaltung der Basilarmembran der Kulturschale. Drittens, entfernen Sie die Medien in der auch das Anbringen der Explantation zu den beschichteten Gericht. Dadurch wird sichergestellt, den Kontakt zwischen der Kulturschale und der Basilarmembran und verbessern die Fähigkeit der Explantate auf dem Glas haften. Dies wird auch bei der Aufrechterhaltung der strukturellen Integrität der Reihen von Haarzellen zu unterstützen. Schließlich sorgfältig abtropfen 2 Tropfen Kulturmedium auf die Oberfläche des Corti-Organ mit einer 200 ul Kapazität Pipette und dann langsam füllen Sie das auch von tropfenden das restliche Volumen (der insgesamt 130 ul) auf der Seite des Deckglases. Es ist wichtig, schnell zu arbeiten, um die Befestigung des Corti-Organ auf der beschichteten Deckglas zu gewährleisten. Von der Einleitung der Dissektion der Inkubation der Explantate, es dauert normalerweise 10 Minuten für einen geübten Bediener dieses Organ von Corti Trennung abzuschließen. In diesem Protokoll, stellen wir auch ein Verfahren zur Mikro-Isolierung der Sinnesepithel aus der Spirale Limbus des Corti-Organ. In diesem Verfahren wird die Spirale Limbus vom Sinnesepithel mit 28G seziert ½ Insulin Nadeln Dissektion Werkzeuge. Die daraus resultierenden Mikro-Isolat besteht aus den Reihen der Haarzellen und die entsprechenden Stützzellen (Abb. 3). Die isolierte Sinnesepithel können dann kultiviert wie in diesem Protokoll beschrieben werden. Diese Mikro-Isolierung Verfahren sollte für die enzymatische Trennung der Sinnesepithelien aus den umliegenden Gewebe 4 verglichen werden. In Säugetieren, wie auch Nicht-Säuger-Arten wie Hühner, Thermolysin Verdauung der isolierten Vestibularorgane Ergebnisse bei der Isolierung von Sinnesepithelien aus dem Keller mesenchymalen Zellen 4. In der Ratte Cochlea, Thermolysin Verdauung Ergebnisse bei der Trennung von der größeren Epithelkamm, weniger Epithelkamm und begleitende Sinnesepithelien von der Basalmembran 5. Es ist jedoch unklar, ob die Cochlea Sinnesepithel können die beschichteten Platten ohne die begleitende mesenchymalen Zellen anzuhängen. Während sowohl die mechanischen Mikro-Isolation-Methode und enzymatische Verdauung Ergebnis der Methode in der Trennung der Sinnesepithelien aus der Spirale Limbus Vorteile der Mikro-Isolat Dissektion über die Thermolysin Verdauung eine relativ kürzere Protokoll, billiger Reagenzien und potentiell weniger Stress dem Explantat durch enzymatische Wirkung der Verdauung. Darüber hinaus ist die Basalmembran intakt gelassen, in diesem Ansatz, der kann Befestigung der Sinnesepithel der Kulturplatte zu verbessern. Nachteile dieser Methode sind die Notwendigkeit, die Fähigkeiten für diese heikle Dissektion und mögliche mechanische Beschädigung der Sinnesepithel aus der Mikrodissektion zu entwickeln. Als ein Beispiel für die Nützlichkeit dieses Verfahrens stellen wir auch ein Beispiel für die Verwendung der Orgel vonCorti Kulturen, die Elektroporation von exogenen Genen in dem Explantat Kultur. Die Elektroporation oben beschriebene Verfahren basiert auf den bisherigen Methoden der Corti-Organ Elektroporation basiert. Bemerkenswert ist, beschreiben Zheng und Gao (2000), die Elektroporation von isolierten Ratten-Organen Corti, wo die Explantate in Platz für die Elektroporation werden durch eine geformte Nut Agarose gehalten und dann auf Kollagen beschichtet 8-well LabTek Folie in serum-freiem Medium 2 beschichtet. Ein Vorteil ihres Ansatzes ist, dass die Organe so orientiert, dass die Oberseiten der Explantate der Kathode, die theoretisch in eine gleichmäßige Verteilung der Elektroporation Zellen in der Explantation sollte Ergebnis Gesicht. In unseren Händen jedoch die Methode, die wir beschreiben, auf dieses Verfahren verbessert, weil das Corti-Organ blieb angebracht, die Deckglas während des gesamten Verfahrens wodurch die Manipulation der Explantation nach der Elektroporation. Darüber hinaus blieb ein höherer Prozentsatz von Organen Corti die Deckgläser mit dieser vorgestellten Methode angebracht. Unsere Methode ist von Jones, et al. (2006) mit dem Zusatz der Fugene 6 Reagenz verwendet, um die Effizienz der Gen-Expression nach der Elektroporation erhöhen übernommen. In der Jones et al. (2006)-Protokoll, sind die Organe elektroporiert, inkubiert für 5 Minuten mit 100 ul Fugene 6 Transfektionsreagenz und vernickelt 6. Unsere Methode unterscheidet sich in der Verwendung eines 3:2-Verhältnis von Fugene 6 Reagenz Plasmid-DNA, die wir empirisch gefundene optimale transgene Expression mit einem Minimum an Toxizität liefern. Wir wollen nicht unverdünnt anwenden Fugene 6 Reagenz, das kann in der Toxizität der Kulturen führen. Die Elektroden-Konfiguration in unserem Protokoll, sowie Jones et al. (2006), Ergebnisse in primären Genexpression entweder in der Spirale Limbus oder Sinnesepithel abhängig von der Position der Kathode. Obwohl es DsRed-positive Zellen auf der Seite der Kultur fern der Kathode sind, gibt es eine höhere Konzentration von transgenen Zellen näher an der Kathode. Um eine vollständige Expression des Transgens in beiden Seiten des Corti-Organ Explantation, kann der Strom für eine zweite Impulsfolge durch einfaches Umdrehen der führt rückgängig gemacht werden. Das vorgestellte Protokoll Ergebnis sind robuste Expression des Transgens während der Corti-Organ (Abb. 5).

<table border="1">
	<thead>
		<tr>
			<th>Material Name</th>
			<th>Type</th>
			<th>Company</th>
			<th>Catalogue Number</th>
			<th>Comment</th>
		</tr>
	</thead>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Glass microscope coverslips</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>DYNALAB Corporation (Rochester, NY)</td>
			<td>2010</td>
			<td>10mm diameter, circle #1, 1mm thickness, 1 ounce</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4 ringed cell culture dish</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Greiner Bio-One (Frickenhausen, Germany)</td>
			<td>627170</td>
			<td>Sterilized 35 X 10 mm cell culture dish with 4 inner rings</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-L-ornithine</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Sigma-Aldrich Company (St. Louis, MO)</td>
			<td>P4957</td>
			<td>0.01% Solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laminin</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>BD Biosciences (Franklin Lakes, NJ) </td>
			<td>354232</td>
			<td>made in mouse</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Invitrogen (Carlsbad, CA)</td>
			<td>26140-095</td>
			<td>Qualified</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Operating scissors</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Roboz Surgical Instrument Co. (Gaithersburg, MD)</td>
			<td>RS-6806</td>
			<td>Straight, sharp-blunt length 5"</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>#11 Scalpel Blade</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Becton Dickenson (Franklin Lakes, NJ)</td>
			<td>372611</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>#4 Dumoxel forceps</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Fine Science Tools (Foster City, CA)</td>
			<td>11241-30</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>#55 Dumostar fine forceps</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Fine Science Tools (Foster City, CA)</td>
			<td>11295-51</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco's Modified Eagle Medium </td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Invitrogen (Carlsbad, CA)</td>
			<td>10564-011</td>
			<td>High Glucose</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Horse Serum</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Invitrogen (Carlsbad, CA)</td>
			<td>2605088</td>
			<td>Heat Inactivated</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ampicillin Sodium Salt </td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Invitrogen (Carlsbad, CA)</td>
			<td>11593-027</td>
			<td>Irradiated</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&frac12; cc Lo-Dose Insulin Syringe </td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Becton Dickenson (Franklin Lakes, NJ)</td>
			<td>329465</td>
			<td>U-100 28G&frac12;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fugene 6 Transfection Reagent</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Roche (Mannheim, Germany)</td>
			<td>11-815-091-001</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polystyrene test tube</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Fisher Scientific (Pittsburgh, PA)</td>
			<td>14-956-5A</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laminar flow hood</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>The Baker Company (Stanford, ME)</td>
			<td>Model SG603a</td>
			<td>SterileGARD III 
				Advanced Class II 
				Biological Safety Cabinet</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opti-MEM I Reduced-Serum Medium</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Invitrogen (Carlsbad, CA)</td>
			<td>31985</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reporter plasmid</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Clontech (Mountain View, CA)</td>
			<td>632539</td>
			<td>pCMV DsRed-Express 2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electroporator</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>BioRad (Hercules, CA)</td>
			<td>165&#x2013;2662</td>
			<td>BioRad Gene Pulser Xcell</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

primary culture and plasmid electroporation of the murine organ of corti. 

In allen Säugetieren ist das Sinnesepithel für Vorsprechen an der Spirale des Corti-Organs, die innerhalb der Muschel geformt Cochlea des Innenohres (Abb. 1) befindet sich befindet. Haarzellen in der Cochlea zu entwickeln, die die mechanosensorischen Zellen des auditorischen Systems sind, sind in einer Reihe von inneren Haarzellen und drei (in der Basis und Mitte dreht) bis vier (in der apikalen turn) Reihen von äußeren Haarzellen ausgerichtet dass span die Länge des Corti-Organ. Haarzellen transduzieren Sound-induzierten mechanischen Schwingungen der Basilarmembran in Nervenimpulse, die das Gehirn interpretiert werden können. Die meisten Fälle von Hörverlust sind durch den Tod oder eine Dysfunktion der Haarzellen der Cochlea verursacht. Ein zunehmend wichtiges Instrument im auditorischen Forschung ist die Isolierung und in vitro-Kultur der Orgel Explantation 1,2,9. Einmal isoliert, kann die Explantate in mehrere Möglichkeiten, um Informationen über normative, anomale oder therapeutischen Physiologie bieten genutzt werden. Die Genexpression, Stereozilien Motilität, Zell-und Molekularbiologie sowie biologische Ansätze für die Haare Zellregeneration sind Beispiele für experimentelle Anwendungen von Corti-Organ Explantate. Dieses Protokoll beschreibt eine Methode zur Isolierung und Kultivierung von Corti-Organ von neugeborenen Mäusen. Das dazugehörige Video enthält schrittweise Anweisungen für die Isolierung des Felsenbeins aus Maus-Welpen, und anschließender Isolierung der Cochlea, Ligamentum spirale und des Cortischen Organs. Einmal isoliert, kann das sensorische Epithel überzogen und werden in vitro kultiviert in seiner Gesamtheit, oder als eine weitere seziert Mikro-Isolat, das fehlt der Spirale Limbus und Spiralganglions Neuronen. Mit dieser Methode können primäre Explantate für 7-10 Tage aufrechterhalten werden. Als ein Beispiel für die Nützlichkeit dieses Verfahrens wird Corti-Organ Explantate mit einem exogenen DsRed Reportergen elektroporiert werden. Diese Methode stellt eine Verbesserung gegenüber anderen publizierten Methoden, weil sie reproduzierbar, eindeutig und schrittweise Anweisungen für die Isolierung, Mikrodissektion und primären Kultur des Corti-Organ zur Verfügung stellt.

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Primary Culture and Plasmid Electroporation of the Murine Organ of Corti.

Dieses Verfahren beschreibt eine Methode zur Isolierung und Kultivierung der murinen Corti-Organ mit oder ohne die Spirale Limbus und Spiralganglions Neuronen. Wir zeigen auch ein Verfahren zur Expression eines exogenen Reporter-Gen in das Corti-Organ Explantat durch Elektroporation.

Primäre Kultur und Plasmid Elektroporation der Murine Corti-Organ.

In all mammals, the sensory epithelium for audition is located along the spiraling organ of Corti that resides within the conch shaped cochlea of the ...

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Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biology

Primary Culture and Plasmid Electroporation of the Murine Organ of Corti. 

25.8K Aufrufe.  Harvard Medical School. Dieses Verfahren beschreibt eine Methode zur Isolierung und Kultivierung der murinen Corti-Organ mit oder ohne die Spirale Limbus und Spiralganglions Neuronen. Wir zeigen auch ein Verfahren zur Expression eines exogenen Reporter-Gen in das Corti-Organ Explantat durch Elektroporation.

Serie: Primary Culture and Plasmid Electroporation of the Murine Organ of Corti.

Electroporation of Mycobacteria

High efficiency transformation is a major limitation in the study of mycobacteria. The genus Mycobacterium can be difficult to transform; this is mainly caused by the thick and waxy cell wall, but is compounded by the fact that most molecular techniques have been developed for distantly-related species such as Escherichia coli and Bacillus subtilis. In spite of these obstacles, mycobacterial plasmids have been identified and DNA transformation of many mycobacterial species have now been described. The most successful method for introducing DNA into mycobacteria is electroporation. Many parameters contribute to successful transformation; these include the species/strain, the nature of the transforming DNA, the selectable marker used, the growth medium, and the  conditions for the electroporation pulse. Optimized methods for the transformation of both slow- and fast-grower are detailed here. Transformation efficiencies for different mycobacterial species and with various selectable markers are reported.

Mycobacterial pathogenic strategies remain poorly understood. The slow growth rate of most species, the impenetrable nature of the cell-wall, and the hazards of working with pathogens make mycobacteria difficult to study and are largely responsible for our poor understanding of these organisms. In this video we will demonstrate the technique of electroporation, which involves subjecting cells to a brief high electrical impulse to allow the entry of DNA. It is the most widely used method for introducing DNA into mycobacterial cells.

Elektroporation von Mykobakterien

High efficiency transformation is a major limitation in the study of mycobacteria. The genus Mycobacterium can be difficult to transform; this is mainly ...

Forschung

Biologie

The Preparation of Primary Hematopoietic Cell Cultures From Murine Bone Marrow for Electroporation

It is becoming increasingly apparent that electroporation is the most effective way to introduce plasmid DNA or siRNA into primary cells. The Gene Pulser MXcell  electroporation system and Gene Pulser  electroporation buffer were specifically developed to transfect nucleic acids into mammalian cells and difficult-to-transfect cells, such as primary and stem cells.This video demonstrates how to establish primary hematopoietic cell cultures from murine bone marrow, and then prepare them for electroporation in the MXcell system. We begin by isolating femur and tibia. Bone marrow from both femur and tibia are then harvested and cultures are established. Cultured bone marrow cells are then transfected and analyzed.

This procedure describes how to establish primary hematopoietic cell cultures from murine bone marrow and is followed by transfection using the Gene Pulser MXCell electroporation system.

Die Herstellung von primären hämatopoetischen Zellkulturen aus Knochenmark der Maus für die Elektroporation

It is becoming increasingly apparent that electroporation is the most effective way to introduce plasmid DNA or siRNA into primary cells. The Gene Pulser ...

Primary Culture of Adult Rat Heart Myocytes

Cultured primary adult rodent heart cells are an important model system for cardiovascular research. Nevertheless, establishment of robust, viable cultured adult myocytes can be a technically challenging, rate-limiting step for many researchers. Here we described a protocol to obtain a high yield of adult rat heart myocytes that remain viable in culture for several days. The heart is isolated and perfused with collagenase and protease under low Ca2+ conditions to recover single myocytes. Ca2+-tolerant cells are obtained by stepwise increases in extracellular Ca2+ concentration in three subsequent wash steps. Cells are filtered, resuspended in culture medium, and plated on laminin coated slips. Cultured myocytes obtained using this protocol are viable for up to four days and are suitable for most experiments including electrophysiology, biochemistry, imaging and molecular biology.

In this paper, we described a typical way to isolate and culture adult rat heart myocytes. Collagenase and protease are used to digest and isolate single myocytes. Myocytes cultured follow this protocol meet most experiment requirements.

Primäre Kultur der erwachsenen Ratte Herz Myozyten

Cultured primary adult rodent heart cells are an important model system for cardiovascular research.  Nevertheless, establishment of robust, viable ...

Isolation and Primary Culture of Rat Hepatic Cells

Primary hepatocyte culture is a valuable tool that has been extensively used in basic research of liver function, disease, pathophysiology, pharmacology and other related subjects. The method based on two-step collagenase perfusion for isolation of intact hepatocytes was first introduced by Berry and Friend in 1969 1 and, since then, has undergone many modifications. The most commonly used technique was described by Seglenin 1976 2. Essentially, hepatocytes are dissociated from anesthetized adult rats by a non-recirculating collagenase perfusion through the portal vein. The isolated cells are then filtered through a 100 &mu;m pore size mesh nylon filter, and cultured onto plates. After 4-hour culture, the medium is replaced with serum-containing or serum-free medium, e.g. HepatoZYME-SFM, for additional time to culture. These procedures require surgical and sterile culture steps that can be better demonstrated by video than by text. Here, we document the detailed steps for these procedures by both video and written protocol, which allow consistently in the generation of viable hepatocytes in large numbers.

Primary hepatocytes provide a valuable tool to evaluate biochemical, molecular, and metabolic functions in a physiologically relevant experimental system. We describe a reliable protocol for rat in situ liver perfusion, which consistently generates viable hepatocytes up to 1.0 &times; 108 cells per preparation with cell viability between 88 ~ 96%.

Isolierung und Primärkultur von Ratten Leberzellen

Primary hepatocyte culture is a valuable tool that has been extensively used in basic research of liver function, disease, pathophysiology, pharmacology ...

Isolation and Culture of Mouse Primary Pancreatic Acinar Cells

This protocol permits rapid isolation (in less than 1 hr) of murine pancreatic acini, making it possible to maintain them in culture for more than one week. More than 20 x 106 acinar cells can be obtained from a single murine pancreas. This protocol offers the possibility to independently process as many as 10 pancreases in parallel. Because it preserves acinar architecture, this model is well suited for studying the physiology of the exocrine pancreas in vitro in contrast to cell lines established from pancreatic tumors, which display many genetic alterations resulting in partial or total loss of their acinar differentiation.

In this publication, we describe a rapid and convenient procedure for isolating and culturing primary pancreatic acinar cells from the murine pancreas. This method constitutes a valuable approach to study the physiology of fresh primary normal/untransformed exocrine pancreatic cells.

Isolierung und Kultivierung von primären Maus Azinuszellen des Pankreas

This protocol permits rapid isolation (in less than 1 hr) of murine pancreatic acini, making it possible to maintain them in culture for more than one ...

Isolation and Primary Culture of Mouse Aortic Endothelial Cells

The vascular endothelium is essential to normal vascular homeostasis. Its dysfunction participates in various cardiovascular disorders. The mouse is an important model for cardiovascular disease research. This study demonstrates a simple method to isolate and culture endothelial cells from the mouse aorta without any special equipment. To isolate endothelial cells, the thoracic aorta is quickly removed from the mouse body, and the attached adipose tissue and connective tissue are removed from the aorta. The aorta is cut into 1 mm rings. Each aortic ring is opened and seeded onto a growth factor reduced matrix with the endothelium facing down. The segments are cultured in endothelial cell growth medium for about 4 days. The endothelial sprouting starts as early as day 2. The segments are then removed and the cells are cultured continually until they reach confluence. The endothelial cells are harvested using neutral proteinase and cultured in endothelial cell growth medium for another two passages before being used for experiments. Immunofluorescence staining indicated that after the second passage the majority of cells were double positive for Dil-ac-LDL uptake, Lectin binding, and CD31 staining, the typical characteristics of endothelial cells. It is suggested that cells at the second to third passages are suitable for in vitro and in vivo experiments to study the endothelial biology. Our protocol provides an effective means of identifying specific cellular and molecular mechanisms in endothelial cell physiopathology.

The vascular endothelial cells play a significant role in many important cardiovascular disorders. This article describes a simple method to isolate and expand endothelial cells from the mouse aorta without using any special equipment. Our protocol provides an effective means of identifying mechanisms in endothelial cell physiopathology.

Isolation und Primärkultur von Maus Aortic Endothelial Cells

The vascular endothelium is essential to normal vascular homeostasis. Its dysfunction participates in various cardiovascular disorders. The mouse is an ...

Novel Method of Plasmid DNA Delivery to Mouse Bladder Urothelium by Electroporation

Genetically engineered mouse models (GEMMs) are extremely valuable in revealing novel biological insights into the initiation and progression mechanisms of human diseases such as cancer. Transgenic and conditional knockout mice have been frequently used for gene overexpression or ablation in specific tissues or cell types in vivo. However, generating germline mouse models can be time-consuming and costly. Recent advancements in gene editing technologies and the feasibility of delivering DNA plasmids by viral infection have enabled rapid generation of non-germline autochthonous mouse cancer models for several organs. The bladder is an organ that has been difficult for viral vectors to access, due to the presence of a glycosaminoglycan layer covering the urothelium. Here, we describe a novel method developed in lab for efficient delivery of DNA plasmids into the mouse bladder urothelium in vivo. Through intravesical instillation of pCAG-GFP DNA plasmid and electroporation of surgically exposed bladder, we show that the DNA plasmid can be delivered specifically into the bladder urothelial cells for transient expression. Our method provides a fast and convenient way for overexpression and knockdown of genes in the mouse bladder, and can be applied to building GEMMs of bladder cancer and other urological diseases.

We describe a novel method for the delivery of DNA plasmid into the urothelial cells of mouse bladder in vivo through urethra catheterization and electroporation. It offers a fast and convenient way for generating autochthonous mouse models of bladder diseases.

Neuartige Methode der Transport der Plasmid-DNA zu Maus Blase Urothel durch Elektroporation

Genetically engineered mouse models (GEMMs) are extremely valuable in revealing novel biological insights into the initiation and progression mechanisms ...

Primary Culture of Rat Adrenocortical Cells and Assays of Steroidogenic Functions

The hormone which the adrenal cortex secretes is vital for animals against stress and diseases. The method described here is the procedure of primary cultured rat adrenal cells and related functional assays (immunofluorescence staining of lipid droplet surface protein, as well as corticosterone analysis). Unlike an in vivo model, the variation of interexperiments in adrenal monolayer cultures is less and the experimental condition is easy to control. Besides, the source of rats is also more stable than other animals, like bovine ones. There are also several human adrenal cell lines (NCI-H295, NCI-H295R, SW13, etc.) that can be used in adrenal studies. However, the steroid production of these lines will still be influenced by numerous factors, which include serum lot number, passage number, mutant/loss of distinct genes, etc. Except for lacking 17&#945;-hydroxylase, the primary culture of rat adrenocortical cells is a better and more convenient technique for studying adrenal physiology. In summary, primary rat adrenal cultures could be a good in vitro platform for researchers to investigate the mechanisms of the reagent of interest in the adrenal gland system.

The hormone secreted by the adrenal cortex is vital for animals against stress and diseases. Here, we present a protocol to culture the primary rat adrenal cells. It could be a good in vitro platform for investigating the mechanisms of the reagent of interest in adrenal steroidogenesis and lipid biosynthesis.

Primärkultur von Ratte Nebennierenrindeninsuffizienz Zellen und Assays Steroidogenic Funktionen

The hormone which the adrenal cortex secretes is vital for animals against stress and diseases. The method described here is the procedure of primary ...

Isolation and Culture of Primary Oral Keratinocytes from the Adult Mouse Palate

For years, most studies involving keratinocytes have been conducted using human and mouse skin epidermal keratinocytes. Recently, oral keratinocytes have attracted attention because of their unique function and characteristics. They maintain the homeostasis of the oral epithelium and serve as resources for applications in regenerative therapies. However, in vitro studies that use oral primary keratinocytes from adult mice have been limited due to the lack of an efficient and well-established culture protocol. Here, oral primary keratinocytes were isolated from the palate tissues of adult mice and cultured in a commercial low-calcium medium supplemented with a chelexed-serum. Under these conditions, keratinocytes were maintained in a proliferative or stem cell-like state, and their differentiation was inhibited even after increased passages. Marker expression analysis showed that the cultured oral keratinocytes expressed the basal cell markers p63, K14, and &#945;6-integrin and were negative for the differentiation marker K13 and the fibroblast marker PDGFR&#945;. This method produced viable and culturable cells suitable for downstream applications in the study of oral epithelial stem cell functions in vitro.

The present protocol describes the isolation and culture of oral keratinocytes derived from the adult mouse palate. An evaluation method using immunostaining is also reported.

Isolierung und Kultur von primären oralen Keratinozyten aus dem erwachsenen Mausgaumen

For years, most studies involving keratinocytes have been conducted using human and mouse skin epidermal keratinocytes. Recently, oral keratinocytes have ...

Electroporation of Plasmid DNA into Mouse Skeletal Muscle

Transient gene expression modulation in murine skeletal muscle by plasmid electroporation is a useful tool for assessing normal and pathological physiology. Overexpression or knockdown of target genes enables investigators to manipulate individual molecular events and, thus, better understand the mechanisms that impact muscle mass, muscle metabolism, and contractility. In addition, electroporation of DNA plasmids that encode fluorescent tags allows investigators to measure changes in subcellular localization of proteins in skeletal muscle in vivo. A key functional assessment of skeletal muscle includes the measurement of muscle contractility. In this protocol, we demonstrate that whole muscle contractility studies are still possible after plasmid DNA injection, electroporation, and gene expression modulation. The goal of this instructional procedure is to demonstrate the step-by-step method of DNA plasmid electroporation into mouse skeletal muscle to facilitate uptake and expression in the myofibers of the tibialis anterior and extensor digitorum longus muscles, as well as to demonstrate that skeletal muscle contractility is not compromised by injection and electroporation.

Electroporation of plasmid DNA into skeletal muscle is a viable method to modulate gene expression without compromising muscle contractility in mice.