Dieses Protokoll beinhaltet einen unkomplizierten Ansatz zur Optimierung von Kulturschritten, zur Gewinnung hochwertiger Explantaten und wird zur Erforschung und Enthüllung molekularer Mechanismen von Cochlea-Zellen beitragen. Der Hauptvorteil dieser Technik ist die minimale direkte Organhandhabung durch die Koordination der Dissektionsschritte, die geeignete Polymeroberflächenbeschichtung, das optimierte mittlere Volumen und die Anheftungszeit der Explantate. Diese Technik stellt einen beliebten In-vitro-Ansatz zur Untersuchung von Schallempfindungsschwerhörigkeit dar.
Dies kann verwendet werden, um ototoxische Modelle zu erstellen, Strukturanalysen durchzuführen, Signalwege zu bewerten und Wirkstoff-Screening-Studien durchzuführen. Prinzipiell kann diese Methode auf verschiedene Gewebeexplantate angewendet werden. Es kann auch in der Innenohrforschung eingesetzt werden, um Einblicke in embryonale Entwicklungsstadien zu erhalten.
Zu Beginn legst du den Kopf der geköpften Ratte auf das sterile Pad. Verwende Schere und Pinzette, um den Unterkiefer zu entfernen, dann hebe die Haut an und ziehe sie vom Schädel ab. Platzieren Sie die Pinzette in den Augenhöhlen, um den Schädel zu halten.
Mit einer scharfen Skalpellklinge den Schädel vorsichtig entlang der sagittalen Naht und dann im koronalen Nahtbereich durchtrennen, ohne die Cochlea zu beschädigen. Entferne nun das Gehirn aus den beiden Schädelhälften. Lokalisieren Sie unter dem Mikroskop die Cochlea im Schläfenbein und lockern Sie das umliegende Gewebe zwischen Cochlea und Schläfenbein.
Legen Sie dann die Pinzette in den oberen Bogengang. Ziehen Sie das Schläfenbein vorsichtig von der Cochlea weg und halten Sie die Cochlea mit dem Schläfenbein am Vestibulum befestigt. Führen Sie die Pinzettenspitzen in den Apexbereich ein, der als weiße Linie sichtbar ist, und entfernen Sie die knorpelige Cochlea-Kapsel Stück für Stück, um den Cochlea-Gang freizulegen.
Setzen Sie die Pinzette unter die Cochlea und lösen Sie sie vom Gleichgewichtsorgan und dem Schläfenbein. Übertragen Sie die Cochlea in eine neue 60-Millimeter-Schale mit eiskaltem PBS. Um Corti-Explantationsorgane zu isolieren, halten Sie das Organ an der Basis und den Ductus cochlearis im Bereich des Basalhakens fest und wickeln Sie den Ductus cochlearis vorsichtig vom Modiolus ab, ohne ihn zu zerreißen.
Halten Sie dann den Ductus cochlearis an der Basis fest und ziehen Sie das Spiralband und die Stria vascularis weg. Um Cochlea-Explantaten zu isolieren, verwenden Sie eine Pinzette, um das Spiralganglion von der knöchernen Spirallamina zu lösen, und wickeln Sie das Modiolus während der Ablösung ab. Fassen Sie mit einer Pinzette die Hakenregion und entfernen Sie das Spiralband mit der Stria vascularis.
Ziehen Sie außerdem Reissners Membran Stück für Stück ab. Um die Cochlea-Explantate zu übertragen, tauchen Sie einen Laborspatel in die Schale mit dem Explantat. Heben Sie das Explantat mit den Haarzellen nach oben zusammen mit ein paar Mikrolitern PBS an, indem Sie mit einem Spatel winken.
Legen Sie das Explantat in einen Objektträger mit acht Vertiefungen, indem Sie den Spatel vorsichtig im Medium schwenken. Lassen Sie das Explantat in die Kammer gleiten. Entfernen Sie mit einer 100-Mikroliter-Pipette 80 Mikroliter Medium und entsorgen Sie es.
Überprüfen Sie die Sichtbarkeit von Haarzellen und Spiralganglien-Neuronenzellen unter dem Mikroskop. Verwenden Sie bei Bedarf eine Pinzette, um überlappendes Gewebe auseinander zu drücken. Entnehmen Sie das verbleibende Medium aus der Vertiefung.
Das Explantat liegt nun flacher auf der Oberfläche der Kammer. Nach 10 Sekunden pipettieren Sie ein oder zwei Tropfen des Mediums direkt neben dem Explantat und das verbleibende Medium in einiger Entfernung zurück, um eine Ablösung des Explantats zu vermeiden. Stellen Sie sicher, dass sich die Explantate während der Zugabe des Mediums nicht bewegen.
Inkubieren Sie die Kammer zwei Stunden lang, um die Organe fest am Boden der Kammer zu befestigen. Nach der Inkubation wird das Medium abgesaugt. Geben Sie mit einer 100- oder 200-Mikroliter-Pipette vorsichtig 300 Mikroliter frisches, vorgewärmtes Komplettmedium hinzu.
Die konfokalen mikroskopischen Aufnahmen der rotierenden Scheibe zeigten, dass die Corti-Explantate des Rattenorgans ihre Struktur und Gesamtlänge sowohl unter normalen als auch unter Stressbedingungen beibehielten. Darüber hinaus zeigte ein konfokales Rastermikroskop überlebende Haarzellen von Explantaten aus den Organen der Mäuse sowie Haarzellen, die Apoptose durchlaufen. Das Protokoll ermöglichte die Überwachung biologischer Prozessoren in lebenden Cochlea-Zellen mit geeigneten zellpermeablen Sonden und einem konfokalen Spinning-Disc-Mikroskop.
Die Kultur dieser Cochlea-Explantate verbessert die Analyse der Interaktion zwischen Haarzellen und Spiralganglienzellen. Die Haarzellen von Cochlea-Implantaten wurden mit dem Haarzellmarker MYO7A nachgewiesen. In ähnlicher Weise wurden gesunde und beschädigte Spiralganglienzellkörper und Neuriten mit dem neuronalen Marker Tuj 1 identifiziert.
In der vergrößerten Übersicht waren die Zellkörper der mit dem MYO7A-Antikörper markierten Haarzellen sichtbar. Es wurden Stereozilien der äußeren Haarzellen und dekonvolutierte Bilder einzelner Stereozilien der inneren Haarzellen identifiziert, die mit Phalloidin markiert waren. Bei den Eingriffen unter dem Mikroskop ist Vorsicht geboten, insbesondere bei der Trennung des Spiralganglions von der knöchernen Spirallamina.
Die intakten Explantaten sollten vorsichtig übertragen und ausgerichtet werden. Dieses Protokoll optimierte In-vitro-Studien an Innenohr-Explantaten. Die Ergebnisse dieser Studien, wie z. B. Signalwege und Arzneimitteltoxizität, können das Design weiterer In-vivo-Studien leiten.
