Die Autoren bedanken sich bei der Unterstützung von Frau Sue Connell für ihr Know-how erkennen in Harz eingebettet und Frau Stephania Gräber für ihre Labor-Know-how. Die Autoren bedanken sich bei Professor Frank Kandziora und Dr. Marie-Anne Polboth für ihre Ratschläge danken.

<ol><li> Das Gewebe wird in einem geschlossenen Behälter mit 10% Phosphat-gepufferter Formalin-Lösung 3 platziert. Stellen Sie sicher, minimal Einwirkung von Licht, wenn Fluorochrom-Analyse durchgeführt werden, da die Fluorochrome lichtempfindlich sind. </li><li> Stellen Sie die Ausrichtung des Gewebes erforderlich. </li><li> Schneiden Sie die Probe auf Größe, in der richtigen Ausrichtung, mit einer Bandsäge. Stellen Sie sicher, Sicherheitsmaßnahmen eingehalten werden. Die Probe wird dann in eine undurchsichtige Behälter gelegt, sollte das Volumen etwa das Zehnfache der Größe der Probe werden, um eine ausreichende Fixierung zu erreichen. Die Probe sollte in der Formalin-Lösung insgesamt zwischen einer und zwei Wochen, je nach ihrer Größe bleiben. Es wird empfohlen, mit Kontroll-Gewebe für die Prüfung und Optimierung. </li><li> Überprüfen Sie das Gewebe passt in die Einbettform und Ort des Gewebes in einem verschlossenen undurchsichtigen Behälter mit 70% Ethanol. </li><li> Prozess des Gewebes in aufsteigender Konzentrationen von Ethanol, Abschirmung vor Licht und unter ständigem Rühren. <ol class="lalpha"><li> 70% Ethanol 1 Woche </li><li> 80% Ethanol 1 Woche </li><li> 90% Ethanol 1 Woche </li><li> 100% Ethanol 1 Woche </li></ol></li><li> Das Gewebe wird dann in Butanol für 1 Woche gelöscht, wieder Abschirmung von Licht und unter ständigem Rühren. </li><li> Die Dichte des Harzes und Knochen sollten eng aufeinander abgestimmt werden. Harzdichte verändert werden können (siehe Schritt 8), und wir empfehlen die Einbettung eines Prüflings erste richtige Dichte zu gewährleisten. Wir verwenden Technovit 7100 (Heraeus Kulzer) für die Lichtmikroskopie und Fluorochrom-Analyse. Wenn Immunhistochemie ist erforderlich, eine alternative Harz muss wie Technovit 9100 (Heraeus Kulzer) verwendet werden. </li><li> Die Technovit 7100 Vorbereitung Lösung kann mit kleinen Aliquoten der Erweichung Lösung mit dem Kit enthalten sind, falls erforderlich vermischt werden, aber nicht mehr als 5% des Volumens der Zubereitung Lösung; nach unserer Erfahrung die Erweichung Lösung ist nur selten erforderlich. Zu gleichen Teilen absolutem Ethanol und Basisflüssigkeit Technovit 7100 werden gemischt und auf das Gewebe als pre-Infiltration Lösung für 24 Stunden minimiert Belichtung und unter Rühren. </li><li> Die Infiltration Lösung wird dann mit 1 g Härter I (= 1 Sack), die in 100 ml Basis Flüssigkeit gelöst wird. Dies ersetzt die vor Infiltration Lösung und darf für 1 Woche unter ständigem Rühren zu infiltrieren. </li><li> Legen Sie das Gewebe in die Form, mit der Schnittfläche nach unten zeigen. Stellen Sie sicher, es gibt einen Spielraum (im Idealfall mindestens 5 Millimeter) um das Gewebe für das Harz, das sorgt für Block Stärke. Mix 15mls von Technovit 7100 Vorbereitung Lösung mit 1 ml Härter II und gießen Sie rund um Probe in der Form und bedecken Sie es mit mindestens 5 millimietres. Die Aushärtung wird innerhalb von 2 Stunden zu beginnen, sondern wird komplett über Nacht. </li><li> Die Montage erfolgt dann durch Gestaltung einer Unterlage Block mit Technovit 3040 (Heraeus Kulzer) durchgeführt. Mix Technovit 3040 in einem Volumen-Verhältnis von 2 Teile Pulver zu 1 Teil Flüssigkeit zu einer viskosen Flüssigkeit erhalten. Gießen Technovit 3040 in die Aussparung an der Rückseite des Blocks auf ein Niveau von mindestens 2 mm über dem Boden des Blocks. Nach etwa 10 Minuten kann die Form abgeschält werden und der Block fertig ist. </li><li> Die Dichte und damit die Zerspanbarkeit von Methacrylatharz sind anfällig für die Luftfeuchtigkeit im Raum. Die Blöcke sollten daher in einem Exsikkator aufbewahrt werden. </li><li> Boden Schnitte produziert größere Abschnitte zwischen 20-50 Mikrometer dick. Es ist nützlich für Fluorochrom-Analyse (siehe unten) als dickere Abschnitte heller Fluoreszenz zu erzeugen. Sichern Sie die Diamantscheibe zu macrotome. Add Schmiermittel, wie Benzin, um das Reservoir auf dem macrotome. Sichern Sie den Block in der Klemme und orientieren sich an Klinge. Lassen Schleifen zu langsam erfolgen (ca. 20-30 Minuten pro Abschnitt) gewährleistet ausreichende Schmierung. Der erste Abschnitt macht die Spanfläche und richtet die Sektion-es sollte weggeworfen werden. </li><li> Im nächsten Abschnitt wird dann auf einen Superfrost Plus Objektträger gebracht. Der Abschnitt hat eine Tendenz, curl, damit wir platzieren einen Teil einer Sandwich-Beutel empfehlen darüber und dann hält sie flach mit einer anderen Folie eingespannt. Es wird dann in einen Inkubator zwischen 60-80 Grad Celsius für 1 Stunde gelegt. Dies mildert die Methacrylat und hilft dem Abschnitt, um die Folie in einer flachen Form zu halten. </li><li> Der Schliff kann gereinigt und poliert werden nach Bedarf mit feinem Schleifpapier auf sanfte Weise. </li><li> Der Schlitten Mikrotom Schnitte dünne Schnitte, welche die besten Abschnitte für Licht microsocopy. Verwenden Sie einen Schlitten Mikrotom wie Steifigkeit, die für das Schneiden von diesen harten Blöcken erforderlich ist hinzugefügt wurde. Alternativ kann eine angetrieben Rotationsmikrotom verwendet werden kann. Mit einem scharfen Klinge aus rostfreiem Stahl. Es ist besser, zwei Schaufeln zur Verfügung haben als eine wie das andere geschärft werden kann, verwendet wird. Die Klinge sollte einen Winkel von 45 Grad mit dem Block. Surface Erweichung kann durch Anlegen einer nassen Papier, um den Block bei Bedarf erreicht werden. Es kann mehrere Abschnitte, um die gewünschten Schnitt zu erzielen, um eine Qualität Abschnitt zu erhalten. Der Abschnitt wird dann auf ein Wasserbad schwimmen und auf eine Folie als in 16 oben. </li><li> Färbereagenzien sind in der Materialwirtschaft im Folgenden aufgeführt. Protokolle sind auf Bancroft 4 et al. Aufgrund Dickenvariation ist es empfehlenswert, Flecken auf Testdias optimieren. Rack-Färbung kann Gewebe zu schweben aus der Folie so Zugabe die Flecken direkt an einen Flachschieber kann erforderlich sein. Ein identisches Protokoll-oder Rack-Färbung ist notwendig für die konsequente Färbung Ergebnisse für Histomorphometrie erforderlich. <ol class="lalpha"><li> Hämatoxylin und Eosin <ol class="lroman"><li> Stain mit Haematoxyilin 5-10 Minuten </li><li> Sorgfältig mit Scott s Leitungswasser </li><li> Stain mit Eosin 5 Minuten </li><li> Wash in Leitungswasser </li><li> In Xylol klären </li><li> Montieren </li><li> Ergebnisse <ol><li> Osteoid = pink </li><li> Verkalkten Knochen = violett braun </li><li> Zellkerne = blau </li></ol></li></ol></li><li> Von Kossa <ol class="lroman"><li> Legen Sie in Silbernitrat-Lösung und setzen auf starke Licht bis mineralisierten Knochen schwarz wird (ca. 10 Min.) </li><li> Wash in destilliertem Wasser dreimal </li><li> Threat mit Natriumthiosulfat für 5 Minuten </li><li> Wash in destilliertem Wasser </li><li> Gegenfärbung mit Safrinin O </li><li> In Xylol klären </li><li> Montieren </li><li> Ergebnisse <ol><li> Mineralisierte Knochen = schwarz </li><li> Osteoid = rot / pink </li></ol></li></ol></li><li> Masson Goldner s Trichrome <ol class="lroman"><li> Waschen mit alkalischen Alkohol (90mls von 80% Ethanol und 10mls von 25% Ammoniak für 20 Minuten) </li><li> Spülen in Wasser </li><li> Spülen in destilliertem Wasser </li><li> Stain mit Weigert s Hämatoxylin für 10 Minuten </li><li> Spülen in destilliertem Wasser </li><li> Stain mit Ponceau-Fuchsin endgültige Lösung 5 Minuten </li><li> Spülen mit 1% Essigsäure 15 Sekunden </li><li> Stain in Phosphormolybdänsäure-Orange G Lösung 5 Minuten </li><li> Spülen mit 1% Essigsäure 15 Sekunden </li><li> Stain mit hellgrünen 5 Minuten </li><li> Spülen mit 1% Essigsäure 3 ändert </li><li> Spülen in destilliertem Wasser </li><li> Montieren </li><li> Ergebnisse <ol><li> Mineralisierte Knochen = grün </li><li> Osteoid = rot / orange </li><li> Zellkerne = blau grau </li><li> Knorpel = violett </li></ol></li></ol></li></ol></li><li> Fluorochrom Zubereitungen: </li><li> Diese werden durch langsame intravenöse Injektion verabreicht werden, mindestens zwei Wochen auseinander. </li><li> Dosen <ol class="lalpha"><li> Calcein Grün 10 mg / kg IV </li><li> Oxytetracyclin 50 mg / kg IV </li><li> Alizarin-Komplexon 30 mg / kg IV </li></ol></li><li> Vorbereitung von Calcein Grün <ol class="lalpha"><li> Ein Gramm des Calcein Grün ist mit 1 M NaOH titriert, bis aufgelöst. </li><li> pH wird mit 1% NaOH bis pH = 7,1-7,2 eingestellt. </li><li> Filter und halten abgeschirmt vom Licht </li></ol></li><li> Vorbereitung der Alizarin-Komplexon <ol class="lalpha"><li> Drei Gramm Alizarin-Komplexon wird mit 1 M NaOH titriert, bis aufgelöst. </li><li> pH-Wert liegt dann mit 1% HCl oder NaOH bis pH = 7,1-7,2 eingestellt. </li><li> Filter und halten abgeschirmt vom Licht </li></ol></li><li> Vorbereitung von Oxytetracyclin <ol class="lalpha"><li> Oxytetracyclin ist als aus dem Regal anti-mikrobiellen Medikamenten. Keine Vorbereitung erforderlich. </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Kerr, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Atlas of Functional Histology. , 164-168 (2000).</li><li>Parfitt, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bone+histomorphometry:+standardization+of+nomenclature,+symbols,+and+units.+Report+of+the+ASBMR+Histomorphometry+Nomenclature+Committee.">Bone histomorphometry: standardization of nomenclature, symbols, and units. Report of the ASBMR Histomorphometry Nomenclature Committee.</a> J Bone Miner Res. 2, 595-610 (1987).</li><li>An, Y. H., Martin, K. l. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Handbook of histology methods for bone and cartilage. , (2003).</li><li>Bancroft, J. D., Gamble, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Theory and Practice of Histological Techniques. , 352-360 (2008).</li></ol>

Lösungsmittel: <ul><li> 10% Normal-Buffered Formalin, Ethanol, Xylol und Butanol Säure Alle Histologie grade, schwefelfrei. GRALE Scientific Pty Ltd http://www.grale.com.au </li></ul> Schimmelpilze: <ul><li> Peel entfernt, Kunststoffformen GRALE Scientific </li></ul> Slides: <ul><li> SuperFrost Plus Objektträger Lomb Scientific Pty Ltd <a href="http://www.lomb.com.au/">http://www.lomb.com.au</a> </li></ul> Harz: <ul><li> GlycolMethacrylate Technovit 7100 Heraeus Kulzer <a href="http://www.kulzer-technik.de/168/Products/Histology/Technovit_7100.htm">http://www.kulzer-technik.de/168/Products/Histology/Technovit_7100.htm</a> </li><li> Sichern blockieren Resin-Technovit 3040 Histo-Block Heraeus Kulzer </li></ul> Stains (Reagenzien aus GRALE Scientific) Goldner ist Trichrom </li> 1. Weigert Eisen Hämatoxilin (DeGroat) <table style="margin-left:40px;" border="0"><tr><td colspan="2" style="font-weight:bold;"> a) Hämatoxilin Lösung </td></tr><tr><td> Hämatoxilin </td><td> 1g </td></tr><tr><td> Absoluter Alkohol </td><td> 100ml </td></tr><tr><td colspan="2" style="font-weight:bold;"> b) Eisen-Lösung </td></tr><tr><td> 30% ige wässrige Eisenchlorid </td><td> 4mL </td></tr><tr><td> Salzsäure (konzentriert) </td><td> 1ml </td></tr><tr><td> destilliertem Wasser </td><td> 95ml </td></tr></table> Filtriert und zu gleichen Volumen Hämatoxilin unmittelbar vor verwendet Fleck. 2. Ponceau-Fuchsin-azophloxin Stammlösungen <table style="margin-left:40px;" border="0"><tr><td colspan="2" style="font-weight:bold;"> a) Ponceau de Xylidin Lösung </td></tr><tr><td> Ponceau de Xylidin </td><td> 0.75g </td></tr><tr><td> Säure fuchsion </td><td> 0.25g </td></tr><tr><td> Essigsäure </td><td> 1ml </td></tr><tr><td colspan="2"> mischen, und fügen Sie destilliertes Wasser (100 ml) </td></tr><tr><td colspan="2" style="font-weight:bold;"> b) azophloxin Lösung </td></tr><tr><td> Azophloxin </td><td> 0.5g </td></tr><tr><td> Essigsäure </td><td> 0,6 ml </td></tr><tr><td colspan="2"> mischen, und fügen Sie destilliertes Wasser (100 ml) </td></tr><tr><td colspan="2" style="font-weight:bold;"> c) Letzter Arbeitstag Färbelösung </td></tr><tr><td> Ponceau-Fuchsin-Lösung </td><td> 5-10ml </td></tr><tr><td> Azophloxin </td><td> 2 ml </td></tr><tr><td> 0,2% Essigsäure-Lösung </td><td> 88ml </td></tr></table> 3. Light Green-Lösung <table style="margin-left:40px;" border="0"><tr><td> Light Green </td><td> 1g </td></tr><tr><td> Essigsäure </td><td> 1ml </td></tr><tr><td colspan="2"> Mix, und fügen Sie destilliertes Wasser (500 ml) </td></tr></table> 4. Phophomolybdic Säure-Orange G-Lösung <table style="margin-left:40px;" border="0"><tr><td> Phosphormolybdänsäure </td><td> 3g </td></tr><tr><td> Orange G </td><td> 2g </td></tr><tr><td colspan="2"> Man löst in 500 ml destilliertem Wasser und fügen Kristall Thymol. </td></tr></table> Von Kossa Stain <table style="margin-left:40px;" border="0"><tr><td> 1% ige wässrige Silbernitratlösung </td></tr><tr><td> 2,5% Natriumthiosulfat </td></tr><tr><td> 1% Safranin O </td></tr></table> Alcianblau Fleck <table style="margin-left:40px;" border="0"><tr><td> Alcianblau 8GX </td><td> 1g </td></tr><tr><td> 3% Essigsäure-Lösung </td><td> 100ml </td></tr></table> Hämatoxilin und Eosin-Färbung <table style="margin-left:40px;" border="0"><tr><td colspan="2" style="font-weight:bold;"> a) Harris Hämatoxilin </td></tr><tr><td> Hämatoxilin </td><td> 2.5g </td></tr><tr><td> Absolute Alkohol </td><td> 25ml </td></tr><tr><td> Potassium Alum </td><td> 50g </td></tr><tr><td> destilliertem Wasser </td><td> 500ml </td></tr><tr><td> Quecksilberoxid </td><td> 1,25 g OR </td></tr><tr><td> Natriumjodat </td><td> 0.5g </td></tr><tr><td> Eisessig </td><td> 20mL </td></tr><tr><td colspan="2" style="font-weight:bold;"> b) Eosin-Lösung </td></tr><tr><td colspan="2"> Kommerziell hergestellte Eosin verwendet wurde. </td></tr></table> Alle Flecken Farbstoffpulvern sind Gurr Farbstoffpulvern. Alle Reagenzien sind analytische Reagenzien und nicht Lab Reagenzien Fluorochrome <table border="1" cellspacing="0" cellpadding="0"><tr><td> Hersteller </td><td> Fluorochrom </td><td> Katalog-Nummer </td></tr><tr><td> Sigma-Aldrich, Sydney </td><td> Calcein Grün </td><td> C0875 </td></tr><tr><td> Sigma-Aldrich, Sydney </td><td> Alizarin-Komplexon </td><td> A3882 </td></tr><tr><td> Intervet Australia, Victoria </td><td> Oxytetracyclin (Aus dem Regal antimikrobiellen Wirkstoff) </td><td> Handelsname; Engemycin 100 </td></tr></table>

undecalcified bone preparation for histology, histomorphometry and fluorochrome analysis

Nichtentkalktem Knochenhistologie zeigt die Mikroarchitektur des Knochens. Es zeigt sowohl die mineralisierten und zellulären Bestandteile des Knochens, die wichtige Informationen auf den Knochenumbau oder Knochenbildung und Resorption zur Verfügung stellt. Dies hat enorme Bedeutung in einer Vielzahl von klinischen und wissenschaftlichen Anwendungen. Es liefert schöne Bilder 1 und ermöglicht Techniken wie Fluorochrom Beurteilung und Histomorphometrie 2. Fluorochrom-Analyse ist eine Technik, bei der Fluoreszenz-Farbstoffe, die Kalzium binden zu einem bestimmten Zeitpunkt, der für die Quantifizierung der Menge der Mineralisierung können an diesem bestimmten Zeitpunkt gespritzt werden. Histomorphometrisch ist ein Prozess des Knochen-Quantifizierung auf der mikroskopischen Ebene. Performing nichtentkalktem Knochenhistologie ist technisch anspruchsvoll, vor allem bei großformatigen Proben. Es erfordert Veränderungen in Technik von den in Standard-Paraffin eingebetteten Histologie verwendet. Dieses Video zeigt den Prozess der Herstellung guter Qualität Abschnitte und zeigt die technischen Schwierigkeiten und Methoden, mit denen sie zu überwinden. Probenvorbereitung, Fixierung und Verarbeitung sind mit einer ähnlichen Weise wie andere Weichteile, aber aufgrund der Dichte und eine geringere Durchlässigkeit des Knochens erheblich länger Fixierung und Verarbeitung gefordert sind, oft unter mehreren Wochen erreicht. Embedding erfolgt über ein Trägermedium mit ähnlichen oder gleichen Härte und Dichte des Knochens wie Methacrylat-Harze, aber im Gegensatz zu Paraffin Infiltration und Einbettung, ist dies ein irreversibler Schritt. Schnitte können durch Schleifen, die zu einer dickeren Abschnitt, der optimal für Studien wie Fluorochrom Analyse erreicht werden. Dies ist am besten mit einem Diamant-Trennscheibe auf einem macrotome. Alternativ können dünnere Abschnitte für die Lichtmikroskopie hergestellt werden und erreichen Sie dies über einen Schlitten Mikrotom mit einem sehr scharfen Messer. Der Schlitten Mikrotom bietet die zusätzliche Festigkeit und Stabilität für große, harte Blöcke benötigt. Resin eingebettet Abschnitte können mit einer Vielzahl von Flecken, die gezeigt gefärbt werden.

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Undecalcified Bone Preparation for Histology, Histomorphometry and Fluorochrome Analysis

Nichtentkalktem Knochenhistologie liefert wichtige Informationen für eine Vielzahl von klinischen und wissenschaftlichen Anwendungen. Es ist technisch anspruchsvoll, vor allem bei großformatigen Proben. Dieses Video zeigt den Prozess der Herstellung guter Qualität Abschnitte und zeigt die technischen Schwierigkeiten und Methoden, mit denen sie zu überwinden.

Nichtentkalktem Knochen Vorbereitung für Histologie, Histomorphometrisch und Fluorochrom Analysis

Undecalcified bone histology demonstrates the micro-architecture of bone. It shows both the mineralised and cellular components of bone, which provides ...

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Research

JoVE Journal

Biology

27.1K Aufrufe.  Monash University. Nichtentkalktem Knochenhistologie liefert wichtige Informationen für eine Vielzahl von klinischen und wissenschaftlichen Anwendungen. Es ist technisch anspruchsvoll, vor allem bei großformatigen Proben. Dieses Video zeigt den Prozess der Herstellung guter Qualität Abschnitte und zeigt die technischen Schwierigkeiten und Methoden, mit denen sie zu überwinden.

Serie: Undecalcified Bone Preparation for Histology, Histomorphometry and Fluorochrome Analysis

The Preparation of Primary Hematopoietic Cell Cultures From Murine Bone Marrow for Electroporation

It is becoming increasingly apparent that electroporation is the most effective way to introduce plasmid DNA or siRNA into primary cells. The Gene Pulser MXcell  electroporation system and Gene Pulser  electroporation buffer were specifically developed to transfect nucleic acids into mammalian cells and difficult-to-transfect cells, such as primary and stem cells.This video demonstrates how to establish primary hematopoietic cell cultures from murine bone marrow, and then prepare them for electroporation in the MXcell system. We begin by isolating femur and tibia. Bone marrow from both femur and tibia are then harvested and cultures are established. Cultured bone marrow cells are then transfected and analyzed.

This procedure describes how to establish primary hematopoietic cell cultures from murine bone marrow and is followed by transfection using the Gene Pulser MXCell electroporation system.

Die Herstellung von primären hämatopoetischen Zellkulturen aus Knochenmark der Maus für die Elektroporation

It is becoming increasingly apparent that electroporation is the most effective way to introduce plasmid DNA or siRNA into primary cells. The Gene Pulser ...

Forschung

Biologie

A Neuronal and Astrocyte Co-Culture Assay for High Content Analysis of Neurotoxicity

High Content Analysis (HCA) assays combine cells and detection reagents with automated imaging and powerful image analysis algorithms, allowing measurement of multiple cellular phenotypes within a single assay. In this study, we utilized HCA to develop a novel assay for neurotoxicity. Neurotoxicity assessment represents an important part of drug safety evaluation, as well as being a significant focus of environmental protection efforts. Additionally, neurotoxicity is also a well-accepted in vitro marker of the development of neurodegenerative diseases such as Alzheimer's and Parkinson's diseases. Recently, the application of HCA to neuronal screening has been reported. By labeling neuronal cells with &beta;III-tubulin, HCA assays can provide high-throughput, non-subjective, quantitative measurements of parameters such as neuronal number, neurite count and neurite length, all of which can indicate neurotoxic effects. However, the role of astrocytes remains unexplored in these models. Astrocytes have an integral role in the maintenance of central nervous system (CNS) homeostasis, and are associated with both neuroprotection and neurodegradation when they are activated in response to toxic substances or disease states. GFAP is an intermediate filament protein expressed predominantly in the astrocytes of the CNS. Astrocytic activation (gliosis) leads to the upregulation of GFAP, commonly accompanied by astrocyte proliferation and hypertrophy. This process of reactive gliosis has been proposed as an early marker of damage to the nervous system. The traditional method for GFAP quantitation is by immunoassay. This approach is limited by an inability to provide information on cellular localization, morphology and cell number. We determined that HCA could be used to overcome these limitations and to simultaneously measure multiple features associated with gliosis - changes in GFAP expression, astrocyte hypertrophy, and astrocyte proliferation - within a single assay. In co-culture studies, astrocytes have been shown to protect neurons against several types of toxic insult and to critically influence neuronal survival. Recent studies have suggested that the use of astrocytes in an in vitro neurotoxicity test system may prove more relevant to human CNS structure and function than neuronal cells alone. Accordingly, we have developed an HCA assay for co-culture of neurons and astrocytes, comprised of protocols and validated, target-specific detection reagents for profiling &beta;III-tubulin and glial fibrillary acidic protein (GFAP). This assay enables simultaneous analysis of neurotoxicity, neurite outgrowth, gliosis, neuronal and astrocytic morphology and neuronal and astrocytic development in a wide variety of cellular models, representing a novel, non-subjective, high-throughput assay for neurotoxicity assessment. The assay holds great potential for enhanced detection of neurotoxicity and improved productivity in neuroscience research and drug discovery.

This article describes a novel protocol and reagent set designed for sensitive measurement of neurotoxic effects of compounds and treatments on co-cultures of neurons and astrocytes using high content analysis. Results demonstrate that high content analysis represents an exciting novel technology for neurotoxicity assessment.

Eine Neuronale und Astrocyte Co-Kultur-Assay für High Content Analyse der Neurotoxizität

High Content Analysis (HCA) assays combine cells and detection reagents with automated imaging and powerful image analysis algorithms, allowing ...

RNA In situ Hybridization in Whole Mount Embryos and Cell Histology Adapted for Marine Elasmobranchs

Marine elasmobranchs are valued animal models for biomedical and genomic studies as they are the most primitive vertebrates to have adaptive immunity and have unique mechanisms for osmoregulation 1-3. As the most primitive living jawed-vertebrates with paired appendages, elasmobranchs are an evolutionarily important model, especially for studies in evolution and development. Marine elasmobranchs have also been used to study aquatic toxicology and stress physiology in relationship to climate change 4. Thus, development and adaptation of methodologies is needed to facilitate and expand the use of these primitive vertebrates to multiple biological disciplines. Here I present the successful adaptation of RNA whole mount in situ hybridization and histological techniques to study gene expression and cell histology in elasmobranchs.
Monitoring gene expression is a hallmark tool of developmental biologists, and is widely used to investigate developmental processes 5. RNA whole mount in situ hybridization allows for the visualization and localization of specific gene transcripts in tissues of the developing embryo. The expression pattern of a gene's message can provide insight into what developmental processes and cell fate decisions a gene may control. By comparing the expression pattern of a gene at different developmental stages, insight can be gained into how the role of a gene changes during development.
While whole mount in situ's provides a means to localize gene expression to tissue, histological techniques allow for the identification of differentiated cell types and tissues. Histological stains have varied functions. General stains are used to highlight cell morphology, for example hematoxylin and eosin for general staining of nuclei and cytoplasm, respectively. Other stains can highlight specific cell types. For example, the alcian blue stain reported in this paper is a widely used cationic stain to identify mucosaccharides. Staining of the digestive tract with alcian blue can identify the distribution of goblet cells that produce mucosaccharides. Variations in mucosaccharide constituents on short peptides distinguish goblet cells by function within the digestive tract 6. By using RNA whole mount in situ's and histochemical methods concurrently, cell fate decisions can be linked to gene-specific expression.
Although RNA in situ's and histochemistry are widely used by researchers, their adaptation and use in marine elasmobranchs have met limited and varied success. Here I present protocols developed for elasmobranchs and used on a regular basis in my laboratory. Although further modification of the RNA in situ's hybridization method may be needed to adapt to different species, the protocols described here provide a strong starting point for researchers wanting to adapt the use of marine elasmobranchs to their scientific inquiries.

RNA In situ Hybridization in Whole Mount Embryos and Cell Histology Adapted for Marine Elasmobranchs

By combining methods for RNA whole mount in situ hybridization and histology, gene expression can be linked with cell fate decisions in the developing embryo. These methods have been adapted to marine elasmobranchs and facilitate the use of these animals as model organisms for biomedical, toxicology and comparative studies.

RNA<em&gt; In situ</em&gt; Hybridisierung in whole mount Embryonen und Histologie für Marine Elasmobranchs Angepasst

Marine  elasmobranchs are valued animal models for biomedical and genomic studies as  they are the most primitive vertebrates to have adaptive immunity ...

Bone Conditioned Medium: Preparation and Bioassay

Autologous bone grafts are widely used in oral and maxillofacial surgery, orthopedics, and traumatology. Autologous bone grafts not only replace missing bone, they also support the complex process of bone regeneration. This favorable behavior of autografts is attributed to the three characteristics: osteoconductivity, osteogenicity, and osteoinductivity. However, there is another aspect: Bone grafts release a myriad of molecules, including growth factors, which can target mesenchymal cells involved in bone regeneration. The paracrine properties of bone grafts can be studied in vitro by the use of bone-conditioned medium (BCM). Here we present a protocol on how to prepare bone-conditioned medium from native pig cortical bone, and bone that underwent thermal processing or demineralization. Cells can be directly exposed to BCM or seeded onto biomaterials, such as collagen membranes, previously soaked with BCM. We give examples for in vitro bioassays with mesenchymal cells on the expression of TGF-&#946; regulated genes. The presented protocols should encourage to further reveal the paracrine effects of bone grafts during bone regeneration and open a path for translational research in the broad field of reconstructive surgery.

We describe here how to prepare bone-conditioned medium (BCM) and test its activity in vitro.

Knochen konditioniertem Medium: Vorbereitung und Bioassay

Autologous bone grafts are widely used in oral and maxillofacial surgery, orthopedics, and traumatology. Autologous bone grafts not only replace missing ...

Sample Preparation for Mass Cytometry Analysis

Mass cytometry utilizes antibodies conjugated with heavy metal labels, an approach that has greatly increased the number of parameters and opportunities for deep analysis well beyond what is possible with conventional fluorescence-based flow cytometry. As with any new technology, there are critical steps that help ensure the reliable generation of high-quality data. Presented here is an optimized protocol that incorporates multiple techniques for the processing of cell samples for mass cytometry analysis. The methods described here will help the user avoid common pitfalls and achieve consistent results by minimizing variability, which can lead to inaccurate data. To inform experimental design, the rationale behind optional or alternative steps in the protocol and their efficacy in uncovering new findings in the biology of the system being investigated is covered. Lastly, representative data is presented to illustrate expected results from the techniques presented here.

This article describes the collection and processing of samples for mass cytometry analysis.

Probenvorbereitung für die Massen Cytometry-Analyse

Mass cytometry utilizes antibodies conjugated with heavy metal labels, an approach that has greatly increased the number of parameters and opportunities ...

Tissue Collection and RNA Extraction from the Human Osteoarthritic Knee Joint

Osteoarthritis (OA) is a chronic and degenerative joint disease most often affecting the knee. As there is currently no cure, total knee arthroplasty (TKA) is a common surgical intervention. Experiments using primary human OA tissues obtained from TKA provide the capability to investigate disease mechanisms ex vivo. While OA was previously thought to impact mainly the cartilage, it is now known to impact multiple tissues in the joint. This protocol describes patient selection, sample processing, tissue homogenization, RNA extraction, and quality control (based on RNA purity, integrity, and yield) from each of seven unique tissues to support disease mechanism investigation in the knee joint. With informed consent, samples were obtained from patients undergoing TKA for OA. Tissues were dissected, washed, and stored within 4 h of surgery by flash freezing for RNA or formalin fixation for histology. Collected tissues included articular cartilage, subchondral bone, meniscus, infrapatellar fat pad, anterior cruciate ligament, synovium, and vastus medialis oblique muscle. RNA extraction protocols were tested for each tissue type. The most significant modification involved the method of disintegration used for low-cell, high-matrix, hard tissues (considered as cartilage, bone, and meniscus) versus relatively high-cell, low-matrix, soft tissues (considered as fat pad, ligament, synovium, and muscle). It was found that pulverization was appropriate for hard tissues, and homogenization was appropriate for soft tissues. A proclivity for some subjects to yield higher RNA integrity number (RIN) values than other subjects consistently across multiple tissues was observed, suggesting that underlying factors such as disease severity may impact RNA quality. The ability to isolate high-quality RNA from primary human OA tissues provides a physiologically relevant model for sophisticated gene expression experiments, including sequencing, that can lead to clinical insights that are more readily translated to patients.

Primary tissues obtained from patients following total knee arthroplasty provide an experimental model for osteoarthritis research with maximal clinical translatability. This protocol describes how to identify, process, and isolate RNA from seven unique knee tissues to support mechanistic investigation in human osteoarthritis.

Gewebeentnahme und RNA-Extraktion aus dem humanen osteoarthritischen Kniegelenk

Osteoarthritis (OA) is a chronic and degenerative joint disease most often affecting the knee. As there is currently no cure, total knee arthroplasty ...

An Improved Chemotaxis Assay for the Rapid Identification of Rhizobacterial Chemoattractants in Root Exudates

Chemotaxis identification is very important for the research and application of rhizosphere growth-promoting bacteria. We established a straightforward method to quickly identify the chemoattractants that could induce the chemotactic movement of rhizosphere growth-promoting bacteria on sterile glass slides via simple steps. Bacteria solution (OD600 = 0.5) and sterile chemoattractant aqueous solution were added dropwise on the glass slide at an interval of 1 cm. An inoculating loop was used to connect the chemoattractant aqueous solution to the bacterial solution. The slide was kept at room temperature for 20 min on the clean bench. Finally, the chemoattractant aqueous solution was collected for bacterial counting and microscopic observation. In this study, through multiple comparisons of experimental results, the method overcame multiple shortcomings of traditional bacterial chemotaxis methods. The method reduced the error of plate counting and shortened the experimental cycle. For the identification of chemoattractant substances, this new method can save 2-3 days compared to the traditional method. Additionally, this method allows any researcher to systematically complete a bacterial chemotaxis experiment within 1-2 days. The protocol can be considered a valuable resource for understanding plant-microbe interactions.

Here, we present an improved chemotaxis assay protocol. The goal of this protocol is to reduce the steps and costs of traditional bacterial chemotaxis methods and to serve as a valuable resource for understanding plant-microbe interactions.

Ein verbesserter Chemotaxis-Assay zur schnellen Identifizierung von rhizobakteriellen Chemoattraktantien in Wurzelexsudaten

Chemotaxis identification is very important for the research and application of rhizosphere growth-promoting bacteria. We established a straightforward ...

Künstliche Knorpelimplantate für die Knochenregeneration durch endochondrale Ossifikation

Integrated Bone Formation Through In Vivo Endochondral Ossification Using Mesenchymal Stem Cells

Conventional bone regeneration therapy using mesenchymal stem cells (MSCs) is difficult to apply to bone defects larger than the critical size because it does not have a mechanism to induce angiogenesis. Implanting artificial cartilage tissue fabricated from MSCs induces angiogenesis and bone formation in vivo via endochondral ossification (ECO). Therefore, this ECO-mediated approach may be a promising bone regeneration therapy in the future. An important aspect of the clinical application of this ECO-mediated approach is establishing a protocol for preparing enough cartilage to be implanted to repair the bone defect. It is especially not practical to design a single mass of grafted cartilage of a size that conforms to the shape of the actual bone defect. Therefore, the cartilage to be transplanted must have the property of forming bone integrally when multiple pieces are implanted. Hydrogels may be an attractive tool for scaling up tissue-engineered grafts for endochondral ossification to meet clinical requirements. Although many naturally derived hydrogels support MSC cartilage formation in vitro and ECO in vivo, the optimal scaffold material to meet the needs of clinical applications has yet to be determined. Hyaluronic acid (HA) is a crucial component of the cartilage extracellular matrix and is a biodegradable and biocompatible polysaccharide. Here, we show that HA hydrogels have excellent properties to support in vitro differentiation of MSC-based cartilage tissue and promote endochondral bone formation in vivo.

Autor im Rampenlicht: Verbesserung der Knochenregeneration mit vaskularisierter künstlicher Knorpelintegration 

Bone therapy via endochondral ossification by implanting artificial cartilage tissue produced from mesenchymal stem cells has the potential to circumvent the drawbacks of conventional therapies. Hyaluronic acid hydrogels are effective in scaling up uniformly differentiated cartilage grafts as well as creating integrated bone with vascularization between fused grafts in vivo.

Integrierte Knochenbildung durch in vivo ennochondrale Ossifikation mit mesenchymalen Stammzellen

Conventional bone regeneration therapy using mesenchymal stem cells (MSCs) is difficult to apply to bone defects larger than the critical size because it ...