Wir danken Dr. Jennifer Emtage für das kritische Lesen des Manuskripts, Ryan Gill für die technische Unterstützung und Hilfe bei der Pflege und Zebrafisch Dr. Stephen C. Ekker (Mayo Clinic, Rochster, Minnesota) für Reagenzien. Unsere Arbeit wurde von der Temple University College of Science and Technology und der National Institutes of Health (R01-HD061749) unterstützt.

1. Herstellung des F0-Erzeugung durch Mikroinjektion von der Gen-Trap. Wir haben festgestellt, dass Embryonen von verschiedenen genetischen Hintergründen zeigen unterschiedliche Toleranzen zu diesem Verfahren, mit Haustier-store-Basis Wildtyp und Tübingen - Lange Fin (TLF) die tolerantesten, während AB und Tübingen Stämme haben schlechtere Überlebenszeit. <ol><li> Vorbereitung der Transposon-DNA. Bereiten GBT-B1 (pDB783, Balciuniene et al. In Vorbereitung) Plasmid-DNA unter Verwendung von Standard QIAprep Miniprep Kit (Qiagen 27106). Es ist wesentlich, um die PB Waschschritt (der in QIAprep Verfahren optional ist) schließen, da sonst das Miniprep-DNA wird von RNase A verunreinigt werden, was zu einer Verschlechterung der Transposase mRNA. Vor der Injektion verdünnter die DNA in RNase-freiem Wasser (Ambion AM9937) bis 10 ng / ul. </li><li> Vorbereitung der Transposase mRNA. Linearisieren pT3TS/Tol2 (pDB600) 13 mit XbaI und transkribieren die linearisierte DNA mit einem Maschinen mMessage T3(Ambion AM1348) in vitro-Transkription-Kit. Wir haben die in-vitro-Transkriptionsreaktion durch Zugabe von 0,5 ul RiboLock RNase-Inhibitor (Thermofisher Fermentas EO0381) modifiziert. Nach der DNase-Behandlung Schritt reinigen mRNA mit Hilfe eines RNeasy MinElute Kit (Qiagen 74204). Bewerten Sie die Qualität der in vitro transkribierten mRNA durch Agarose-Gelelektrophorese. Verdünnen Sie die mRNA in RNase-freiem Wasser auf 40 ng / ul und lagern 2 ul Aliquots bei -80 ° C </li><li> Herstellung der Mikroinjektion Mischung. Vor der Injektion hinzufügen 8 ul verdünnte Transposon-DNA zu einem 2 ul Aliquot Transposase mRNA. </li><li> Mikroinjektion. Inject 3 nl von DNA / RNA-Gemisch in den Dotter von 1 Zelle Zebrafischembryonen mit Standard-Mikroinjektionstechniken, mit dem Ziel für das Eigelb / Blastomere Schnittstelle. Sammeln Embryonen alle 20 min der Injektion bei 1-Zell-Stadium zu gewährleisten. Nach unserer Erfahrung kann eine geschickte Person leicht injizieren 1.000 Embryonen in 1-1,5 Stunden. </li><li> Nach der Injektion laufen 5 ul der linkenüber Injektionslösung auf einem 1% Agarose-Gel für die Qualitätskontrolle, um sicherzustellen, dass die Transposase mRNA wurde nicht abgebaut. </li><li> Embryo injiziert Pflege. Am späten Nachmittag, entfernen Sie unbefruchteten und abnorme Embryonen und verteilen Embryonen auf 60-80 pro 100 mm Petrischale. Abnormal und tote Embryonen werden in 1 Tag nach der Befruchtung (DPF), 2 und 3 dpf dpf entfernt. </li><li> Screening für GFP-Expression. Bildschirm Embryonen ohne offensichtliche Mängel auf GFP-Fluoreszenz bei 3 dpf (Abbildung 3). Screening kann entweder auf einem Stereomikroskop mit Fluoreszenz ausgestattet oder durchgeführt werden (wir verwenden eine Nikon SMZ1500) auf einem aufrechten Mikroskop (wir verwenden ein Zeiss AxioImager mit 5X Fluar Ziel). Low GFP-Expression zeigt entweder erfolglos Injektion oder Abbau von RNA-Transposase durch RNase Kontamination (Abbildung 3A). Wählen etwa 30% der hellsten Embryonen, die entweder GFP-Expression in multiplen Geweben oder in einem hohen Prozentsatz von Zellen eines bestimmten Gewebes (vgl. Figures 3B und 3C). Von einer Injektion von 1000 Embryonen, haben wir in der Regel bis zu 100 entwicklungs normal, hoch-GFP-exprimierenden Embryonen. </li><li> Heben Sie ausgewählt F0 Embryonen mit Standard-Zebrafisch-Zuchtverfahren. Es ist zu erwarten, dass 20-30% der injizierten Embryonen für die Aufzucht ausgewählt wird bis zum Erwachsenenalter überleben. </li></ol> 2. Pflege der Fachhochschule: mRFP Prüfvorrichtung-Linie. Wir haben eine 14xUAS generiert: mRFP Linie durch die Linse spezifische γCry markiert: GFP. Seit UAS unterliegt Schweigen durch DNA-Methylierung, ist es wichtig, Fisch mit geringer Schweigen, um die Lager zu propagieren auswählen. <ol><li> Individuelle UAS Set: mRFP Homozygoten zur Verbindung mit einer unserer zuverlässigsten Gal4-Gen-Trap Linien, nsf tpl6 (Balciuniene et al in Vorbereitung.). </li><li> Am nächsten Tag, übertragen Sie die UAS: mRFP Fische, die Embryonen auf einzelne statische Tanks gab, während die Embryonen gesammeltund gereinigt. </li><li> Screen-Embryonen für GFP und RFP Fluoreszenz bei dpf 1 und 3 dpf. </li><li> Kreuzen Fische, die Embryonen mit hoher mRFP Ausdruck gab, um die nächste Generation von UAS zu etablieren: mRFP Linie. </li></ol> 3. Screening der F0 Fisch. <ol><li> Überqueren einzelnen F0 mit der homozygot UAS: mRFP Fisch (Abbildung 4). Wir spritzen normalerweise unsere Haftungshinweise Stellenangebote AGBs in Linien mit Wildtyp-oder Leopardenmuster Pigmentierung und unsere homozygot UAS: mRFP Linie ist in Messing Hintergrund. Daher kann GBT-injiziert F0 Fisch leicht von der Fachhochschule sein: mRFP Fisch, wodurch die Notwendigkeit für die Aufnahme, ob der F0, die gescreent war ein Mann oder eine Frau sowie mögliche Fehler aus Fehlern in der Aufnahme und / oder der Bestimmung des Geschlechts resultierenden jeder Fisch. Personal mit sehr begrenzte Erfahrung, wie uns Studenten, sind daher in der Lage, Einrichtung und brechen Fisch Paarungen. Dieser Ansatz hat den Nachteil, dass zwei verschiedene genetische Hintergründe sindverwendet wird, möglicherweise kompliziert Interpretation der Verlust der Funktion Phänotypen. </li><li> Am nächsten Tag kehren die Messing UAS: mRFP Fische zu ihren Tank. Legen Sie den Fisch, der F0 Embryonen in einzelne statische Tanks gab (wir verwenden Hagen Exo Terra Faunarium Klein, aber jeder kleine Tank kann für diesen Zweck verwendet werden), während Embryonen werden gesammelt und gesiebt. </li><li> Sauber und Transfer gesammelt Embryonen in neue Petrischalen (&lt;100 pro Schale) am Nachmittag von Tag 0. </li><li> Screen-Embryonen für GFP und RFP Fluoreszenz bei dpf 1, 2 und 3 dpf dpf. Ziehen Embryonen positiv sowohl für GFP und RFP aus, sortieren sie nach GFP / RFP Expressionsmuster (wenn mehr als ein Muster ist in einem Kupplungs beobachtet), und heben Sie sie auf F1-Generation zu etablieren. </li><li> Euthanize F0 die Fische, die nur negativ Embryonen (von einer Gesamtzahl von 50 bis 100 Embryonen) produziert. </li><li> Überqueren Sie die Fische, die F0 GFP / RFP-positiven Nachkommen wieder hergestellt, eine zweite Charge von Positiven zu bekommen. </li></ol> 4.Screening der F1 Fisch. Die F1-Fisch werden gescreent, um F2 Familien zu schaffen, die Gene-Trap-Expressionsmuster zu dokumentieren und Chargen von Embryonen für die molekulare Identifizierung von Gen-Loci einfrieren Falle durch 5 &#39;RACE und inverse PCR. <ol><li> Überqueren einzelnen F1 Fisch mit der homozygot UAS: mRFP Fisch (Abbildung 4). </li><li> Am nächsten Tag, legen Sie die F1-Fische, die Embryonen in einzelne statische Tanks gab, während die Embryonen gesammelt und gesiebt. </li><li> Screen-Embryonen für GFP und RFP Fluoreszenz bei dpf 1, 2 und 3 dpf dpf. Separate und zu fotografieren Embryonen positiv für beide GFP und RFP 24. </li><li> Bei 5 dpf, gefrier Chargen von 20 GFP / RFP-positiven und 20 GFP / RFP-negative Embryonen für die Identifizierung von mutierten Gene durch Insertion durch inverse PCR und 5 &#39;RACE 9,10. Heben restlichen GFP / RFP-positiven Embryonen F2-Generation zu etablieren. </li></ol>

<ol>
	<li>Balciunas, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhancer+trapping+in+zebrafish+using+the+Sleeping+Beauty+transposon.">Enhancer trapping in zebrafish using the Sleeping Beauty transposon.</a> BMC Genomics. 5 (1), 62 (2004).</li><li>Trinh le, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+versatile+gene+trap+to+visualize+and+interrogate+the+function+of+the+vertebrate+proteome.">A versatile gene trap to visualize and interrogate the function of the vertebrate proteome.</a> Genes Dev. 25 (21), 2306-2320 (2011).</li><li>Kawakami, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+transposon-mediated+gene+trap+approach+identifies+developmentally+regulated+genes+in+zebrafish.">A transposon-mediated gene trap approach identifies developmentally regulated genes in zebrafish.</a> Dev Cell. 7 (1), 133-144 (2004).</li><li>Emelyanov, A., Parinov, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mifepristone-inducible+LexPR+system+to+drive+and+control+gene+expression+in+transgenic+zebrafish.">Mifepristone-inducible LexPR system to drive and control gene expression in transgenic zebrafish.</a> Dev Biol. 320 (1), 113-121 (2008).</li><li>Ellingsen, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Large-scale+enhancer+detection+in+the+zebrafish+genome.">Large-scale enhancer detection in the zebrafish genome.</a> Development. 132 (17), 3799-3811 (2005).</li><li>Distel, M., Wullimann, M. F., Koster, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimized+Gal4+genetics+for+permanent+gene+expression+mapping+in+zebrafish.">Optimized Gal4 genetics for permanent gene expression mapping in zebrafish.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (32), 13365-13370 (2009).</li><li>Davison, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transactivation+from+Gal4-VP16+transgenic+insertions+for+tissue-specific+cell+labeling+and+ablation+in+zebrafish.">Transactivation from Gal4-VP16 transgenic insertions for tissue-specific cell labeling and ablation in zebrafish.</a> Dev Biol. 304 (2), 811-824 (2007).</li><li>Sivasubbu, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene-breaking+transposon+mutagenesis+reveals+an+essential+role+for+histone+H2afza+in+zebrafish+larval+development.">Gene-breaking transposon mutagenesis reveals an essential role for histone H2afza in zebrafish larval development.</a> Mech Dev. 123 (7), 513-529 (2006).</li><li>Clark, K. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+protein+trapping+produces+a+functional+expression+codex+of+the+vertebrate+proteome.">In vivo protein trapping produces a functional expression codex of the vertebrate proteome.</a> Nat Methods. 8 (6), 506-512 (2011).</li><li>Petzold, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nicotine+response+genetics+in+the+zebrafish.">Nicotine response genetics in the zebrafish.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (44), 18662-18667 (2009).</li><li>Gaiano, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insertional+mutagenesis+and+rapid+cloning+of+essential+genes+in+zebrafish.">Insertional mutagenesis and rapid cloning of essential genes in zebrafish.</a> Nature. 383 (6603), 829-832 (1996).</li><li>Amsterdam, A., Hopkins, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutagenesis+strategies+in+zebrafish+for+identifying+genes+involved+in+development+and+disease.">Mutagenesis strategies in zebrafish for identifying genes involved in development and disease.</a> Trends Genet. 22 (9), 473-478 (2006).</li><li>Balciunas, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Harnessing+a+high+cargo-capacity+transposon+for+genetic+applications+in+vertebrates.">Harnessing a high cargo-capacity transposon for genetic applications in vertebrates.</a> PLoS Genet. 2 (11), e169 (2006).</li><li>Urasaki, A., Morvan, G., Kawakami, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+dissection+of+the+Tol2+transposable+element+identified+the+minimal+cis-sequence+and+a+highly+repetitive+sequence+in+the+subterminal+region+essential+for+transposition.">Functional dissection of the Tol2 transposable element identified the minimal cis-sequence and a highly repetitive sequence in the subterminal region essential for transposition.</a> Genetics. 174 (2), 639-649 (2006).</li><li>Haffter, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+identification+of+genes+with+unique+and+essential+functions+in+the+development+of+the+zebrafish,+Danio+rerio.">The identification of genes with unique and essential functions in the development of the zebrafish, Danio rerio.</a> Development. 123, 1-36 (1996).</li><li>Amsterdam, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+315+genes+essential+for+early+zebrafish+development.">Identification of 315 genes essential for early zebrafish development.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 101 (35), 12792-12797 (2004).</li><li>Scheer, N., Campos-Ortega, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+the+Gal4-UAS+technique+for+targeted+gene+expression+in+the+zebrafish.">Use of the Gal4-UAS technique for targeted gene expression in the zebrafish.</a> Mech Dev. 80 (2), 153-158 (1999).</li><li>Koster, R. W., Fraser, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tracing+transgene+expression+in+living+zebrafish+embryos.">Tracing transgene expression in living zebrafish embryos.</a> Dev Biol. 233 (2), 329-346 (2001).</li><li>Rouet, P., Smih, F., Jasin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Introduction+of+double-strand+breaks+into+the+genome+of+mouse+cells+by+expression+of+a+rare-cutting+endonuclease.">Introduction of double-strand breaks into the genome of mouse cells by expression of a rare-cutting endonuclease.</a> Mol Cell Biol. 14 (12), 8096-8106 (1994).</li><li>Thermes, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=I-SceI+meganuclease+mediates+highly+efficient+transgenesis+in+fish.">I-SceI meganuclease mediates highly efficient transgenesis in fish.</a> Mech Dev. 118 (1-2), 91-98 (2002).</li><li>Lisby, M., Mortensen, U. H., Rothstein, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Colocalization+of+multiple+DNA+double-strand+breaks+at+a+single+Rad52+repair+centre.">Colocalization of multiple DNA double-strand breaks at a single Rad52 repair centre.</a> Nat Cell Biol. 5 (6), 572-577 (2003).</li><li>Bennardo, N., Cheng, A., Huang, N., Stark, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alternative-NHEJ+is+a+mechanistically+distinct+pathway+of+mammalian+chromosome+break+repair.">Alternative-NHEJ is a mechanistically distinct pathway of mammalian chromosome break repair.</a> PLoS Genet. 4 (6), e1000110 (2008).</li><li>Rehn, K., Wong, K. S., Balciunas, D., Sumanas, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrafish+enhancer+trap+line+recapitulates+embryonic+aquaporin+1a+expression+pattern+in+vascular+endothelial+cells.">Zebrafish enhancer trap line recapitulates embryonic aquaporin 1a expression pattern in vascular endothelial cells.</a> Int J Dev Biol. 55 (6), 613-618 (2011).</li><li>Petzold, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SCORE+imaging:+specimen+in+a+corrected+optical+rotational+enclosure.">SCORE imaging: specimen in a corrected optical rotational enclosure.</a> Zebrafish. 7 (2), 149-154 (2010).</li><li>Akitake, C. M., Macurak, M., Halpern, M. E., Goll, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transgenerational+analysis+of+transcriptional+silencing+in+zebrafish.">Transgenerational analysis of transcriptional silencing in zebrafish.</a> Dev Biol. 352 (2), 191-201 (2011).</li><li>Boniface, E. J., Lu, J., Victoroff, T., Zhu, M., Chen, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FlEx-based+transgenic+reporter+lines+for+visualization+of+Cre+and+Flp+activity+in+live+zebrafish.">FlEx-based transgenic reporter lines for visualization of Cre and Flp activity in live zebrafish.</a> Genesis. 47 (7), 484-491 (2009).</li><li>Skarnes, W. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+public+gene+trap+resource+for+mouse+functional+genomics.">A public gene trap resource for mouse functional genomics.</a> Nat Genet. 36 (6), 543-544 (2004).</li><li>Davidson, A. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+gene+delivery+and+gene+expression+in+zebrafish+using+the+Sleeping+Beauty+transposon.">Efficient gene delivery and gene expression in zebrafish using the Sleeping Beauty transposon.</a> Dev Biol. 263 (2), 191-202 (2003).</li></ol>

Diese Autoren haben nichts zu offenbaren.

Die hier beschriebene Gen-Trap-Vektoren und Methoden werden bereits in mehreren unabhängigen Labors verwendet. Nach unserer Erfahrung gibt es zwei wichtige Schritte im Prozess. Der erste wichtige Schritt ist es, hohe Genfallenintegration in Embryonen injiziert F0 zu erreichen. Versagen bei diesem Schritt kann oft RNase Kontamination der Injektion Reagenzien, insbesondere das Miniprep-DNA zurückzuführen. Es ist auch sehr wichtig, Embryonen im Stadium 1 Zelle für die Gen-Trap-Experimente zu injizieren. Nach unserer Erfahrung ist Tol2-vermittelte Transgenese sehr effizient, so dass es möglich ist, transgenen Linien auch bei der Injektion später als die 1-Zell-Stadium oder mit geringerer Qualität DNA zu erhalten. Substandard-Injektionen sind viel problematischer, wenn die Durchführung Genfallenmutagenese, da nur ein kleiner Bruchteil von Vektor-Integrationen führen zu effektiven Gen-Trap-Ereignisse. Die zweite kritische Schritt ist die Gene-Trap-Ereignisse durch Kreuzung zu unserer UAS feststellen: mRFP Linie. Fehlen mRFP Ausdruckfast immer ein Hinweis auf einen Enhancer Trap-Ereignis. Manchmal wird jedoch der Mangel an mRFP Ausdruck kann darauf hindeuten, Silencing der 14x UAS. Es ist daher wichtig, die Fachhochschule zu erhalten: mRFP Linie in einem nicht schall Zustand durch die Verbreitung der nächsten Generation mit Personen mit hohem RFP Ausdruck, wenn zu NSF tpl6 gekreuzt. Wir können voraussehen sie mehrere Verbesserungen an unseren Gen-Trap-Vektoren und Protokoll. Die erste besteht darin, eine weniger wiederholende UAS in der Genfallenkonstrukt verwenden. Es hat sich gezeigt, dass eine 5-fach UAS ist ausreichend, um vollständige Aktivierung in Zellkulturexperimenten zu erzielen, und dass weniger wiederholende UAS-Sequenzen sind weniger anfällig für Methylierung und Silencing 6,25. Es kann auch möglich sein, Gene-Trap-Vektoren für voll bedingte Mutagenese entwerfen, in Analogie zu den von der internationalen Maus Gene-Trap-Konsortiums verwendet und vor kurzem für Zebrafisch 2,26,27 angepasst Vektoren. Eine weitere Verbesserung wäre es, eine andere T verwendenransposon System, zum Beispiel Dornröschen 28, um eine Fachhochschule zu generieren: mRFP Reporter Linie. Dies würde Injektion von Tol2-basierten Gen Fallen direkt in die Reporter-Linie und das Screening von F0s durch Einkreuzung zu ermöglichen. Außerdem würde dies die Verwendung von zwei verschiedenen genetischen Hintergründen zu beseitigen, wodurch die Interpretation der Funktionsverlust-Phänotypen einfacher. Selbst mit diesen Verbesserungen, würde der hier vorgestellten allgemeinen Gal4-Gen-Trap-Protokoll noch voll anwendbar.

Insertionsmutagenese hat sich als ein leistungsfähiges Konzept zu sezieren Gen-Funktion in verschiedenen Modellsystemen von einzelligen Organismen wie Bakterien und Hefe zu mehrzelligen Organismen wie Mäusen und Pflanzen. Alle exogenen DNA (Viren, Transposon oder Plasmid) kann als mutagen durch Unterbrechung wesentlichen Elemente von Genen wie Exons oder Promotoren dienen. Die effektive Ziel solcher einfachen Ansätzen ist in großen, komplexen Genomen äußerst gering, da die Exons umfassen nur 1-3% eines typischen Wirbeltier-Genoms. Kleine effektive Zielgröße kann durch sehr hohe Vektorintegration Raten überwunden werden, wie durch den enormen Erfolg von retroviralen Insertionsmutagenese in Zebrafisch 11,12 veranschaulicht. Im Gegensatz dazu Introns enthalten etwa 20-30% der Wirbeltiere Genome. Im Zebrafisch, Transposon-basierte Insertionsmutagenese-Vektoren, die effektiv null-oder schwere hypomorphen Mutationen auf die Integration in Introns einzuführen wurden &quot;Gen namens brechen transposons &quot;(Haftungshinweise Stellenangebote AGBs) 10.08. Für eine effiziente Genfallenintegration, verwenden sie eine minimale Tol2 Transposon 13,14. Mutagenität von Haftungshinweise Stellenangebote AGBs setzt auf Fisch gewonnene Spleiß-Akzeptor-und Transkriptions Kündigung / Polyadenylierungssequenzen. Die für die GBT Mutagenität verantwortlich Elementen flankiert werden durch direkten loxP-Stellen zur Exzision von Cre-Rekombinase. Somit Injektion von Cre-mRNA führt zu einer effizienten Reversion GBT-induzierten Mutationen, obwohl einige Transposon-Sequenzen bei der Integration Locus 9,10 bleibt. Die kürzlich veröffentlichten GBT Vektoren verwenden mRFP als Gene-Trap-Reporter 9,10, was zu zwei potenzielle Mängel. Erstens ist es nicht bekannt, welcher Anteil des Zebrafisch-Gene auf einem ausreichend hohen Niveau, um durch direkte Fluoreszenz-Reporter-Fusionsproteine ​​nachgewiesen werden ausgedrückt. Zweitens, nur eine kleine Untergruppe von Genen erwartet, dass wesentliche Funktionen haben. Es wurde geschätzt, dass es nur 1,400-2,400 Gene für Zebrafisch erforderlich development 15,16. Die meisten Gen-Trap-Mutanten sind nicht zu erwarten, offene Phänotypen angezeigt, weshalb die begrenzten Nutzen haben. Um diese beiden Beschränkungen zu überwinden, haben wir GBT-R15 9,10 modifiziert, um mit Gal4-VP16 als primäre Gene-Trap-Reporter verwenden (Balciuniene et al. In Vorbereitung). Wie bei August-less mRFP in GBT-R15 wurde die Translationsstartstelle von Gal4-VP16 entfernt. Für den direkten Nachweis von Gen-Trap-Ereignisse enthalten unsere Vektoren eine eGFP-Reporter unter der Kontrolle von 14x Gal4 UAS 17,18. Mehrere zusätzliche Funktionen sind in unserem zweiteiligen Genfallenvektors entwickelt. Die Fachhochschule: eGFP-Kassette wird durch direkte FRT-Stellen (grau Chevrons in Abbildung 1) flankiert. Die Injektion von Flp-Rekombinase mRNA führt zur Exzision der Fachhochschule: eGFP-Kassette, so dass die Gene-Trap-Mutation durch eGFP-Fluoreszenz nicht markiert. Sie kann dann in transgenen Linien, die spezifischen Geweben oder Entwicklungs Veranstaltungen von GFP-Fluoreszenz zu markieren verwendet werden. Wie in anderenHaftungshinweise Stellenangebote AGBs wird das gesamte Gen-Trap-Kassette durch direkten loxP-Stellen (offene Fünfecke in Fig. 1) flankiert. Dies macht Gen-Trap-Ereignisse reversibel durch Expression von Cre-Rekombinase, ohne Festlegung Nachweis der Kausalität Beziehung zwischen einem spezifischen Gen-Trap-Integration und-Phänotyp beobachtet (Abbildung 2). Schließlich wird das Gen-Trap-Kassette durch invertierte I-SceI-Meganuclease Stellen (schwarze Dreiecke in Fig. 1) flankiert. In Drosophila Transposon Integrationen werden oft Deletionen (Mängel), die durch ungenaue Exzision des P-Element umgewandelt. Es gibt keine Beweise dafür, dass Exzision Tol2 Transposons (oder jede andere Transposons bei Wirbeltieren wie Dornröschen, PiggyBac oder Ac / Ds aktiv) kann zu Streichungen führen. Deshalb I-SceI-Sites als potentielle Ersatz Verfahren zur Induktion von Deletionen, obwohl es keinen Beweis, dass I-SceI können Deletionen im Zebrafisch zu induzieren. Es sollte angemerkt werden, dass, während I-SceI MegaNuklease verwendet werden, um Transgenese im Zebrafisch zu erleichtern, ist eine DNA-Spaltung von I-SceI-Meganuclease, DNA-Reparaturmechanismen, einschließlich fehleranfällig nicht-homologen Endverbindung, in Hefe-und Säugerzellen 19-22 studieren. Integration unserer Genfallenvektors können eGFP-Expression durch zwei verschiedene Mechanismen führen. Die erste ist eine wahre Gen-Trap-Ereignisses (Fig. 1C): Der Vektor integriert sich in einem Gen (IMG des mutierten Gens durch Insertion), eine Fusion zwischen dem Transkript 5 &#39;des endogenen IMG Transkript und der Gal4-VP16 hergestellt und in eine für Fusionsprotein, das den N-Terminus des Proteins durch IMG und Gal4-VP16 codiert. Dieses Fusionsprotein bindet an die UAS-14x und aktiviert die Transkription von eGFP. Die zweite, weniger wünschenswert Ereignis ein Enhancer-Trap (1D): der Minimalpromotor vor eGFP fallen unter die Kontrolle eines Verstärkers in der Nähe der Integrationsstelle, was zur Produktion von eGFP in der ab-Sinn des Gal4-VP16 Produktion. In unserer Schätzung 30-50% eGFP-Expression Ereignisse aufgrund einer Enhancer-Trap und 50-70% sind aufgrund eines Gen-Trap-23 (Balciuniene et al. In Vorbereitung). Um zwischen diesen beiden Klassen von Ereignissen zu unterscheiden, die wir gemacht haben 14xUAS: mRFP transgenen Linie (Abbildung 1B), der Einfachheit halber von der Linse spezifische γCry gekennzeichnet: (. Balciuniene et al in Vorbereitung) GFP. Gen-Trap-Ereignisse werden durch Co-Expression von GFP und RFP (vergleiche C und D in Fig. 2) überprüft. In unserer Pilot Bildschirm, erholte wir über 40 Gene-Trap-Ereignisse nach dem Screening 270 F0 Fisch mit einer Mischung aus Transposon-DNA und mRNA Transposase injiziert. Nsf und flr: Zwei unserer Genfallenintegrationen haben in Genen, die mit zuvor veröffentlichten chemisch induzierten Mutanten aufgetreten. Die Phänotypen der Insertionsmutanten nsf tpl6 und flr tpl24 sind oberflächlich nicht von der Phänotyps der entsprechenden chemisch induzierten Mutanten. Wir haben auch festgestellt, dass die Gen-Trap-Ereignisse werden in Richtung der Introns in der Nähe von dem 5&#39;-Ende von Genen, die vorgespannt ist, wodurch die Wahrscheinlichkeit von Null-Allelen zu. Wir beobachten eine gewisse UAS-Silencing (Vielfarbigkeit) in alle unsere Gene-Trap-Linien, und einige Loci sind deutlich anfälliger für Vielfarbigkeit als andere. Wir glauben nicht, dass FH-Silencing ist ein erhebliches Problem für die Ausbreitung der Gene-Trap-Linien, wie wir in der Lage, leicht zu propagieren alle unsere Gene-Trap-Linien durch mindestens fünf Generationen, indem Sie auf GFP-Expression allein.

<table border="1">
<tbody>
 <tr>
 <td>Name of the Reagent/Material</td>
 <td>Company</td>
 <td>Catalog #</td>
 <td>Comments</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Miniprep Kit</td>
 <td>Qiagen</td>
 <td>27104</td>
 <td>Optional PB wash step is a must</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>XbaI restriction enzyme</td>
 <td>ThermoFisher</td>
 <td>ER0681</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>mMessage Machine T3</td>
 <td>Ambion</td>
 <td>AM1348</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>RiboLock RNase Inhibitor</td>
 <td>ThermoFisher</td>
 <td>EO0381</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>RNeasy MinElute</td>
 <td>Qiagen</td>
 <td>74204</td>
 <td>Can be replaced by phenol extraction 			and precipitation. Do not use LiCl!</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Nuclease-free water</td>
 <td>Ambion</td>
 <td>AM9937</td>
 <td>Has to be non-DEPC treated</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Borosilicate glass capiliaries for 			microinjection needles</td>
 <td>World Precision Instruments</td>
 <td>1B100F-4</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Microcapiliaries for calibration</td>
 <td>Drummond Scientific </td>
 <td>1-000-0010</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Microloader tips</td>
 <td>Eppendorf</td>
 <td>5242 956.003</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Needle puller *</td>
 <td>Sutter Instruments</td>
 <td>P-87</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Stereomicroscope 			for microinjection * </td>
 <td>Nikon </td>
 <td>SMZ1500</td>
 <td>We also use Wild 5M and Olympus SZ61 			with transmitted light stand</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Picoinjector *</td>
 <td>Harvard Instruments</td>
 <td>Pli-90</td>
 <td>We also use Pli-100</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Screening microscope with GFP/RFP 			fluorescence *</td>
 <td>Zeiss</td>
 <td>Zeiss AxioImager</td>
 <td>5X Fluar objective has sufficient 			working distance</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Screening microscope with GFP/RFP 			fluorescence *</td>
 <td>Nikon </td>
 <td>SMZ1500</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>* We suggest this equipment only because we successfully use it in our laboratory. In each category, several comparable options from multiple manufacturers are available.</td>
 </tr>
 </tbody>
</table>

gene trapping using gal4 in zebrafish

Große Gelegegröße und externe Entwicklung von optisch transparenten Zebrafisch-Embryonen eine außergewöhnliche Wirbeltier-Modellsystem für die in vivo Insertionsmutagenese unter Verwendung von fluoreszierenden Reporter-Expression von mutierten Genen zu taggen. Mehrere Labors haben Enhancer-und Gen-Trap-Vektoren im Zebrafisch gebaut und getestet, unter Verwendung von fluoreszierenden Proteinen, Gal4-und lexA-basierten Transkriptionsaktivatoren als Reporter 7.1. Diese Vektoren hatte zwei mögliche Nachteile: suboptimal Stringenz (zB mangelnde Fähigkeit, zwischen Enhancer-und Gen-Trap-Ereignisse unterscheiden) und niedrige Mutagenität (zB Integrationen in Gene selten Nullallele produziert). Gene Brechen Transposon (Haftungshinweise Stellenangebote AGBs) wurden entwickelt, um diese Nachteile zu 8-10 ehen. Wir haben eine der ersten GBT Vektoren, GBT-R15 geändert, für die Verwendung mit Gal4-VP16 als primäre Gene-Trap-Reporter und hinzugefügt UAS: eGFP als Sekundär Reporter für den direkten Nachweis von Gen-Trap-Ereignisse. Application von Gal4-VP16 als primäre Gene-Trap-Reporter bietet zwei wesentliche Vorteile. Erstens erhöht sie die Empfindlichkeit für Gene bei niedrigen Expressionsniveaus ausgedrückt. Zweitens ermöglicht es Forschern, Gene-Trap-Linien als Gal4 Treiber direkte Expression von anderen Transgenen in ganz bestimmten Gewebe zu verwenden. Dies ist besonders relevant für Gene, die mit nicht-essentiellen oder redundante Funktionen, wobei Genfallenintegration darf nicht in offene Phänotypen führen. Der Nachteil der Verwendung Gal4-VP16 als primäre Gene-Trap-Reporter ist, dass Gene, die für Proteine ​​mit N-terminalen Signalsequenzen kodieren, sind nicht zugänglich Trapping, wie die daraus resultierenden Gal4-VP16-Fusionsproteine ​​sind kaum in der Lage, den Kern zu geben und zu aktivieren Transkription. Wichtig ist, dass die Verwendung von Gal4-VP16 keine Vorauswahl für Kernproteine: wir gewonnen Gen-Trap-Mutationen in Genen, die Proteine, die im Zellkern, Zytoplasma und Zellmembran Funktion kodiert.

In einem erfolgreichen Injektion, mindestens 80% der Embryonen mit der Gen-Trap-DNA / Tol2 Transposase mRNA Mischung injiziert anzuzeigen gewisse GFP-Fluoreszenz (Fig. 3). Wenn die hellsten GFP-positive Embryonen (3C) ausgewählt, um die F0-Pool zu schaffen, etwa ein in 10 abgeschirmt F0 Fische Gene-Trap-Nachkommen zu erhalten. Unter den F0 Fischen, von denen Gen-Trap-Events gewonnen werden, die meisten übertragen ein einzelnes Gen Trap-Ereignis neben mehreren nicht-exprimierenden Transposon-Integrationen. Allerdings haben wir bis zu vier Gene-Trap-Linien aus einer einzelnen F0 etabliert. GFP / RFP-Gen-Expressionsmuster im Falle Linien reichen von extrem gewebespezifischen (zB im Riechkolben), ziemlich allgegenwärtig. <img alt="Figur 1" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50113/50113fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50113/50113fig1.jpg" /> Fig. 1 ist. Ter GAL4 haltigen zweiteiligen Genfallenvektors GBT-B1 und deren Anwendungen. A. Bestandteile der Gal4-haltigen Genfallenvektors: Tol2 5 &#39;und Tol2 3&#39;, minimal Tol2 Transposonenden 13; cSA, Karpfen β-Actin Spleißakzeptor 8; ^ Gal4-VP16, August-Gal4-VP16 weniger; zp ( A), Zebrafisch-β-Actin-3&#39;-UTR und Poly (A)-Elemente von GBT-R15 9,10. 14XUAS, eGFP und SV40 p (A) sind Bestandteile der Fachhochschule: eGFP-Expressionskassette 17,18. Der Pfeil zeigt die Aktivierung von UAS: eGFP durch Gal4-VP16 von dem Gen-Trap erzeugt B. Die 14XUAS:. MRFP Transgen durch eine Linse spezifische γCry markiert: GFP-Kassette. Der Pfeil zeigt die Aktivierung von UAS: mRFP durch Gal4-VP16 in trans C Gene Trap-Ereignis.. Blaue Kästen sind Exons. Spleißen wird durch die gestrichelte Linie. D. Enhancer Trap-Ereignis angezeigt. Integration des Vektors in der Nähe eines Verstärkers (braun-Box) kann die minimale eGFP-Promotor unter der Kontrolle dieser Enhancer Ort (braun Pfeil). Dies würde zu einer gewebespezifischen Expression von eGFP führen, aber da Gal4-VP16 wird nicht vorgenommen, würde mRFP Ausdruck nicht aktiviert werden. <img alt="Figur 2" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50113/50113fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50113/50113fig2.jpg" /> 2. Reversion von Gen-Trap-Ereignisse mit Cre-Rekombinase. A, B, Schema eines Gene-Trap-Mutation (A) und Cre-Gen-Falle kehrte Allel (B). C, D. Co-Expression von GFP (C) und RFP (D) im Nervensystem der nsf tpl6 Gen Trap-Linie. E, F. Die Injektion von Cre-RNA in nsf tpl6 Embryonen führt zum Verlust der GFP (E) und RFP (F) Ausdruck. Beachten Sie, dass keine Reduzierung der GFP-Expression in der Linse, wie erwartet. 3. Embryonen mit dem GBT-B1 (pDB783)-Gen-Falle injiziert. . A. Embryonen injiziert pGBT-B1 (pDB783) allein wenig GFP-Fluoreszenz-Display im Körper B, C Embryonen injiziert mit pGBT-B1 und Tol2 Transposase mRNA: eine zufällige Gruppe von Embryonen (B) und High-Expressoren für die Aufzucht ausgewählt (C). <img alt="Fig. 4" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/50113/50113fig4highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50113/50113fig4.jpg" /> 4. Experimentelle Entwurf für Einrichtung von Gal4-Gen-Trap Linien. Teilweise überlappend rot / grün Strukturen zeigen, Co-Expression von GFP und RFP, während Grün-Mosaik zeigt allein für die Gen-Trap-oder Enhancer-Trap-Ereignisse.

Watch this Scientific Journal Video about Gene Trapping Using Gal4 in Zebrafish at JoVE.com

Gene Trapping Using Gal4 in Zebrafish

Dieses Protokoll beschreibt die Methode des Gene-Trap-Insertionsmutagenese mit Gal4-VP16 als primäre Reporter und GFP / RFP als Sekundär Reportern im Zebrafisch. Etwa einer von zehn hoch-exprimierenden F0 Fischertrag Genfallen Nachkommen Co-GFP und RFP. Das Screening-Verfahren kann leicht skaliert werden, um auf die Größe des Labors Durchführung der Insertionsmutagenese Bildschirm anzupassen.

Gene Trapping Mit Gal4 in Zebrafisch

Large clutch size and external development of optically transparent embryos make zebrafish an exceptional vertebrate model system for in vivo insertional ...

Research

JoVE Journal

Biology

18.1K Aufrufe.  Temple University.  Dieses Protokoll beschreibt die Methode des Gene-Trap-Insertionsmutagenese mit Gal4-VP16 als primäre Reporter und GFP / RFP als Sekundär Reportern im Zebrafisch. Etwa einer von zehn hoch-exprimierenden F0 Fischertrag Genfallen Nachkommen Co-GFP und RFP. Das Screening-Verfahren kann leicht skaliert werden, um auf die Größe des Labors Durchführung der Insertionsmutagenese Bildschirm anzupassen. 

Serie: Gene Trapping Using Gal4 in Zebrafish

Microinjection of Zebrafish Embryos to Analyze Gene Function

One of the advantages of studying zebrafish is the ease and speed of manipulating protein levels in the embryo.  Morpholinos, which are synthetic oligonucleotides with antisense complementarity to target RNAs, can be added to the embryo to reduce the expression of a particular gene product.  Conversely, processed mRNA can be added to the embryo to increase levels of a gene product.  The vehicle for adding either mRNA or morpholino to an embryo is microinjection.  Microinjection is efficient and rapid, allowing for the injection of hundreds of embryos per hour.  This video shows all the steps involved in microinjection.  Briefly, eggs are collected immediately after being laid and lined up against a microscope slide in a Petri dish.  Next, a fine-tipped needle loaded with injection material is connected to a microinjector and an air source, and the microinjector controls are adjusted to produce a desirable injection volume.  Finally, the needle is plunged into the embryo's yolk and the morpholino or mRNA is expelled.

This video shows how morpholino or mRNA can be injected into zebrafish embryos at the one-cell stage to decrease or increase the level of specific gene products during subsequent development.

Mikroinjektion von Zebrafisch-Embryos, um Gene Function Analyze

One of the advantages of studying zebrafish is the ease and speed of manipulating protein levels in the embryo.  Morpholinos, which are synthetic ...

Forschung

Biologie

Global Gene Expression Analysis Using a Zebrafish Oligonucleotide Microarray Platform

Gene microarray technology permits quantitative measurement and gene expression profiling of transcript levels on a genome-wide basis. Gene microarray technology is used in numerous biological disciplines in a variety of applications including global gene expression analysis in relation to developmental stage, to a disease state, and in toxic responses. Herein, we include a demonstration of global gene expression analysis using a comprehensive zebrafish-specific oligonucleotide microarray platform. The zebrafish expression microarray platform contains 385,000 probes, 60 base pairs in length, interrogating 37,157 targets with up to 12 probes per target. For this platform, all cDNA and genomic information available for the zebrafish was collected from various genomic databases including Ensembl (http://www.ensembl.org), VEGA (http://vega.sanger.ac.uk), UCSC (http://genome.ucsc.edu), and ZFIN (http://www.zfin.org). As a result this expression array provides complete coverage of the current zebrafish transcriptome. The zebrafish expression microarray was printed by Roche NimbleGen (Madison, WI). This technical demonstration includes the fluorescent labeling of a cDNA product, hybridization of the labeled cDNA product to the microarray platform, and array scanning for signal acquisition using the one color analysis strategy.  

Gene microarrays are powerful tools in gene expression profiling at a genome-wide level. This technology has application in a variety of biological disciplines including developmental biology and toxicology. In this video, we detail a protocol for global gene expression analysis using a comprehensive oligonucleotide microarray platform for the zebrafish.

Globale Genexpressionsanalyse Mit einem Zebrafisch Oligonukleotid-Microarray-Plattform

Gene microarray technology permits quantitative measurement and gene expression profiling of transcript levels on a genome-wide basis. Gene microarray ...

Using the Gene Pulser MXcell Electroporation System to Transfect Primary Cells with High Efficiency

It is becoming increasingly apparent that electroporation is the most effective way to introduce plasmid DNA or siRNA into primary cells. The Gene Pulser MXcell electroporation system and Gene Pulser electroporation buffer (Bio-Rad) were specifically developed to easily transfect nucleic acids into mammalian cells and difficult-to-transfect cells, such as primary and stem cells. We will demonstrate how to perform a simple experiment to quickly identify the best electroporation conditions. We will demonstrate how to run several samples through a range of electroporation conditions so that an experiment can be conducted at the same time as optimization is performed. We will also show how optimal conditions identified using 96-well electroporation plates can be used with standard electroporation cuvettes, facilitating the switch from electroporation plates to electroporation cuvettes while maintaining the same electroporation efficiency. In the video, we will also discuss some of the key factors that can lead to the success or failure of electroporation experiments.

This procedure shows how to use the Gene Pulser MXcell electroporation system to rapidly and easily identify the best electroporation conditions for mouse embryonic fibroblasts (MEFs) or other primary cells. Considerations for troubleshooting are also discussed in the associated video.

Mit dem Gene Pulser MXcell Elektroporation System zur Primary Cells mit hohem Wirkungsgrad zu transfizieren

It is becoming increasingly apparent that electroporation is the most effective way to introduce plasmid DNA or siRNA into primary cells. The Gene Pulser ...

Using an Automated Cell Counter to Simplify Gene Expression Studies: siRNA Knockdown of IL-4 Dependent Gene Expression in Namalwa Cells

The use of siRNA mediated gene knockdown is continuing to be an important tool in studies of gene expression.  siRNA studies are being conducted not only to study the effects of downregulating single genes, but also to interrogate signaling pathways and other complex interaction networks.  These pathway analyses require both the use of relevant cellular models and methods that cause less perturbation to the cellular physiology.  Electroporation is increasingly being used as an effective way to introduce siRNA and other nucleic acids into difficult to transfect cell lines and primary cells without altering the signaling pathway under investigation. There are multiple critical steps to a successful siRNA experiment, and there are ways to simplify the work while improving the data quality at several experimental stages.  To help you get started with your siRNA mediated gene knockdown project, we will demonstrate how to perform a pathway study complete from collecting and counting the cells prior to electroporation through post transfection real-time PCR gene expression analysis.  The following study investigates the role of the transcriptional activator STAT6 in IL-4 dependent gene expression of CCL17 in a Burkitt lymphoma cell line (Namalwa).  The techniques demonstrated are useful for a wide range of siRNA-based experiments on both adherent and suspension cells.  We will also show how to streamline cell counting with the TC10 automated cell counter, how to electroporate multiple samples simultaneously using the MXcell electroporation system, and how to simultaneously assess RNA quality and quantity with the Experion automated electrophoresis system.

This procedure describes a quick and easy workflow to introduce siRNA into difficult to transfect cell lines and follow gene expression by real-time PCR. Use of an automated cell counter, multi-well electroporation plate, and automated electrophoresis station provide quick and reliable results without the need for expensive robotic handling.

Verwendung eines automatisierten Cell Counter zu Genexpressionsstudien Simplify: siRNA Knockdown von IL-4 abhängige Genexpression in Namalwalzellen

The use of siRNA mediated gene knockdown is continuing to be an important tool in studies of gene expression.  siRNA studies are being conducted not only ...

Induction and Testing of Hypoxia in Cell Culture

Hypoxia is defined as the reduction or lack of oxygen in organs, tissues, or cells. This decrease of oxygen tension can be due to a reduced supply in oxygen (causes include insufficient blood vessel network, defective blood vessel, and anemia) or to an increased consumption of oxygen relative to the supply (caused by a sudden higher cell proliferation rate). Hypoxia can be physiologic or pathologic such as in solid cancers 1-3, rheumatoid arthritis, atherosclerosis etc&#x2026; Each tissues and cells have a different ability to adapt to this new condition. During hypoxia, hypoxia inducible factor alpha (HIF) is stabilized and regulates various genes such as those involved in angiogenesis or transport of oxygen 4. The stabilization of this protein is a hallmark of hypoxia, therefore detecting HIF is routinely used to screen for hypoxia 5-7. 
In this article, we propose two simple methods to induce hypoxia in mammalian cell cultures and simple tests to evaluate the hypoxic status of these cells.

Here we propose simple methods to induce hypoxia in cell cultures and simple tests to evaluate the hypoxic status of the cultures.

Induktion und Prüfung von Hypoxie in der Zellkultur

Hypoxia is defined as the reduction or lack of oxygen in organs, tissues, or cells.  This decrease of oxygen tension can be due to a reduced supply in ...

In vivo Electroporation of Morpholinos into the Adult Zebrafish Retina

Many devastating inherited eye diseases result in progressive and irreversible blindness because humans cannot regenerate dying or diseased retinal neurons. In contrast, the adult zebrafish retina possesses the robust ability to spontaneously regenerate any neuronal class that is lost in a variety of different retinal damage models, including retinal puncture, chemical ablation, concentrated high temperature, and intense light treatment 1-8. Our lab extensively characterized regeneration of photoreceptors following constant intense light treatment and inner retinal neurons after intravitreal ouabain injection 2, 5, 9. In all cases, resident M&uuml;ller glia re-enter the cell cycle to produce neuronal progenitors, which continue to proliferate and migrate to the proper retinal layer, where they differentiate into the deficient neurons. 
	We characterized five different stages during regeneration of the light-damaged retina that were highlighted by specific cellular responses. We identified several differentially expressed genes at each stage of retinal regeneration by mRNA microarray analysis 10. Many of these genes are also critical for ocular development. To test the role of each candidate gene/protein during retinal regeneration, we needed to develop a method to conditionally limit the expression of a candidate protein only at times during regeneration of the adult retina. 
	Morpholino oligos are widely used to study loss of function of specific proteins during the development of zebrafish, Xenopus, chick, mouse, and tumors in human xenografts 11-14. These modified oligos basepair with complementary RNA sequence to either block the splicing or translation of the target RNA. Morpholinos are stable in the cell and can eliminate or "knockdown" protein expression for three to five days 12. 
	Here, we describe a method to efficiently knockdown target protein expression in the adult zebrafish retina. This method employs lissamine-tagged antisense morpholinos that are injected into the vitreous of the adult zebrafish eye. Using electrode forceps, the morpholino is then electroporated into all the cell types of the dorsal and central retina. Lissamine provides the charge on the morpholino for electroporation and can be visualized to assess the presence of the morpholino in the retinal cells. 
	Conditional knockdown in the retina can be used to examine the role of specific proteins at different times during regeneration. Additionally, this approach can be used to study the role of specific proteins in the undamaged retina, in such processes as visual transduction and visual processing in second order neurons.

In vivo Electroporation of Morpholinos into the Adult Zebrafish Retina

A method to conditionally knockdown a target protein&#x2019;s expression in the adult zebrafish retina is described, which involves intravitreally injecting antisense morpholinos and electroporating them into the retina. The resulting protein is knocked down for several days, which allows testing the protein&#x2019;s role in the regenerating or intact retina.

In-vivo-Elektroporation von Morpholinos in die Adult Zebrafisch Retina

Many devastating inherited eye diseases result in progressive and irreversible blindness because humans cannot regenerate dying or diseased retinal ...

Isolation of Ribosome Bound Nascent Polypeptides in vitro to Identify Translational Pause Sites Along mRNA

The rate of translational elongation is non-uniform. mRNA secondary structure, codon usage and mRNA associated proteins may alter ribosome movement on the messagefor review see 1. However, it's now widely accepted that synonymous codon usage is the primary cause of non-uniform translational elongation rates1. Synonymous codons are not used with identical frequency. A bias exists in the use of synonymous codons with some codons used more frequently than others2. Codon bias is organism as well as tissue specific2,3. Moreover, frequency of codon usage is directly proportional to the concentrations of cognate tRNAs4. Thus, a frequently used codon will have higher multitude of corresponding tRNAs, which further implies that a frequent codon will be translated faster than an infrequent one. Thus, regions on mRNA enriched in rare codons (potential pause sites) will as a rule slow down ribosome movement on the message and cause accumulation of nascent peptides of the respective sizes5-8. These pause sites can have functional impact on the protein expression, mRNA stability and protein foldingfor review see 9. Indeed, it was shown that alleviation of such pause sites can alter ribosome movement on mRNA and subsequently may affect the efficiency of co-translational (in vivo) protein folding1,7,10,11. To understand the process of protein folding in vivo, in the cell, that is ultimately coupled to the process of protein synthesis it is essential to gain comprehensive insights into the impact of codon usage/tRNA content on the movement of ribosomes along mRNA during translational elongation.
Here we describe a simple technique that can be used to locate major translation pause sites for a given mRNA translated in various cell-free systems6-8. This procedure is based on isolation of nascent polypeptides accumulating on ribosomes during in vitro translation of a target mRNA. The rationale is that at low-frequency codons, the increase in the residence time of the ribosomes results in increased amounts of nascent peptides of the corresponding sizes. In vitro transcribed mRNA is used for in vitro translational reactions in the presence of radioactively labeled amino acids to allow the detection of the nascent chains. In order to isolate ribosome bound nascent polypeptide complexes the translation reaction is layered on top of 30% glycerol solution followed by centrifugation. Nascent polypeptides in polysomal pellet are further treated with ribonuclease A and resolved by SDS PAGE. This technique can be potentially used for any protein and allows analysis of ribosome movement along mRNA and the detection of the major pause sites. Additionally, this protocol can be adapted to study factors and conditions that can alter ribosome movement and thus potentially can also alter the function/conformation of the protein.

Isolation of Ribosome Bound Nascent Polypeptides in vitro to Identify Translational Pause Sites Along mRNA

A technique to identify translational pause sites on mRNA is described. This procedure is based on isolation of nascent polypeptides accumulating on ribosomes during in vitro translation of a target mRNA, followed by the size analysis of the nascent chains using a denaturing gel electrophoresis.

Isolierung von Ribosom gebunden Nascent Polypeptide<em&gt; In-vitro-</em&gt; Identifizieren Translational Pause Standorten entlang mRNA

The rate of translational elongation is non-uniform. mRNA secondary structure, codon usage and mRNA associated proteins may alter ribosome movement on the ...

Using SecM Arrest Sequence as a Tool to Isolate Ribosome Bound Polypeptides

Extensive research has provided ample evidences suggesting that protein folding in the cell is a co-translational process1-5. However, the exact pathway that polypeptide chain follows during co-translational folding to achieve its functional form is still an enigma. In order to understand this process and to determine the exact conformation of the co-translational folding intermediates, it is essential to develop techniques that allow the isolation of RNCs carrying nascent chains of predetermined sizes to allow their further structural analysis.
SecM (secretion monitor) is a 170 amino acid E. coli protein that regulates expression of the downstream SecA (secretion driving) ATPase in the secM-secA operon6. Nakatogawa and Ito originally found that a 17 amino acid long sequence (150-FSTPVWISQAQGIRAGP-166) in the C-terminal region of the SecM protein is sufficient and necessary to cause stalling of SecM elongation at Gly165, thereby producing peptidyl-glycyl-tRNA stably bound to the ribosomal P-site7-9. More importantly, it was found that this 17 amino acid long sequence can be fused to the C-terminus of virtually any full-length and/or truncated protein thus allowing the production of RNCs carrying nascent chains of predetermined sizes7. Thus, when fused or inserted into the target protein, SecM stalling sequence produces arrest of the polypeptide chain elongation and generates stable RNCs both in vivo in E. coli cells and in vitro in a cell-free system. Sucrose gradient centrifugation is further utilized to isolate RNCs.
The isolated RNCs can be used to analyze structural and functional features of the co-translational folding intermediates. Recently, this technique has been successfully used to gain insights into the structure of several ribosome bound nascent chains10,11. Here we describe the isolation of bovine Gamma-B Crystallin RNCs fused to SecM and generated in an in vitro translation system.

We describe here a technique that is now routinely used to isolate stably bound ribosome nascent chain complexes (RNCs). This technique takes advantage of the discovery that a 17 amino acid long SecM "arrest sequence" can halt translation elongation in a prokaryotic (E. coli) system, when inserted into (or fused to the C-terminus) of virtually any protein.

Mit SECM Arrest Sequenz als Werkzeug zum Ribosom gebunden Polypeptide isolieren

Extensive research has provided ample evidences suggesting that protein folding in the cell is a co-translational process1-5. However, the exact pathway ...

Gavaging Adult Zebrafish

The zebrafish has become an important in vivo model in biomedical research. Effective methods must be developed and utilized to deliver compounds or agents in solutions for scientific research. Current methods for administering compounds orally to adult zebrafish are inaccurate due to variability in voluntary consumption by the fish. A gavage procedure was developed to deliver precise quantities of infectious agents to zebrafish for study in biomedical research. Adult zebrafish over 6 months of age were anesthetized with 150 mg/L of buffered MS-222 and gavaged with 5 &mu;l of solution using flexible catheter implantation tubing attached to a cut 22-G needle tip. The flexible tubing was lowered into the oral cavity of the zebrafish until the tip of the tubing extended past the gills (approximately 1 cm). The solution was then injected slowly into the intestinal tract. This method was effective 88% of the time, with fish recovering uneventfully. This procedure is also efficient as one person can gavage 20-30 fish in one hour. This method can be used to precisely administer agents for infectious diseases studies, or studies of other compounds in adult zebrafish.

The increasing use of zebrafish as an animal model requires the development of effective methods for the delivery of known quantities of compounds and solutions. The gavage procedure described below allows for the oral delivery of precise volumes of solution reliably, safely and efficiently to adult zebrafish.

Gavaging Adult Zebrafisch

The zebrafish has become an important in vivo model in biomedical research. Effective methods must be developed and utilized to deliver compounds or ...

Rapid and Efficient Zebrafish Genotyping Using PCR with High-resolution Melt Analysis

Zebrafish is a powerful vertebrate model system for studying development, modeling disease, and performing drug screening. Recently a variety of genetic tools have been introduced, including multiple strategies for inducing mutations and generating transgenic lines. However, large-scale screening is limited by traditional genotyping methods, which are time-consuming and labor-intensive. Here we describe a technique to analyze zebrafish genotypes by PCR combined with high-resolution melting analysis (HRMA).&#160;This approach is rapid, sensitive, and inexpensive, with lower risk of contamination artifacts.&#160;Genotyping by PCR with HRMA can be used for embryos or adult fish, including in high-throughput screening protocols.

PCR combined with high-resolution melt analysis (HRMA) is demonstrated as a rapid and efficient method to genotype zebrafish.

Schnelle und effiziente Verwendung von Zebrafisch-Genotypisierung PCR mit Hochauflösende Schmelzanalyse

Zebrafish is a powerful vertebrate model system for studying development, modeling disease, and performing drug screening. Recently a variety of genetic ...