Wir danken Frau Bonnie Phetteplace, RN für die Unterstützung während der Video-Graphik der FNAB Verfahren Demonstration.

Einführung Systemische Amyloidose ist eine sehr variable Krankheit, die extrazelluläre Ablagerung von verschiedenen Proteinen, die gemeinsam als Amyloid bezeichnet bezieht. Deposition dieser Amyloid-Fibrillen mit Beta gefalteten Konfiguration führt zu verschiedenen klinischen Präsentationen in Abhängigkeit von der betroffenen Organe. Die meisten klinisch relevanten Manifestationen der systemischen Amyloidose werden zur Kenntnis genommen, wenn ein Eingreifen von kritischen Organen wie Herz, Leber und / oder Niere. Historisch gesehen, wären diese beteiligt Organe biopsiert, um das Vorhandensein von Amyloid zu demonstrieren. Diese mäßig invasive Verfahren durchgeführt ein erhebliches Risiko, einschließlich Blutungen. Fettpolster Aspiration seither gezeigt, dass eine zuverlässige und nichtinvasive Methode zum Nachweis von Amyloid in der systemischen Amyloidose 1 bereitzustellen. Dieses Verfahren ist im Wesentlichen vergleichbar mit der Fettabsaugung des subkutanen Fettgewebes in der vorderen Bauchwand unter örtlicher Betäubung zu fibroadipose Gewebe für die Bewertung kaum Amyloid-Ablagerungen in den kleinen Blutgefäßen Wände 2 abzurufen. Die am häufigsten verwendeten Methode zur Identifizierung Amyloid im Gewebe bleibt die charakteristische apfelgrüne Doppelbrechung Muster gesehen, wenn Kongorot gefärbten Schnitten unter einem Polarisationsmikroskop 3 sind visualisiert. Wenn Fettpolster Aspiration durchgeführt wird, kann Kongo rote Flecken auf beiden direkten verschmiert Dias oder Zellenblock Vorbereitungen der angesaugten Fettgewebe erfolgen. Allerdings haben Patienten in frühen Stadien der Amyloidose spärliche Amyloid-Ablagerungen, die stark reduziert die Empfindlichkeit des Kongorot gefärbte Zelle blockieren Abschnitten 4,5. Ultrastrukturelle Auswertung der Fettpolster saugt mittels Elektronenmikroskopie hat eine bessere Reproduzierbarkeit und verbesserte Empfindlichkeit 4. Daher ist es empfehlenswert, alle Fettpolster saugt sowohl für Vorbereitung einer Zelle blockieren und für die Durchführung der Elektronenmikroskopie 2 Einreichen. Fettpolster Anspruch ist relativ kostengünstig und nicht-invasive Methode zur Gewinnung von Gewebe systemische Amyloidose zu diagnostizieren. Dieser Artikel beschreibt, Fettpolster Aspiration Verfahren zusammen mit Einzelheiten über Probenaufbereitung bis Probe für beide Kongorotfärbung und ultrastrukturelle Auswertung mittels Elektronenmikroskopie einzureichen. In diesem Video zeigen wir, diese reproduzierbar und einfaches Verfahren, um eine optimale Diagnose-Material abrufen. 1. Durchführen der FNA der Anterior Fat Pad A. Betäubung der lokalen Bereich (Abb. 1 &amp; 2) <ol><li> Mit Alkoholtupfer oder die Haut Reinigungsmittel von einer bestimmten Institution bevorzugt, reinigen Sie die Haut an den unteren Quadranten Bereich des Bauches lateral der Mittellinie und unterhalb des Nabels (Abbildung 1). </li><li> Markieren Sie eine rautenförmige Fläche ca. 2 x 2 Zoll, wie in Abbildung 1 mit einem Markierstift gezeigt. </li><li> Saugen Sie ca. 10 ml 1% Lidocain mit einer 18G Nadel. Bringen Sie einen 25G 1 ½-Zoll-Nadel auf die Spritze. Entfernen Sie eventuell eingeschlossene Luft durch Antippen des aufrechten Spritze beim Drücken Sie den Kolben, bis die Flüssigkeit abgegeben wird und keine Luftblasen vorhanden sind. </li><li> Anesthetize entlang der Grenzen der rautenförmigen Fläche bereits markiert, wie in Abbildung 2 dargestellt. Starten Sie, indem Sie die 25G-Nadel unter die Haut am Punkt A und vorsichtig die Nadel subkutan Punkt X. Ziehen wieder auf den Spritzenkolben, um sicherzustellen, dass Sie sich nicht innerhalb eines Gefäßes. Dann langsam den Kolben zu infiltrieren bis zu 2,5 ml Lidocain (ca. ¼ der Lidocain in 10 ml-Spritze), während die Nadel auf A, ohne dass die Nadel aus der Haut am Punkt A (Abbildung 2a3) come point. Mit der Nadel noch unter der Haut verändern Richtung Punkt Y (Abbildung 2a4) und drücken Sie die Nadel subkutan zu Punkt Y (Abb. 2b1). Nach wie vor bestätigen, dass die Nadel nicht in ein Gefäß und verzichten etwa 2,5 ml Lidocain, während langsam die Nadel durch den Punkt A (Abb. 2b3 durch 2b4). Wiederholen Sie ähnliche Schritte ab Punkt B und Abgabe Lidocain subkutan von den Punkten B, X und B auf Y (Abbildung 2C1 durch 2D4). Verhindern Blutungen aus den Stachel A und B von der Firma Anwendung von sterilen gauge Stück. </li><li> Sie können nun überprüfen, dass das Gebiet betäubt wird durch leichtes Berühren der Haut innerhalb der narkotisierten rautenförmigen von Spitze / Ecke Baumwollgaze Stück, durch den Vergleich mit benachbarten nicht narkotisierten Haut. </li></ol> B. Performing Fettpolster Aspiration (Abbildung 3) (Anwendung von örtlicher Betäubung vor der Leistung der Fettpolster Aspiration kann umgangen werden, abhängig von der regionalen und individuellen Vorlieben. Ordnungsgemäß durchgeführt FNAB Verfahren für die vordere Fettpolster Aspiration in einem Prick abgeschlossen werden kann. Je nach der Schmerzgrenze des einzelnen Patienten , Manövrieren von 18G Nadel hin und her in das subkutane Fettgewebe ist relativ distreszu singen. Die Betäubung hier beschriebene Methode wird erreicht, in nur zwei Stiche mit 25G Nadel und vermeidet die Schmerzen mit einer verbesserten Toleranz gegenüber dem Verfahren.) <ol><li> Montieren 18G 1 ½-Zoll-Nadel auf eine 10 ml Spritze. Montieren Sie die Spritze-Nadeleinheit in die Spritze greifen (&quot;FNAB Griff / gun&quot;) für die ordnungsgemäße Anwendung und Freisetzung von Vakuum. </li><li> Führen Sie die Spitze der Nadel in das subkutane Fettgewebe innerhalb der gereinigt und betäubt rautenförmigen Fläche (Abbildung 3a). </li><li> Komplett zurückziehen den Kolben der Spritze mit der Nadel in das subkutane Gewebe eingefügt werden, um Vakuum (Abbildung 3b) zu generieren. </li><li> Pflegen Sie die Vakuum-und Handlungsspielraum der Nadel hin und her in verschiedene Richtungen in das subkutane Fettgewebe (Abbildung 3c durch 3i). Jeder Strich muss so lange wie möglich mit der Länge der Nadel, ohne dass die Nadel aus der Haut kommen ausgewählt. Maximale Abtastrate wird durch die Richtung ändern mit jedem Schlag (Abb. 3i) erreicht. Es ist wichtig, um die Richtung der Nadel tangential zur Serosa und parallel zur Hautoberfläche zu vermeiden Punktion der Bauchhöhle zu halten. </li><li> Die fibroadipose Gewebe sammelt sich in der Spritze. Sobald genügend fibroadipose Gewebestücke (bis zu 1 mL der Fragmente reiche Blut vermischt Probe) abgerufen werden, das Vakuum vollständig und entfernen Sie die Nadel (Abb. 3k). </li><li> Lassen Sie den Patienten oder die Assistentin festen Druck auf den Bereich der Verfahrens mit einem Pad aus Gaze zu Blutaustritt zu verhindern. </li></ol> 2. Verarbeitung von Proben <ol><li> Legen Sie mindestens 5-6 Fragmente fibroadipose Gewebe in Glutaraldehyd-Lösung für die Elektronenmikroskopie (Abbildung 4B). </li><li> Abhängig von der institutionellen Protokoll, kann ein paar Abstrichen der fibroadipose Gewebestücke durch Verteilung zwischen zwei Folien (Abbildung 4A) hergestellt werden. </li><li> Das verbleibende Material wird zur Gerinnung in der Spritze (dies kann 5-7 Minuten dauern, je nach der Gerinnungszeit) (Abbildung 4C) erlaubt. </li><li> Saugen Sie 10% Formalin in die Spritze so, dass die geronnene fibroadipose Gewebematerial aus der Wand der Spritze und frei schwebende (Abb. 4C2) wird verdrängt. Entfernen Sie den Kolben aus der Spritze (Abb. 4C3) und übertragen Sie die geronnene fibroadipose Gewebe in der 10%-Formalin-Container aus dem offenen Ende der Spritze gegenüber der Düse Ende (Abb. 4C4). </li><li> Beschriften Sie die Behälter entsprechend und senden Sie das Glutaraldehyd für Elektronenmikroskopie und der Formalin für H &amp; E Bereich und Kongorot-Färbung für die Auswertung unter Polarisationsmikroskopie. Wenn Abstrichen bereit sind, können sie nach dem Protokoll der einzelnen Labor verarbeitet werden. </li></ol><img src="/files/ftp_upload/1747/1747fig1.jpg" alt="Abbildung 1" /> Abbildung 1. Bereich zu sein für FNAB der vorderen Fettpolster betäubt. <img src="/files/ftp_upload/1747/1747fig2.jpg" alt="Abbildung 2" /> Abbildung 2. Betäubung der Umgebung. <img src="/files/ftp_upload/1747/1747fig3.jpg" alt="Abbildung 3" /> Abbildung 3. Performing FNAB der vorderen Fettpolster. <img src="/files/ftp_upload/1747/1747fig4.jpg" alt="Abbildung 4" /> Abbildung 4. Die Verarbeitung des vorderen Fettpolster absaugen zu Labor zum Nachweis von Amyloid-Ablagerungen eingereicht werden. 3. Repräsentative Ergebnisse <img src="/files/ftp_upload/1747/1747fig5.jpg" alt="Abbildung 5" /> Abbildung 5. Amyloid in der Wand der kleinen Blutgefäße in fibroadipose Gewebefragmente. Fibroadipose Gewebe wurde in Formalin verarbeitet, Paraffin eingebettet, gefärbt mit Kongorot, und untersucht durch polarisierende Lichtmikroskopie. Amyloid in der Wand der kleinen Blutgefäße zeigt, Apfelgrün Doppelbrechung (weißer Pfeil). <img src="/files/ftp_upload/1747/1747fig6.jpg" alt="Abbildung 6" /> Abbildung 6. Tissue fehlt Amyloidose. Die Apfelgrün Doppelbrechung ist in Geweben von einem anderen Patienten fehlen, ohne Amyloidose. Blau Doppelbrechung (weißer Pfeil) von Kollagenfasern, sind in der Regel in fast allen Proben anwesend. <img src="/files/ftp_upload/1747/1747fig7.jpg" alt="Abbildung 7" /> Abbildung 7. Fibrillen im Einklang mit Amyloid in der Gefäßwand. Elektronenmikroskopische Aufnahme von geraden, nicht verzweigt, 8-10 nm Durchmesser Fibrillen durch Amyloid in der Gefäßwand gebildet zufällig verstreut.

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Die Diagnose der Amyloidose ist in der Regel mit einer Gewebeprobe des betroffenen Organe wie Niere, Leber und / oder des Herzens erreicht. Dieser Ansatz hat eine hohe diagnostische Ausbeute ist jedoch invasiv und kann mit Komplikationen wie Blutungen 2 zugeordnet werden. Rectal, Zahnfleisch und Knochenmark Biopsien wurden für die Diagnose als relativ weniger invasive Ansatz in den 1960er Jahren 6,7,8 bevorzugt. Abdominal Fettpolster Aspiration wurde 1973 als eine sichere, minimal-invasive, einfach und weniger teures Verfahren für das Tissue Diagnose einer systemischen Amyloidose 1 angegeben. Allerdings ist die Einzelheiten des Verfahrens und den Ansatz für die Verarbeitung der abgerufenen Probe nicht zusammenhängend berichtet. Das Video und die Artikel beschreiben das Verfahren Schritt für Schritt. Der Ansatz zum Nachweis von Amyloid in Fettpolster Aspiration, ähnlich, ist auch nicht gut standardisiert mit ein paar Studien zum Vergleich und Bewertung verschiedener Ansätze 1,5,6,7,8. Evaluation der vorderen Fettpolster saugt mit Kongorotfärbung weniger empfindlich ist mit niedrigeren Interobserver Reproduzierbarkeit vor allem in frühen Fällen der Amyloidose mit wenig Amyloid-Ablagerungen 5. Immunhistochemie durchgeführt am Formalin-fixierten Paraffin eingebetteten Zellenblock Abschnitte und Kongo rote Fluoreszenz auf zytologische Abstriche durchgeführt wurde berichtet, dass die diagnostische Sensitivität 9,10 zu verbessern. Elektronenmikroskopie verbessert die Detektion und Identifizierung von wenig Amyloid-Fibrillen in kleinen Gefäßwände in den fibroadipose Gewebe in Fettpolster saugt 4, 5. Basierend auf diesen Informationen, beschreibt dieser Artikel die Verarbeitung der Probe zu Zelle blockiert (für die Auswertung von Kongorot gefärbte Zelle blockieren Abschnitten unter Polarisationsmikroskop für diagnostische Apfelgrün Doppelbrechung und auch für die Immunhistochemie wie angegeben) und für die Elektronenmikroskopie vorbereitet. Allerdings, je nach Ansatz für die Auswertung der Probe für Amyloid gewählt, kann es zu zytologischen Abstrich Vorbereitung, Zellenblock Vorbereitung und Verarbeitung für die Elektronenmikroskopie unterworfen werden. Einige Labors die Tests auf die Flecken aus der angesaugten fibroadipose Gewebestücke präpariert und gefärbt mit Kongorot, um die Fluoreszenz 10 Studie. Generell in einem späten Amyloidose, kann die Lichtmikroskopie mit Kongorot Polarisationsmikroskopie ausreichend sein, jedoch in frühen Stadien der Erkrankung Kongorotfärbung mit Polarisationsmikroskopie auf Zellenblock Abschnitte ist weniger empfindlich und zuverlässig für Fettpolster saugt 4,5,11 . Andere Spezialfärbungen einschließlich Thioflavin T kann mit ähnlichen Einschränkungen verwendet werden. Andere Ansätze zur Amyloid erkennen auch eine Auswertung der absaugen Abstriche für Amyloid mit Kongorot polarisierenden Mikroskopie und Fluoreszenz-10. In unserer Erfahrung dieser Methode ist weniger reproduzierbar. Evaluation der Blutgefäße in Fettpolster für Amyloid durch Elektronenmikroskopie überwindet diese Einschränkungen 4,11. Die weitere Charakterisierung von Amyloid durch Immunelektronenmikroskopie 12 sind gemeldet, aber diese Methoden nicht zur Verfügung stehen häufig in einem nicht-tertiären Versorgungszentren Einstellung. Nadeln für die Durchführung von Aspiration Verfahren verwendet werden, können nach ihrer Lehre Größen in feine (21-25G), mittlere (18-20G) und große (z. B.-14G) 11 eingestuft werden. Anterior Fettpolster Bestrebungen wurde berichtet, dass durch die Verwendung variabler Lehren von mittleren (18 bis 20G), feine (21 bis 22G) 2,10 durchgeführt werden. Die meisten der Masse Läsionen sind mit feiner Gauge-Nadeln (wie z. B. 25G) angesaugt, um gute zytologische Abstriche zusammen mit weiteren Durchgänge mit breiter Nadel (zB 18G), um zusätzliche Probe für Zellblöcke abrufen zu erhalten. Während vordere Fettpolster Aspiration, wird der Zusammenhalt fibroadipose Gewebe nicht gut absaugen mit feiner Nadeln. Cell Block Vorbereitung und Elektronenmikroskopie zur Auswertung von kleinen Gefäßwände in fibroadipose Gewebestücke in das Fett saugt wichtig. Wider Gauge-Nadeln (z. B. 18G) wird empfohlen, diagnostische angemessene materielle 2,10 ergeben. Da das Verfahren ist vergleichbar mit dem konventionellen FNAB ist Fettpolster Anspruch, als FNAB bezeichnet, obwohl breiter Gauge-Nadeln für die Durchführung it 5 verwendet werden.

A correction was made to <a href="http://www.jove.com/index/details.stp?id=1747">Performing and Processing FNA of Anterior Fat Pad for Amyloid</a>. There was an error with an author's name. The author's last name had a typo and was corrected to:
Safwan S. Jaradeh
instead of:
Safwan S. Jardeh

Erratum: Performing and Processing FNA of Anterior Fat Pad for Amyloid

Alkoholtupfer, Gazekompressen, Markierstift, 10 ml-Spritzen x2, 1% Lidocain (Lokalanästhetikum Lidocain-Wenn allein verwendet wird, verursacht es eine anfängliche Brennen nach Instillation. Das mit einem 1:1-Gemisch von 1% verhindert werden kann Lidocain und 1% Natrium-bi-Carbonat), 18 Gauge (G) 1 ½-Zoll-Nadeln x2 (für die Durchführung von FNAB), 25G 1 ½-Zoll-Nadel (für die Injektion örtlicher Betäubung), FNA Spritzenhalter (&quot;gun&quot;), Verband, Fläschchen mit Glutaraldehyd (für Elektronenmikroskopie) und Biopsie-Container von 10% Formalin.

performing and processing fna of anterior fat pad for amyloid

In der Vergangenheit wurden Herz, Leber und Niere Biopsien durchgeführt werden, um Amyloid-Ablagerungen im Amyloidose zu demonstrieren. Da das klinische Erscheinungsbild dieser Krankheit ist so variabel und unspezifisch sind die damit verbundenen Risiken dieser Biopsien zu groß für die diagnostische Ausbeute. Andere Websites, die einen niedrigeren Biopsie Risiko, wie Haut oder Zahnfleisch haben, sind auch relativ invasiv und teuer. Darüber hinaus können diese Biopsien nicht immer ausreichend Amyloid-Ablagerungen, eine Diagnose zu stellen. Fettpolster Aspiration hat gute klinische Korrelation mit niedrigen Kosten und minimaler Morbidität gezeigt. Allerdings gibt es noch keine standardisierten Protokolle zur Durchführung dieses Verfahrens-oder Verarbeitung der angesaugten Probe, die variable und nicht reproduzierbaren Ergebnissen führt. Die am häufigsten verwendeten Modalität zur Detektion von Amyloid im Gewebe ist ein Apfel-grüne Doppelbrechung auf Kongorot gefärbten Schnitten unter dem Polarisationsmikroskop. Diese Technik erfordert Zellenblock Vorbereitung der angesaugten Material. Leider haben Patienten im frühen Stadium der Amyloidose minimale Mengen von Amyloid, das reduziert die Empfindlichkeit des Kongorot gefärbte Zelle blockieren Teile der Fettpolster saugt. Daher sollten ultrastrukturelle Auswertung der Fettpolster saugt mittels Elektronenmikroskopie genutzt werden, da ihre erhöhte Sensibilität für Amyloid-Erkennung. Dieser Artikel beschreibt eine einfache und reproduzierbare Vorgehensweise zur Durchführung vordere Fettpolster Aspiration für den Nachweis von Amyloid-Nutzung beider Kongorotfärbung der Zelle blockieren Abschnitte und Elektronenmikroskopie für ultrastrukturelle Identifizierung.

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Performing and Processing FNA of Anterior Fat Pad for Amyloid

Fettpolster Bestreben ist es eine bevorzugte, minimal-invasive und kostengünstige Ansatz als Vergleich zu anderen Methoden, um Amyloid zur Diagnose einer systemischen Amyloidose zu erkennen. Dieses Video Artikel beschreibt eine prozedurale Entwurf für die Durchführung Fettpolster Aspiration mit entsprechender Verarbeitung der Proben für die optimale diagnostische Ergebnisse.

Durchführung und Abwicklung der FNA Anterior Fat Pad für Amyloid

Historically, heart, liver, and kidney biopsies were performed to demonstrate amyloid deposits in amyloidosis.  Since the clinical presentation of this ...

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Research

JoVE Journal

Medicine

54.8K Aufrufe.  Medical College of Wisconsin. Fettpolster Bestreben ist es eine bevorzugte, minimal-invasive und kostengünstige Ansatz als Vergleich zu anderen Methoden, um Amyloid zur Diagnose einer systemischen Amyloidose zu erkennen. Dieses Video Artikel beschreibt eine prozedurale Entwurf für die Durchführung Fettpolster Aspiration mit entsprechender Verarbeitung der Proben für die optimale diagnostische Ergebnisse.

Serie: Performing and Processing FNA of Anterior Fat Pad for Amyloid

Purification and Aggregation of the Amyloid Precursor Protein Intracellular Domain

Amyloid precursor protein (APP) is a type I transmembrane protein associated with the pathogenesis of Alzheimer's disease (AD). APP is characterized by a large extracellular domain and a short cytosolic domain termed the APP intracellular domain (AICD). During maturation through the secretory pathway, APP can be cleaved by proteases termed &alpha;, &beta;, and &gamma;-secretases1. Sequential proteolytic cleavage of APP with &beta; and &gamma;-secretases leads to the production of a small proteolytic peptide, termed A&beta;, which is amyloidogenic and the core constituent of senile plaques. The AICD is also liberated from the membrane after secretase processing, and through interactions with Fe65 and Tip60, can translocate to the nucleus to participate in transcription regulation of multiple target genes2,3. Protein-protein interactions involving the AICD may affect trafficking, processing, and cellular functions of holo-APP and its C-terminal fragments. We have recently shown that AICD can aggregate in vitro, and this process is inhibited by the AD-implicated molecular chaperone ubiquilin-14. Consistent with these findings, the AICD has exposed hydrophobic domains and is intrinsically disordered in vitro5,6, however it obtains stable secondary structure when bound to Fe657. We have proposed that ubiquilin-1 prevents inappropriate inter- and intramolecular interactions of AICD, preventing aggregation in vitro and in intact cells4. While most studies focus on the role of APP in the pathogenesis of AD, the role of AICD in this process is not clear. Expression of AICD has been shown to induce apoptosis8, to modulate signaling pathways9, and to regulate calcium signaling10. Over-expression of AICD and Fe65 in a transgenic mouse model induces Alzheimer's like pathology11, and recently AICD has been detected in brain lysates by western blotting when using appropriate antigen retrieval techniques12. To facilitate structural, biochemical, and biophysical studies of the AICD, we have developed a procedure to produce recombinantly large amounts of highly pure AICD protein. We further describe a method for inducing the in vitro thermal aggregation of AICD and analysis by atomic force microscopy. The methods described are useful for biochemical, biophysical, and structural characterization of the AICD and the effects of molecular chaperones on AICD aggregation.

A method for large-scale purification of the APP intracellular domain (AICD) is described. We also describe methodology to induce in vitro AICD aggregation and visualization by atomic force microscopy. The methods described are useful for biochemical/structural characterization of the AICD and the effects of molecular chaperones on its aggregation.

Reinigung und Aggregation des Amyloid Precursor Protein intrazelluläre Domäne

Amyloid precursor protein (APP) is a type I transmembrane protein associated with the pathogenesis of Alzheimer's disease (AD). APP is characterized by a ...

Forschung

Medizin

Processing of Human Reduction Mammoplasty and Mastectomy Tissues for Cell Culture

Experimental examination of normal human mammary epithelial cell (HMEC) behavior, and how normal cells acquire abnormal properties, can be facilitated by in vitro culture systems that more accurately model in vivo biology. The use of human derived material for studying cellular differentiation, aging, senescence, and immortalization is particularly advantageous given the many significant molecular differences in these properties between human and commonly utilized rodent cells1-2. Mammary cells present a convenient model system because large quantities of normal and abnormal tissues are available due to the frequency of reduction mammoplasty and mastectomy surgeries.
The mammary gland consists of a complex admixture of many distinct cell types, e.g., epithelial, adipose, mesenchymal, endothelial. The epithelial cells are responsible for the differentiated mammary function of lactation, and are also the origin of the vast majority of human breast cancers. We have developed methods to process mammary gland surgical discard tissues into pure epithelial components as well as mesenchymal cells3. The processed material can be stored frozen indefinitely, or initiated into primary culture. Surgical discard material is transported to the laboratory and manually dissected to enrich for epithelial containing tissue. Subsequent digestion of the dissected tissue using collagenase and hyaluronidase strips stromal material from the epithelia at the basement membrane. The resulting small pieces of the epithelial tree (organoids) can be separated from the digested stroma by sequential filtration on membranes of fixed pore size. Depending upon pore size, fractions can be obtained consisting of larger ductal/alveolar pieces, smaller alveolar clusters, or stromal cells. We have observed superior growth when cultures are initiated as organoids rather than as dissociated single cells. Placement of organoids in culture using low-stress inducing media supports long-term growth of normal HMEC with markers of multiple lineage types (myoepithelial, luminal, progenitor)4-5. Sufficient numbers of cells can be obtained from one individual's tissue to allow extensive experimental examination using standardized cell batches, as well as interrogation using high throughput modalities.
Cultured HMEC have been employed in a wide variety of studies examining the normal processes governing growth, differentiation, aging, and senescence, and how these normal processes are altered during immortal and malignant transformation4-15,16. The effects of growth in the presence of extracellular matrix material, other cell types, and/or 3D culture can be compared with growth on plastic5,15. Cultured HMEC, starting with normal cells, provide an experimentally tractable system to examine factors that may propel or prevent human aging and carcinogenesis.

A method to process human mammary surgical discard material is described. Processed tissue, in the form of organoids, can be stored frozen indefinitely or placed in culture for long-term growth. This method enables experimental examination of normal human epithelial cell biology, and the effects of exogenous perturbations.

Verarbeitung von Human Reduction Mammoplastik und Mastektomie Gewebe für die Zellkultur

Experimental  examination of normal human mammary epithelial cell (HMEC) behavior, and how  normal cells acquire abnormal properties, can be facilitated ...

Orthotopic Injection of Breast Cancer Cells into the Mammary Fat Pad of Mice to Study Tumor Growth.

Breast cancer growth can be studied in mice using a plethora of models. Genetic manipulation of breast cancer cells may provide insights into the functions of proteins involved in oncogenic progression or help to discover new tumor suppressors. In addition, injecting cancer cells into mice with different genotypes might provide a better understanding of the importance of the stromal compartment. Many models may be useful to investigate certain aspects of disease progression but do not recapitulate the entire cancerous process. In contrast, breast cancer cells engraftment to the mammary fat pad of mice better recapitulates the location of the disease and presence of the proper stromal compartment and therefore better mimics human cancerous disease. In this article, we describe how to implant breast cancer cells into mice orthotopically and explain how to collect tissues to analyse the tumor milieu and metastasis to distant organs. Using this model, many aspects (growth, angiogenesis, and metastasis) of cancer can be investigated simply by providing a proper environment for tumor cells to grow.

Cancer is a complex disease that is influenced by the tissue surrounding the tumor as well as local pro- and anti-inflammatory mediators. Therefore, orthotropic injection models, rather than subcutaneous models may be useful to study cancer progression in a manner that better mimics human pathology.

Orthotopische Injektion von Brustkrebszellen in das Brustfettpolster von Mäusen, das Tumorwachstum zu studieren.

Breast cancer growth can be studied in mice using a plethora of models. Genetic manipulation of breast cancer cells may provide insights into the ...

Assessment of Viability of Human Fat Injection into Nude Mice with Micro-Computed Tomography

Lipotransfer is a vital tool in the surgeon&#8217;s armamentarium for the treatment of soft tissue deficits of throughout the body. Fat is the ideal soft tissue filler as it is readily available, easily obtained, inexpensive, and inherently biocompatible.1 However, despite its burgeoning popularity, fat grafting is hampered by unpredictable results and variable graft survival, with published retention rates ranging anywhere from 10-80%. 1-3
To facilitate investigations on fat grafting, we have therefore developed an animal model that allows for real-time analysis of injected fat volume retention. Briefly, a small cut is made in the scalp of a CD-1 nude mouse and 200-400 &#181;l&#160;of processed lipoaspirate is placed over the skull. The scalp is chosen as the recipient site because of its absence of native subcutaneous fat, and because of the excellent background contrast provided by the calvarium, which aids in the analysis process. Micro-computed tomography (micro-CT) is used to scan the graft at baseline and every two weeks thereafter. The CT images are reconstructed, and an imaging software is used to quantify graft volumes.
Traditionally, techniques to assess fat graft volume have necessitated euthanizing the study animal to provide just a single assessment of graft weight and volume by physical measurement ex vivo. Biochemical and histological comparisons have likewise required the study animal to be euthanized. This described imaging technique offers the advantage of visualizing and objectively quantifying volume at multiple time points after initial grafting without having to sacrifice the study animal. The technique is limited by the size of the graft able to be injected as larger grafts risk skin and fat necrosis. This method has utility for all studies evaluating fat graft viability and volume retention. It is particularly well-suited to providing a visual representation of fat grafts and following changes in volume over time.

Fat grafting is an essential technique for reconstructing soft tissue deficits. However, it remains an unpredictable procedure characterized by variable graft survival. Our goal was to devise a mouse model that utilizes a novel imaging method to compare volume retention between differing techniques of fat graft preparation and delivery.

Beurteilung der Lebensfähigkeit der Menschen Fat Injektion in Nacktmäusen mit Micro-Computertomographie

Lipotransfer is a vital tool in the surgeon&#8217;s armamentarium for the treatment of soft tissue deficits of throughout the body. Fat is the ideal soft ...

Transplantation Into the Mouse Ovarian Fat Pad

Orthotopic transplantation assays in mice are invaluable for studies of cell regeneration and neoplastic transformation. Common approaches for orthotopic transplantation of ovarian surface and tubal epithelia include intraperitoneal and intrabursal administration of cells. The respective limitations of these methods include poorly defined location of injected cells and limited space volume. Furthermore, they are poorly suited for long-term structural preservation of transplanted organs. To address these challenges, we have developed an alternative approach, which is based on the introduction of cells and tissue fragments into the mouse fat pad. The mouse ovarian fat pad is located in the immediate vicinity of the ovary and uterine tube (aka oviduct, fallopian tube), and provides a familiar microenvironment for cells and tissues of these organs. In our approach fluorescence-labeled mouse and human cells, and fragments of the uterine tube are engrafted by using minimally traumatic dorsal incision surgery. Transplanted cells and their outgrowths are easily located in the ovarian fat pad for over 40 days. Long-term transplantation of the entire uterine tube allows correct preservation of all principle tissue components, and does not result in adverse side effects, such as fibrosis and inflammation. Our approach should be uniquely applicable for answering important biological questions such as differentiation, regenerative and neoplastic potential of specific cell populations. Furthermore, it should be suitable for studies of microenvironmental factors in normal development and cancer.

We describe an ovarian fad pad transplantation assay suitable for studies of normal and transformed epithelia of the female reproductive tract. The mouse fat pad allows transplantation of large tissue fragments, is easily accessible for surgery and imaging, and provides the most favorable native environment for tissues of M&#252;llerian origin.

Transplantation in die Maus Ovarian Fat Pad

Orthotopic transplantation assays in mice are invaluable for studies of cell regeneration and neoplastic transformation. Common approaches for orthotopic ...

Confirmation of Myocardial Ischemia and Reperfusion Injury in Mice Using Surface Pad Electrocardiography

Many animal models have been established for the study of myocardial remodeling and heart failure due to its status as the number one cause of mortality worldwide. In humans, a pathologic occlusion forms in a coronary artery and reperfusion of that occluded artery is considered essential to maintain viability of the myocardium at risk. Although essential for myocardial recovery, reperfusion of the ischemic myocardium creates its own tissue injury. The physiologic response and healing of an ischemia/reperfusion injury is different from a chronic occlusion injury. Myocardial ischemia/reperfusion injury is gaining recognition as a clinically relevant model for myocardial infarction studies. For this reason, parallel animal models of ischemia/reperfusion are vital in advancing the knowledge base regarding myocardial injury. Typically, ischemia of the mouse heart after left anterior descending (LAD) coronary artery occlusion is confirmed by visible pallor of the myocardium below the occlusion (ligature). However, this offers only a subjective way of confirming correct or consistent ligature placement, as there are multiple major arteries that could cause pallor in different myocardial regions. A method of recording electrocardiographic changes to assess correct ligature placement and resultant ischemia as well as reperfusion, to supplement observed myocardial pallor, would help yield consistent infarct sizes in mouse models. In turn, this would help decrease the number of mice used. Additionally, electrocardiographic changes can continue to be recorded non-invasively in a time-dependent fashion after the surgery. This article will demonstrate a method of electrocardiographically confirming myocardial ischemia and reperfusion in real time.

During murine myocardial ischemia/reperfusion surgery, correct placement of the occluding ligature is typically confirmed by visible observation of myocardial pallor. Herein, a method of electrocardiographically confirming ischemia and reperfusion, to supplement observed myocardial pallor, is demonstrated in male C57Bl/6 mice.

Die Bestätigung der myokardialen Ischämie und Reperfusion Injury in Mäusen Oberflächen Pad Elektrokardiographie

Many animal models have been established for the study of myocardial remodeling and heart failure due to its status as the number one cause of mortality ...

Stromal Vascular Fraction-enriched Fat Grafting for the Treatment of Symptomatic End-neuromata

The purpose of this study was to methodically illustrate and highlight the crucial steps of stromal vascular fraction (SVF)-enriched fat grafting as a novel treatment of symptomatic end-neuromata of peripheral sensory nerves, and in this study, specifically of the superficial branch of the radial nerve (SBRN). Despite a multitude of existing treatments, persistent postoperative pain and common pain relapse are still very common, independent of the procedure assessed. The neuroma is microsurgically excised accordingly to standardized protocol. Instead of the relocation of the regenerating nerve stump in neighboring anatomical structures, such as muscle or bone, a fat graft is applied perifocally and acts as a mechanical barrier. In order to reduce the fat resorption rate and boost the regenerative potential of the graft, the highly concentrated SVF is integrated in the grafting. The SVF is isolated from subcutaneous fat by enzymatic and mechanic separation of the lipoaspirate by a specific commercial isolation system. The SVF-enriched fat graft provides both a mechanical barrier and various biological effects at the cellular level, including improving angiogenesis, inflammation, and fibrosis. Both mechanical and biologic effects help to reduce the disorganized axonal outgrowth of the nerve stump during nerve regeneration and hence prevent the recurrence of painful end-neuromata.

The purpose of the study is to illustrate the technical procedure of stromal vascular fraction (SVF)-enriched fat grafting as a novel treatment of symptomatic end-neuromata. This technique provides advantages of both the mechanical barrier and the biological action at the cellular level by the processed and concentrated SVF.

Stromazellen vaskuläre Bruchteil angereichertem Fett Pfropfung für die Behandlung von symptomatischen Ende-neuromata

The purpose of this study was to methodically illustrate and highlight the crucial steps of stromal vascular fraction (SVF)-enriched fat grafting as a ...

Methodology for Sputum Induction and Laboratory Processing

The technique of sputum induction and processing is a recognized non-invasive method allowing the collection and analysis of cells from the airways, which is interesting in various respiratory diseases like asthma, chronic obstructive pulmonary disease (COPD), chronic cough, or idiopathic pulmonary fibrosis. This technique is well tolerated, safe and non-invasive, but is currently limited to research services and specialized centers in clinical practice because it is technically demanding, time-consuming, and requires trained staff. The success rate of sputum induction and analysis is about 80%.
Here, we describe the induction and laboratory processing of sputum samples. Sputum is induced by inhalation of hypertonic or isotonic saline with salbutamol. For the processing, we use the whole sputum technique. Dithiothreitol (DTT) is used to allow mucolysis of sputum samples. The primary aim of sputum processing is to obtain a differential cell count to study the cell types present in the airway lumen. Additional analyses may also be performed on sputum supernatant and sputum cells, which may allow further investigation into inflammatory processes and immune mechanisms. Examples include studying mediators in sputum supernatant and performing a large spectrum of analysis on sputum cells such as flow cytometry, genomics, or proteomics.
Finally, representative results of sputum analysis in healthy controls, asthmatics, and COPD patients are presented.

Here we describe the technique of sputum induction. This protocol also explains the sputum processing to perform a differential cell count and to collect sputum supernatant and cells for further analysis.

Methodik für Sputum Induktion und Labor-Verarbeitung

The technique of sputum induction and processing is a recognized non-invasive method allowing the collection and analysis of cells from the airways, which ...

Sampling Strategies and Processing of Biobank Tissue Samples from Porcine Biomedical Models

In translational medical research, porcine models have steadily become more popular. Considering the high value of individual animals, particularly of genetically modified pig models, and the often-limited number of available animals of these models, establishment of (biobank) collections of adequately processed tissue samples suited for a broad spectrum of subsequent analyses methods, including analyses not specified at the time point of sampling, represent meaningful approaches to take full advantage of the translational value of the model. With respect to the peculiarities of porcine anatomy, comprehensive guidelines have recently been established for standardized generation of representative, high-quality samples from different porcine organs and tissues. These guidelines are essential prerequisites for the reproducibility of results and their comparability between different studies and investigators. The recording of basic data, such as organ weights and volumes, the determination of the sampling locations and of the numbers of tissue samples to be generated, as well as their orientation, size, processing and trimming directions, are relevant factors determining the generalizability and usability of the specimen for molecular, qualitative, and quantitative morphological analyses. Here, an illustrative, practical, step-by-step demonstration of the most important techniques for generation of representative, multi-purpose biobank specimen from porcine tissues is presented. The methods described here include determination of organ/tissue volumes and densities, the application of a volume-weighted systematic random sampling procedure for parenchymal organs by point-counting, determination of the extent of tissue shrinkage related to histological embedding of samples, and generation of randomly oriented samples for quantitative stereological analyses, such as isotropic uniform random (IUR) sections generated by the &#34;Orientator&#34; and &#34;Isector&#34; methods, and vertical uniform random (VUR) sections.

The practical application and performance of methods for generation of representative tissue samples of porcine animal models for a broad spectrum of downstream analyses in biobank projects are demonstrated, including volumetry, systematic random sampling, and differential processing of tissue samples for qualitative and quantitative morphologic and molecular analyses types.

Probenahmestrategien und Verarbeitung der Biobank Gewebeproben von porcinen biomedizinische Modelle

In translational medical research, porcine models have steadily become more popular. Considering the high value of individual animals, particularly of ...

A Training and Testing System for Performing Vascular Reconstruction In Vitro

Manual vascular reconstruction training is essential for a beginner surgeon. However, an optimal training system for vascular reconstruction in vitro has yet to be developed. In this study, we introduce an in vitro training and testing system using a magnetic anchoring technique with which a trainee can practice manual vascular reconstruction individually. Additionally, this system can also be used to test the quality of the reconstruction. The described system includes a vascular reconstruction training machine, magnetic tractors, and a magnetic suture puller. In this manuscript, we detail an end-to-end vein anastomosis using porcine right and left iliac veins. To identify the potential damage caused by a magnetic suture puller on the suture, we created three groups with six segments of 4-0 polypropylene sutures each: a control group with no intervention on the polypropylene suture, a group in which the polypropylene suture is manually pulled with sterile gloves 20x, and a magnetic puller group in which the magnetic puller pulled the polypropylene suture 20x. These groups were tested by light microscopy and breaking strength tests, and the effect of reconstruction was assessed. In the light microscopy test, the control group was less likely to be damaged (p &#60; 0.05) and the number of damaged points of the manual group and magnetic puller group were similar (p &#62; 0.05). The results of the breaking strength test were compared across groups and no significant difference was observed (p &#62; 0.05). The end-to-end anastomosis of the porcine iliac veins was successfully performed using this training system, and the reconstructed veins could undergo 2.0 kPa perfusion pressure. Using this training and testing system the trainee can practice manual vascular reconstruction in vitro individually with the aid of magnetic tractors and a magnetic suture puller, and the quality of the reconstruction can be tested.

Here we present a training and testing system where a trainee can complete manual vascular reconstruction in vitro individually using a magnetic anchoring technique. The system can also be used to test the quality of reconstruction.

Ein Trainings- und Testsystem zur Durchführung der Gefäßrekonstruktion in vitro

Manual vascular reconstruction training is essential for a beginner surgeon. However, an optimal training system for vascular reconstruction in vitro has ...