Agilent Stratagene Products Division <ul><li> Harini Ravi </li><li> Natalia Novorodovskaya </li><li> Scott Basehore </li><li> Jeff Braman </li><li> Rachel Formosa </li><li> Ronda Allen </li><li> Rajesh Bagga </li><li> Derek Hall </li><li> Sarah Jandle </li><li> Danielle Huffman </li></ul> Agilent Laboratories <ul><li> Robert Kincaid </li><li> Mary McBride </li></ul> Agilent Europa <ul><li> Nigel Skinner </li><li> Jürgen Schneider </li><li> Stephen Mueller </li><li> Martin Kratzmeier </li></ul> Campden BRI <ul><li> Steve Garrett </li></ul>

1: Bereiten Sie den Fisch Proben für die DNA-Extraktion <ol><li> Für jeden Fisch zu untersuchende Probe, ein Stück des Fisches Gewebe, mit einem Gewicht zwischen 10 mg und 1 g (roh oder gekocht), in einer einzigen 1,5-ml Mikrozentrifugenröhrchen. Verwenden Sie die folgende Abbildung als Richtlinie für die Schätzung des Gewichts eines rohen Fisch Probe auf Probe Größe. <img src="/files/ftp_upload/1871/1871fig1.jpg" alt="Abbildung 1" /> Abbildung 1. Messe Schätzungen der Fischproben auf Probe Größe. </li><li> Pre-warm die Proteinase K Verdau Buffer bis 65 ° C für 5 Minuten in einem Inkubator oder Wasserbad. </li><li> Bereiten Sie eine funktionierende Lösung von Proteinase K durch die Kombination von 200 ul Proteinase K Verdau Buffer und 20 ul Proteinase K pro Probe. Hinweis: Bereiten Sie eine frische Arbeitskopie Lösung von Proteinase K vor jedem Gebrauch. </li><li> Add 220 ul der Proteinase K funktionierende Lösung für jede 1,5-ml-Tube von Fisch Probe. Die Röhrchen bei 65 ° C für 10 Minuten im Brutschrank oder Wasserbad. </li><li> Drehen Sie das Röhrchen in einer Mikrozentrifuge für 3 5 Minuten bei 14.000 xg für Pellet keine unverdauten Gewebe. </li><li> Transfer 150 ul von jedem Überstand in ein frisches 1,5-ml-Tube. Vermeiden Sie die Übertragung keine unverdaute Material aus dem Boden des Röhrchens oder ölige Material, das vorhanden sein können, an der Spitze des Rohres. Diese Rohre Überstand werden die Proben aus der genomischen DNA extrahiert werden. </li></ol> 2: Auszug Genomic DNA <ol><li> In einem sterilen Behälter (Polypropylen-Röhrchen oder Glasflasche), bereiten eine funktionierende Lösung Sulfolan und Nucleic Acid Binding Buffer durch die Kombination von 320 ul von 90% Sulfolan und 170 ul der Nucleic Acid Binding Buffer pro Probe. Vielleicht möchten Sie eine ausreichende Menge dieser Mischung herzustellen, um so viele Proben zu verarbeiten, wie Sie innerhalb der nächsten 4 Wochen untersuchen zu planen. Diese Mischung kann für bis zu 30 Tage bei Raumtemperatur gelagert werden. Vermeiden Sie die Mischung, um Licht während der Lagerung. </li><li> Add 490 ul des Sulfolan / Binding Buffer Mischung (hergestellt in Schritt 1 oben), um jeden Fisch Probe. Vortex oder Pipette die Probe wiederholt, bis homogenisiert. Die Zugabe dieser Mischung bringt das Gesamtvolumen jeder Probe zu 640 ul. </li><li> Übertragen Sie jede Probe auf ein DNA Binding Spin Cup, die innerhalb einer 2-ml Behälter Rohr wurde sitzende (im Lieferumfang enthalten) und lassen Sie die Kappe des Röhrchens auf die Oberseite des Spin-cup. </li><li> Drehen Sie die Proben in einer Mikrozentrifuge für 1 Minute bei 14.000 xg, um die DNA auf den Spin Tasse Matrix zu laden. </li><li> Entfernen und behalten die Spin Tassen und entsorgen Sie die Filtrate. Für jede Probe, ersetzen Sie die Spin-Cup in den Behälter Rohr, dann fügen Sie 500 ul 1x High Salt Wash Buffer und Kappe der Röhre. </li><li> Drehen Sie die Proben in einer Mikrozentrifuge bei 14.000 xg für 1 Minute. </li><li> Entfernen und behalten die Spin Tassen und entsorgen Sie die Filtrate. Für jede Probe, ersetzen Sie die Spin-Cup in den Behälter Rohr, dann fügen Sie 500 ul 80% Ethanol und Kappe der Röhre. </li><li> Drehen Sie die Proben in einer Mikrozentrifuge bei 14.000 xg für 1 Minute. </li><li> Wiederholen Sie die Schritte 7 und 8 zwei weitere Male für insgesamt 3 mal mit 500 ul 80% Ethanol. </li><li> Nach dem dritten Waschen in 80% Ethanol, zu entfernen und die Spin-Tassen und entsorgen Sie die Filtrate. Ersetzen Sie die Spin Becher in ihrer Behälter Rohre und Spin in einer Mikrozentrifuge für 2 Minuten bei 14.000 xg, um die Faser-Matrix trocken. </li><li> Übertragen Sie die Spin Tassen bis 1,5-m1 Sammelröhrchen. 100 l Elutionspuffer jedem Spin Tasse direkt auf der Faser-Matrix in der Tasse. Lassen Sie die Kappen der Sammelröhrchen auf den Spin Tassen und Inkubieren bei Raumtemperatur für 1 Minute. </li><li> Drehen Sie die Proben in einer Mikrozentrifuge bei maximaler Geschwindigkeit für 1 Minute. </li><li> Die gereinigte DNA ist in der Elutionspuffer im Reaktionsgefäß. Entsorgen Sie die Spin Tasse und die Kappe der Rohre. Die DNA kann bei 4 ° C gelagert werden bis zu einem Monat. Für die langfristige Lagerung, speichern Sie die DNA bei 20 ° C oder 80 ° C. </li><li> Falls gewünscht, können Sie die Konzentration der DNA-Proben in einem Spektralphotometer messen. </li></ol> Die genomische DNA-Extraktion-Protokoll liefert typischerweise Proben mit einer Konzentration von 5 ng / ul bis 500 ng / ul. Die PCR-RFLP-Protokoll arbeitet Brunnen mit DNA-Proben im Bereich irgendwo von 0,05 ng / ul bis 2000 ng / ul. 3: Einrichten der PCR-Reaktionen <ol><li> Bereiten Sie eine 50 ng / ul Verdünnung der positiven Kontrolle Lachs-DNA durch die Kombination von 8 ul der DNA Lager mit 32 ul sterilem, DNase-freiem Wasser. Vortex mischen. Die verdünnte Probe kann bei 4 ° C gelagert werden für eine spätere Verwendung. </li><li> Bereiten Sie die Reaktionen, die durch die Kombination der Komponenten in der folgenden Tabelle in Ordnung. Bereiten Sie einen einzigen Reagenz-Mischung für alle PCR-Reaktionen, die gleichzeitig durch die Aufstockung der Volumina in den aufgeführten ausgeführt wirdTisch. Zusätzlich zu den Test-DNA-Proben, eine positive Kontroll-Reaktion und eine no-template Kontroll-Reaktion. Vorbereitung doppelte PCR-Reaktionen für jeden Test DNA-Probe wird empfohlen. Bereiten Sie genügend Reagenz-Mischung für alle Ihre Reaktionen plus ein Reaktionsvolumen Exzess. Zum Beispiel, wenn Sie 5-Test DNA-Proben haben, bereiten Sie genug Reagensmischung entweder für 8 Reaktionen (5 Testreaktionen, 1 positive Kontrolle, 1 no-template-Steuerung und 1 Überschuss) bzw. 13 Reaktionen, wenn Sie auch Duplikate der Testreaktionen werden (10 doppelte Testreaktionen, 1 positive Kontrolle, 1 no-template-Steuerung und 1 Überschuss). PCR Reagenzmischung <table border="1"><tbody><tr><td> Komponente </td><td> Band 1 Reaction </td><td> Band 5 Reaktionen </td></tr><tr><td> dH 2 O, steril </td><td> 9 ul </td><td> 45 ul </td></tr><tr><td> 2x PCR Master Mix </td><td> 12,5 ul </td><td> 62,5 ul </td></tr><tr><td> Primermischung </td><td> 2,5 ul </td><td> 12,5 ul </td></tr><tr><td> Gesamtvolumen </td><td> 24 ul </td><td> 120 ul </td></tr></tbody></table></li><li> Vortex die Reagenz-Mischung gut, dann verteilen 24 ul zu jedem einzelnen dünnwandigen PCR-Reaktionsgefäß. </li><li> Fügen Sie 1 ul der verdünnten positive Kontroll-DNA mit der positiven Kontrolle Reaktionsgefäß. Um den Test Probenröhrchen, fügen 1 ul-Test DNA-Probe. Für die nicht-template Kontrolle Reaktion, fügen 1 ul DNase-freies Wasser an Stelle der DNA. Zur Vermeidung von Kreuzkontaminationen, verwenden Sie eine frische Pipettenspitze für jede DNA-Probe. Nach Zugabe der Probe, mischen Sie die Reaktion durch schnelles Pipettieren der Inhalt des Röhrchens nach oben und unten. </li><li> Cap der Reaktionsrohre, Vortex die Rohre zu mischen und zentrifugieren kurz. </li></ol> 4: Führen Sie die PCR-Protokoll <ol><li> Legen Sie die Reaktionen in den Thermocycler und starten Sie das PCR-Programm unten. PCR Cycling Protokoll <table border="1"><tbody><tr><td> Segment </td><td> Anzahl der Zyklen </td><td> Temperatur </td><td> Dauer </td></tr><tr><td> 1 </td><td> 1 </td><td> 95 ° C </td><td> 5 Minuten </td></tr><tr><td> 2 </td><td> 40 </td><td> 95 ° C 50 ° C 72 ° C </td><td> 30 Sekunden 30 Sekunden 30 Sekunden </td></tr><tr><td> 3 </td><td> 1 </td><td> 72 ° C </td><td> 7 Minuten </td></tr></tbody></table></li></ol> 5: Digest PCR Produkte mit Restriktionsenzymen <ol><li> Beschriften Sie die 0,5-ml-Röhrchen oder 0,2-ml Streifen Rohre, die für den Restriktionsverdau-Ansätze genutzt werden sollen. DdeI, HaeIII und NlaIII: Jede PCR-Reaktion wird mit drei verschiedenen Restriktionsenzymen verdaut werden. Daher ist für jede PCR-Reaktion, label drei separate Röhren mit den Namen der PCR-Probe und der Name des Restriktionsenzyms. </li><li> Bereiten Sie die Reagenz-Mischung für die DdeI Aufschlüsse durch die Kombination der Komponenten unterhalb in Ordnung. Bereiten Sie einen einzigen Reagenz-Mischung für alle DdeI Verdauung Reaktionen (plus mindestens einem Reaktionsvolumen Überschuss) mit Vielfachen der einzelnen Komponenten. Nachdem die PCR abgeschlossen ist, werden die PCR-Reaktionen mit den Restriktionsenzymen für Restriktionsfragmentlängenpolymorphismus (RFLP)-Analyse behandelt. DdeI Verdauung Reagenzmischung <table border="1"><tbody><tr><td> Komponente </td><td> Volumen </td></tr><tr><td> dH 2 O, steril </td><td> 1,5 ul </td></tr><tr><td> 10x DdeI Buffer </td><td> 0,5 ul </td></tr><tr><td> 10x DdeI Enzym </td><td> 0,5 ul </td></tr></tbody></table></li><li> Vortex die Reagenz-Mischung gut, dann verteilen 2,5 ul der einzelnen Reaktionsgefäße, die für DdeI etikettiert wurden. </li><li> Bereiten Sie die Reagenz-Mischung für die HaeIII Aufschlüsse durch die Kombination der Komponenten unterhalb in Ordnung. Bereiten Sie einen einzigen Reagenz-Mischung für alle HaeIII Verdauung Reaktionen (plus mindestens einem Reaktionsvolumen Überschuss) mit Vielfachen der einzelnen Komponenten. HaeIII Verdauung Reagenzmischung <table border="1"><tbody><tr><td> Komponente </td><td> Volumen </td></tr><tr><td> dH 2 O, steril </td><td> 1,5 ul </td></tr><tr><td> 10x HaeIII Buffer </td><td> 0,5 ul </td></tr><tr><td> 10x HaeIII Enzym </td><td> 0,5 ul </td></tr></tbody></table></li><li> Vortex die Reagenz-Mischung gut, dann verteilen 2,5 ul der einzelnen Reaktionsgefäße, die für HaeIII etikettiert wurden. </li><li> Bereiten Sie die Reagenz-Mischung für dieNlaIII Aufschlüsse durch die Kombination der Komponenten unterhalb in Ordnung. Bereiten Sie einen einzigen Reagenz-Mischung für alle NlaIII Verdauung Reaktionen (plus mindestens einem Reaktionsvolumen Überschuss) mit Vielfachen der einzelnen Komponenten. NlaIII Verdauung Reagenzmischung <table border="1"><tbody><tr><td> Komponente </td><td> Volumen </td></tr><tr><td> dH 2 O, steril </td><td> 1,5 ul </td></tr><tr><td> 10x NlaIII Buffer </td><td> 0,5 ul </td></tr><tr><td> 10x NlaIII Enzym </td><td> 0,5 ul </td></tr></tbody></table></li><li> Vortex die Reagenz-Mischung gut, dann verteilen 2,5 ul der einzelnen Reaktionsgefäße, die für NlaIII etikettiert wurden. </li><li> Für jede Abbaureaktion, fügen 2,5 ul der entsprechenden PCR-Produkt auf die beschrifteten Röhrchen. Alle Test-PCR-Reaktionen sowie der positiven Kontrolle Reaktion muss mit allen drei Restriktionsenzymen verdaut werden. </li><li> Vortex die Verdauung Reaktionen und dann kurz zentrifugieren. </li><li> Inkubieren Sie alle die Verdauung Reaktionen bei 37 ° C für 2 Stunden. Diese Inkubation kann in den Thermocycler durchgeführt werden. Falls gewünscht, können Reaktionen bei 37 ° C über Nacht bleiben. </li><li> Übertragen Sie die Reaktionen auf 65 ° C für 15 Minuten. Dieser Schritt kann in den Thermocycler durchgeführt werden. </li><li> Add 1 ul 60 mM EDTA (im Lieferumfang des Kits) zu jeder Reaktion und Vortex gut. </li></ol> 6: Analysieren Sie die Restriktionsverdau Muster <ol><li> Bereiten Sie die Gel-Farbstoff-Mix, legen Sie einen DNA-Chip auf dem Chip Priming Station und laden Sie die Masse auf den DNA-Chip. </li><li> Pipettieren Sie 5 ul der DNA-Marker in den Brunnen mit der Leiter-Symbol und in jedem der 12 Probenvertiefungen auf dem Chip markiert. DNA-Marker in der DNA 1000 Reagent Kit in ein grünes Röhrchen mit zur Verfügung gestellt. </li><li> Pipet 1 ul DNA-Leiter in den Brunnen mit einer Leiter Symbol gekennzeichnet. DNA-Leiter ist in der DNA 1000 Reagent Kit in einem gelb-Röhrchen versehen. </li><li> Für jedes der DNA-Proben, pipet 1 ul jeder Restriktionsverdau Reaktion in einem der 12 Probenvertiefungen auf dem Chip nach den Richtlinien in der Abbildung unten. Mit diesem Ansatz, Brunnen 1-3 für die 3 Verdauung Reaktionen für die positive Kontrollprobe, sind Brunnen 4-6 für die 3 Verdauung Reaktionen für Probe 1, Brunnen 7-9 sind für die 3 Verdauung Reaktionen für Probe 2, und Brunnen 10-12 sind für die 3 Verdauung Reaktionen zum Prüfmuster 3.Analyze der Restriktionsverdau-Ansätze auf der Agilent 2100 Bioanalyzer die Fragmentlängen bei der Verdauung produziert wurden, bestimmt. Die Agilent DNA 1000 Kit Guide hat vollständige Anleitung für den Betrieb im Labor-Chips auf der Bioanalyzer. Ein kurzes Protokoll wird im Folgenden für Sie bereitgestellt. <img src="/files/ftp_upload/1871/1871fig2.jpg" alt="Abbildung 2" /> Abbildung 2. Organisation von Proben-on-Chip. Wenn Sie weniger als 4 DNA-Proben, pipet 1 ul Wasser in den nicht genutzten Brunnen. Wenn Sie mehr als 4 DNA-Proben haben, müssen Sie mehr als einen Chip laufen. Beachten Sie, dass es nicht notwendig ist, um die positive Kontrollprobe auf jedem Chip laufen. </li><li> Platzieren Sie den Chip horizontal in den Adapter des IKA Wirbelmischer und Vortex für 60 Sekunden bei 2400 Umdrehungen pro Minute. </li><li> Legen Sie die Chips in die Agilent 2100 Bioanalyzer und starten Sie den Chip laufen. Er hat die Ausgangsmaterialien Signale werden in dem Instrument Kontext angezeigt. Nach dem Lauf beendet ist, werden Peaks für alle Proben mit den Einstellungen der Spitze zu finden Algorithmus identifiziert. Wenn Sie glauben, der Algorithmus hat es versäumt, einen echten Höhepunkt zu erkennen, können Sie die Höhe Threshold Sollwert auf einen Wert, dass der Algorithmus auf den Gipfel zu identifizieren erlaubt niedriger. </li><li> Gehen Sie auf die Assay Kontext und wählen Sie den Chip Registerkarte Zusammenfassung. Im Sample-Feld, geben Sie ein Beispiel Namen für alle 12 Brunnen auf dem Chip wie in der Abbildung unten gezeigt. <img src="/files/ftp_upload/1871/1871fig3.jpg" alt="Abbildung 3" /> Abbildung 3. Beispiel Name Eintrag in Chip Registerkarte Zusammenfassung. </li></ol> 7: Identifizieren Sie die Probe Arten mit RFLP Matcher Die Agilent Software-Anwendung RFLP Decoder verwendet werden, um die Fische für den Test DNA-Proben auf der Fragmentlängen bei der Verdauung Reaktionen hergestellt Basis zu ermitteln. Tabelle 7 Erwartete DNA Fragment Größen in der Positiv-Kontrolle Restriction Enzyme Erwartete Produkt-Größe (bp) DdeI 117 , 332, 340 HaeIII 40, 105, 333 NlaIII 459 Die hier angegebenen Hinweise Verwendung der Standard-Analyse-Einstellungen in RFLP Matcher. Lesen Sie die Software s Hilfesystem für detaillierte Informationen über die Bedienung der Software und die Interpretation der Anzeige. <ol><li> Starten Sie die RFLP Decoder-Programm. </li><li> Klicken Sie auf Datei&gt; Öffnen&gt; XAD-Datei. Das Dialogfeld Öffnen will öffnen. </li><li> Wählen Sie die XAD-Datei für die DNA-Chip, der Restriktionsverdau-Ansätze enthalten. Klicken Sie auf Öffnen. Ein Dialogfenster wird geöffnet Auflistung der Proben, die auf dem Chip geladen wurden. </li><li> Wählen Sie drei Verdauung Reaktionen entsprechend einer DNA-Probe und geben Sie die entsprechenden Restriktionsenzym für jede Probe über das Drop-Down-Menüs unter der Enzyme Spalte. In der nachfolgenden Abbildung ist das Enzym Spalte worden für die DNA-Probe 1 gefüllt. <img src="/files/ftp_upload/1871/1871fig4.jpg" alt="Abbildung 4" /> Abbildung 4. Festlegen Restriction Enzyme für jede Probe. </li><li> In das Feld min Peakhöhe in% der unteren Markierung &quot;, ist der Standardwert 10,0%. Wenn nötig, diesen Wert gesenkt zu kleinen Spitzen, die verpasst wurde identifiziert werden, oder angehoben, um Spitzen, die aus nicht-spezifischen Geräusche im verwerfen Elektropherogramm. Klicken Sie nach jeder Einstellung auf die Min-Peak-Höhe-Wert zu integrieren. <img src="/files/ftp_upload/1871/1871fig5.jpg" alt="Abbildung 5" /> Abbildung 5. Zuweisen Minimum Peak Height. </li><li> Klicken Sie auf Calc am unteren Rand des Dialogfelds. Die Fragment-Längen-Daten aus dem Bioanalyzer laufen erhalten füllt die Software Felder. </li><li> In der Partitur der Dropdown-Liste in der linken oberen Ecke des Bildschirms, wählen Sie den entsprechenden Algorithmus für die Analyse der Daten. Wenn die Fische zu analysierenden Probe besteht aus einer einzigen Fischart, wählen Dice (Nei Li) in die Partitur der Dropdown-Liste. Wenn die Proben aus einer Mischung von Arten bestehen können, wählen Sie Mixture. Die Tabelle am unteren Rand des Bildschirms bezeichnet kombinierte Score-Listen der besten Arten, entspricht den Ergebnissen aller drei Verdauung Reaktionen. Der Artname sowie dem gemeinsamen Namen sind in der Tabelle aufgeführt (siehe unten). Perfekte Ergebnisse (die mit einer Punktzahl von 1) sind in grün hervorgehoben. Spiele in gelb hervorgehoben sind in der Nähe Spielen betrachtet. Sie können sich auf einen Artnamen doppelklicken Sie auf, um das FishBase Webseite für diese Spezies. <img src="/files/ftp_upload/1871/1871fig6.jpg" alt="Abbildung 6" /> Abbildung 6. Species Identification auf die Verdauung der Grundlage. </li><li> In der unteren Cutoff-und Match-Toleranz Felder am oberen Rand des Bildschirms, können Sie passen Sie die Standardeinstellungen, um die Punktzahl der besten Arten, sich zu verbessern. Die untere Cutoff-Wert wird verwendet, um jegliche Fragmente kürzer als die Länge im Bereich bezeichnet verwerfen. Das Spiel Toleranz-Wert bestimmt, wie nahe in der Länge eines Fragments müssen, um die vorhergesagte Fragment als Übereinstimmung betrachtet werden. </li><li> Wiederholen Sie die Schritte 4 bis 8 für die restlichen DNA-Proben, die auf dem gleichen Chip enthalten waren. </li></ol> 8: Repräsentative Ergebnisse: Ein Bild von einer Bioanlyzer Gel mit Restriktionsverdau Proben aus 4 verschiedenen Fischarten ist in der Abbildung unten gezeigt. Die erwarteten Ergebnisse für die positive DNA-Probe sind in der nachstehenden Tabelle zusammengefasst. <img src="/files/ftp_upload/1871/1871fig7.jpg" alt="Abbildung 7" /> Abbildung 7. Bioanalyzer Gelbild der Restriktionsverdau Reaktion Proben. Jeder Gelspur ist mit dem Restriktionsenzym in die Reaktion eingesetzt gekennzeichnet. Erwartete DNA Fragment Größen in den Salmon Positive Control <img src="/files/ftp_upload/1871/1871fig8.jpg" alt="Abbildung 8" /> Abbildung 8. Erwartete DNA Fragment Größen in den Salmon Positive Control.

<ol>
	<li>Dooley, J. J., Sage, H. D., Brown, H. M., Garrett, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+fish+species+identification+by+use+of+lab-on-a-chip+technology.">Improved fish species identification by use of lab-on-a-chip technology.</a> Food Control. 16 (7), 601-607 (2004).</li><li>Dooley, J. J., Sage, H. D., Clarke, M. -. A. L., Brown, H. M., Garrett, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fish+species+Identification+Using+PCR-RFLP+Analysis+and+Lab-on-a-Chip+Capillary+Electrophoresis:+Application+to+Detect+White+Fish+Species+in+Food+Products+and+an+Interlaboratory+Study.">Fish species Identification Using PCR-RFLP Analysis and Lab-on-a-Chip Capillary Electrophoresis: Application to Detect White Fish Species in Food Products and an Interlaboratory Study.</a> J. Agric. Food Chem. 53, 3348-3357 (2005).</li><li>Dooley, J., Garrett, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determination+of+PCR-RFLP+Profiles+for+Fish+Species+Using+the+Agilent+2100+Bioanalyzer.">Determination of PCR-RFLP Profiles for Fish Species Using the Agilent 2100 Bioanalyzer.</a> Agilent Technologies Application Note. , (2005).</li><li>Dooley, J. J., Clarke, M. L., Sage, H. D., Brown, H. M., Garrett, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+a+chip-based+capillary+electrophoresis+system+to+enable+simple+PCR-RFLP+identification+of+fish+species.">Application of a chip-based capillary electrophoresis system to enable simple PCR-RFLP identification of fish species.</a> FSA Final Report Q01069. , (2004).</li></ol>

Die Autoren werden von Agilent Technologies, dass die Reagenzien und Instrumente in diesem Artikel verwendet produziert beschäftigt.

Wir zeigen eine einfache, schnelle und genaue DNA-basierte Screening-Methode für die Identifizierung von Fischarten in Fischprodukten. Diese leistungsstarke Methode liefert reproduzierbare, präzise Ergebnisse in weniger als einem Arbeitstag und es kann in kommerziellen Prüfanlagen durch optimierte Protokolle und einfache Einrichtung umgesetzt werden. Es ist durch die Erzeugung von objektiven Daten, die analysiert mittels RFLP Decoder-Software mit einer erweiterbaren Datenbank mit experimentell gewonnenen Fischarten Profile charakterisiert ist. Mit Routine Umsetzung hat diese Testmethode das Potenzial, Falschetikettierung von Meeresfrüchten zu verhindern und helfen bei der Aufrechterhaltung genaue Aufzeichnungen für die Einhaltung staatlicher Vorschriften.

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		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Agilent 2100 Bioanalyzer (with chip priming station and IKA vortex mixer)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Agilent</td>
<td>G2939AA</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Agilent 2100 Bioanalyzer laptop &amp; Expert Software</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Agilent</td>
<td>G2953CA</td>
<td>G2950CA - desktop PC &amp; Expert Software</td>
</tr>
<tr>
<td>Agilent Bioanalyzer DNA 1000 Reagent Kit (part #5067-1504)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Agilent</td>
<td>5067-1504</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Thermal Cycler</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Various</td>
<td>Various</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>PCR Strip Tubes</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Agilent</td>
<td>401428</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>PCR Strip Caps</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Agilent</td>
<td>401425</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>96-Well Working Rack</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Agilent</td>
<td>410094</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Fish Species Identification System DNA Isolation Kit</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Agilent</td>
<td>Contact</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Fish Species Identification System PCR-RFLP Reagent Kit</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Agilent</td>
<td>Contact</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>RFLP Matcher Software</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Agilent</td>
<td>Contact</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>100% ethanol, 200 proof (USP grade or equivalent)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Various</td>
<td>Various</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Sterile, nuclease-free water</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Various</td>
<td>Various</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Pipettors</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Various</td>
<td>Various</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Incubator or water bath set to 65&deg;C</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Various</td>
<td>Various</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Sterile glass bottle or polypropylene tube (e.g. 14-ml BD Falcon polypropylene)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Various</td>
<td>Various</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>round-bottom tubes or 50-ml BD Falcon polypropylene conical tubes)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Various</td>
<td>Various</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Vortex mixer</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Various</td>
<td>Various</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Microcentrifuge</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Various</td>
<td>Various</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Microcentrifuge tubes 1.5ml</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Various</td>
<td>Various</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Tube rack 1.5ml</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Various</td>
<td>Various</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Pipette Tips</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Various</td>
<td>Various</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

dna-based fish species identification protocol

Wir haben eine schnelle, einfache und genaue DNA-basierte Screening-Methode, um die Fischarten, die in frischem und verarbeitetem Fisch Proben zu identifizieren entwickelt. Diese vielseitige Methode beschäftigt PCR-Amplifikation von genomischer DNA aus Fischproben entnommen, durch Restriktionsfragmentlängenpolymorphismus (RFLP) Analyse gefolgt, um Fragment Muster, die auf dem Agilent 2100 Bioanalyzer gelöst werden können und abgestimmt auf die richtige Art mit RFLP Pattern-Matching-Software zu generieren. Der Fisch Identifikation Methode verwendet eine einfache, zuverlässige, Spin-Säule-basiertes Protokoll zur DNA aus Fischproben zu isolieren. Die Proben werden mit Proteinase K behandelt, um die Nukleinsäuren in Lösung freizusetzen. DNA wird dann durch die Aussetzung der Probe in Bindungspuffer und Verladen auf ein Mikro-Spin-Tasse mit einer Silica-basierte Faser-Matrix isoliert. Die Nukleinsäuren in der Probe binden an die Faser-Matrix. Die immobilisierten Nukleinsäuren werden gewaschen, um Verunreinigungen zu entfernen, und Gesamt-DNA in einem Endvolumen von 100 ul erholt. Die isolierte DNA ist bereit für die PCR-Amplifikation mit den mitgelieferten Primer, die Sequenzen in aller Fische Genome gefunden zu binden. Die PCR-Produkte werden dann mit drei verschiedenen Restriktionsenzymen verdaut und gelöst auf dem Agilent 2100 Bioanalyzer. Die Fragmentlängen bei der Verdauung Reaktionen hergestellt werden verwendet, um die Arten der Fische, aus denen die DNA-Probe bereit war zu bestimmen, mit der RFLP Pattern-Matching-Software enthält eine Datenbank mit experimentell gewonnenen RFLP Muster von kommerziell relevanten Fischarten werden.

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DNA-based Fish Species Identification Protocol

Diese Publikation beschreibt, wie die Agilent Fischarten Identification System verwenden, um die Arten der Fische durch Extraktion von DNA und Durchführung von PCR und RFLP-Analyse zu identifizieren.

DNA-basierte Fischarten Identification Protocol

We have developed a fast, simple, and accurate DNA-based screening method to identify the fish species present in fresh and processed seafood samples. ...

dna-based-fish-species-identification-protocol

Research

JoVE Journal

Biology

29.2K Aufrufe.  Agilent Technologies. Diese Publikation beschreibt, wie die Agilent Fischarten Identification System verwenden, um die Arten der Fische durch Extraktion von DNA und Durchführung von PCR und RFLP-Analyse zu identifizieren.

Serie: DNA-based Fish Species Identification Protocol

Non-radioactive in situ Hybridization Protocol Applicable for Norway Spruce and a Range of Plant Species

The high-throughput expression analysis technologies available today give scientists an overflow of expression profiles but their resolution in terms of tissue specific expression is limited because of problems in dissecting individual tissues. Expression data needs to be confirmed and complemented with expression patterns using e.g. in situ hybridization, a technique used to localize cell specific mRNA expression. The in situ hybridization method is laborious, time-consuming and often requires extensive optimization depending on species and tissue. In situ experiments are relatively more difficult to perform in woody species such as the conifer Norway spruce (Picea abies). Here we present a modified DIG in situ hybridization protocol, which is fast and applicable on a wide range of plant species including P. abies. With just a few adjustments, including altered RNase treatment and proteinase K concentration, we could use the protocol to study tissue specific expression of homologous genes in male reproductive organs of one gymnosperm and two angiosperm species; P. abies, Arabidopsis thaliana and Brassica napus. The protocol worked equally well for the species and genes studied. AtAP3 and BnAP3 were observed in second and third whorl floral organs in A. thaliana and B. napus and DAL13 in microsporophylls of male cones from P. abies. For P. abies the proteinase K concentration, used to permeablize the tissues, had to be increased to 3 g/ml instead of 1 g/ml, possibly due to more compact tissues and higher levels of phenolics and polysaccharides. For all species the RNase treatment was removed due to reduced signal strength without a corresponding increase in specificity. By comparing tissue specific expression patterns of homologous genes from both flowering plants and a coniferous tree we demonstrate that the DIG in situ protocol presented here, with only minute adjustments, can be applied to a wide range of plant species. Hence, the protocol avoids both extensive species specific optimization and the laborious use of radioactively labeled probes in favor of DIG labeled probes. We have chosen to illustrate the technically demanding steps of the protocol in our film.
Anna Karlgren and Jenny Carlsson contributed equally to this study.
Corresponding authors: Anna Karlgren at Anna.Karlgren@ebc.uu.se and Jens F. Sundstr&#246;m at Jens.Sundstrom@vbsg.slu.se

Non-radioactive in situ Hybridization Protocol Applicable for Norway Spruce and a Range of Plant Species

We describe a modified DIG in situ hybridization protocol, which is fast and applicable on a wide range of plant species including Norway spruce. With just a few adjustments, including altered RNase treatment and proteinase K concentration, the protocol may be used in studies of different tissues and species.

Nicht radioaktiv In situ Hybridisierung Protocol Einsetzbar für Fichte und einer Reihe von Pflanzenarten

The high-throughput expression analysis technologies available today give scientists an overflow of expression profiles but their resolution in terms of ...

Forschung

Biologie

Fluorescence in situ hybridization (FISH) Protocol in Human Sperm

Aneuploidies are the most frequent chromosomal abnormalities in humans. Most of these abnormalities result from meiotic errors during the gametogenic process in the parents. In human males, these errors can lead to the production of spermatozoa with numerical chromosome abnormalities which represent an increased risk of transmitting these anomalies to the offspring.
For this reason, the technique of fluorescence in situ hybridization (FISH) on sperm nuclei has become a protocol widely incorporated in the context of clinical diagnosis. This practice provides an estimate of the frequencies of numerical chromosome abnormalities in the gametes of the patients that seek for genetic reproductive advice.
To date, the chromosomes most frequently included in sperm FISH analysis are chromosomes X, Y, 13, 18 and 21.
This video-article describes, step by step, how to process and fix a human semen sample, how to decondense and denature the sperm chromatin, how to proceed to obtain sperm FISH preparations, and how to visualize the results at the microscope. Special remarks of the most relevant steps are given to achieve the best results.

Fluorescence in situ hybridization FISH Protocol in Human Sperm

This video-article describes, step by step, how to process a semen sample to achieve good-quality fluorescence in situ hybridization on human spermatozoa. Preparations obtained can be used for aneuploidy screening in the context of clinical diagnosis.

Fluoreszenz In situ Hybridisierung (FISH)-Protokoll in menschlichen Spermien

Aneuploidies are the most frequent chromosomal abnormalities in humans. Most of these abnormalities result from meiotic errors during the gametogenic ...

A Noninvasive Hair Sampling Technique to Obtain High Quality DNA from Elusive Small Mammals

Noninvasive genetic sampling approaches are becoming increasingly important to study wildlife populations. A number of studies have reported using noninvasive sampling techniques to investigate population genetics and demography of wild populations1. This approach has proven to be especially useful when dealing with rare or elusive species2. While a number of these methods have been developed to sample hair, feces and other biological material from carnivores and medium-sized mammals, they have largely remained untested in elusive small mammals. In this video, we present a novel, inexpensive and noninvasive hair snare targeted at an elusive small mammal, the American pika (Ochotona princeps). We describe the general set-up of the hair snare, which consists of strips of packing tape arranged in a web-like fashion and placed along travelling routes in the pikas&#x2019; habitat. We illustrate the efficiency of the snare at collecting a large quantity of hair that can then be collected and brought back to the lab. We then demonstrate the use of the DNA IQ system (Promega) to isolate DNA and showcase the utility of this method to amplify commonly used molecular markers including nuclear microsatellites, amplified fragment length polymorphisms (AFLPs), mitochondrial sequences (800bp) as well as a molecular sexing marker. Overall, we demonstrate the utility of this novel noninvasive hair snare as a sampling technique for wildlife population biologists. We anticipate that this approach will be applicable to a variety of small mammals, opening up areas of investigation within natural populations, while minimizing impact to study organisms.

We present a noninvasive sampling approach to efficiently collect hair samples from elusive small mammals, as shown for the American pika. We demonstrate the utility of this method by extracting DNA from sampled hair and amplifying several types of molecular markers commonly used in studies of wildlife ecology and conservation.

Ein nicht-invasives Haar Sampling-Technik, um High Quality DNA aus Elusive Kleinsäuger erhalten

Noninvasive genetic sampling approaches are becoming increasingly important to study wildlife populations. A number of studies have reported using ...

A Protocol for the Identification of Protein-protein Interactions Based on 15N Metabolic Labeling, Immunoprecipitation, Quantitative Mass Spectrometry and Affinity Modulation

Protein-protein interactions are fundamental for many biological processes in the cell. Therefore, their characterization plays an important role in current research and a plethora of methods for their investigation is available1. Protein-protein interactions often are highly dynamic and may depend on subcellular localization, post-translational modifications and the local protein environment2. Therefore, they should be investigated in their natural environment, for which co-immunoprecipitation approaches are the method of choice3. Co-precipitated interaction partners are identified either by immunoblotting in a targeted approach, or by mass spectrometry (LC-MS/MS) in an untargeted way. The latter strategy often is adversely affected by a large number of false positive discoveries, mainly derived from the high sensitivity of modern mass spectrometers that confidently detect traces of unspecifically precipitating proteins. A recent approach to overcome this problem is based on the idea that reduced amounts of specific interaction partners will co-precipitate with a given target protein whose cellular concentration is reduced by RNAi, while the amounts of unspecifically precipitating proteins should be unaffected. This approach, termed QUICK for QUantitative Immunoprecipitation Combined with Knockdown4, employs Stable Isotope Labeling of Amino acids in Cell culture (SILAC)5 and MS to quantify the amounts of proteins immunoprecipitated from wild-type and knock-down strains. Proteins found in a 1:1 ratio can be considered as contaminants, those enriched in precipitates from the wild type as specific interaction partners of the target protein. Although innovative, QUICK bears some limitations: first, SILAC is cost-intensive and limited to organisms that ideally are auxotrophic for arginine and/or lysine. Moreover, when heavy arginine is fed, arginine-to-proline interconversion results in additional mass shifts for each proline in a peptide and slightly dilutes heavy with light arginine, which makes quantification more tedious and less accurate5,6. Second, QUICK requires that antibodies are titrated such that they do not become saturated with target protein in extracts from knock-down mutants.
Here we introduce a modified QUICK protocol which overcomes the abovementioned limitations of QUICK by replacing SILAC for 15N metabolic labeling and by replacing RNAi-mediated knock-down for affinity modulation of protein-protein interactions. We demonstrate the applicability of this protocol using the unicellular green alga Chlamydomonas reinhardtii as model organism and the chloroplast HSP70B chaperone as target protein7 (Figure 1). HSP70s are known to interact with specific co-chaperones and substrates only in the ADP state8. We exploit this property as a means to verify the specific interaction of HSP70B with its nucleotide exchange factor CGE19.

A Protocol for the Identification of Protein-protein Interactions Based on 15N Metabolic Labeling, Immunoprecipitation, Quantitative Mass Spectrometry and Affinity Modulation

We present a variation of the QUICK (QUantitative Immunoprecipitation Combined with Knockdown) approach that was introduced previously to distinguish between true and false protein-protein interactions. Our approach is based on 15N metabolic labeling, the modulation of affinities of protein-protein interactions by the presence/absence of ATP, immunoprecipitation, and quantitative mass spectrometry.

Ein Protokoll für die Identifizierung von Protein-Protein-Wechselwirkungen Basierend auf<sup&gt; 15</sup&gt; N Metabolische Markierung, Immunpräzipitation, Quantitative Massenspektrometrie und Affinity Modulation

Protein-protein interactions are fundamental for many biological processes in the cell. Therefore, their characterization plays an important role in ...

Generation, Purification, and Characterization of Cell-invasive DISC1 Protein Species

Protein aggregation is seen as a general hallmark of chronic, degenerative brain conditions like, for example, in the neurodegenerative diseases Alzheimer's disease (A&beta;, tau), Parkinson's Disease (&alpha;-synuclein), Huntington's disease (polyglutamine, huntingtin), and others. Protein aggregation is thought to occur due to disturbed proteostasis, i.e. the imbalance between the arising and degradation of misfolded proteins. Of note, the same proteins are found aggregated in sporadic forms of these diseases that are mutant in rare variants of familial forms.
Schizophrenia is a chronic progressive brain condition that in many cases goes along with a permanent and irreversible cognitive deficit. In a candidate gene approach, we investigated whether Disrupted-in-schizophrenia 1 (DISC1), a gene cloned in a Scottish family with linkage to chronic mental disease1, 2, could be found as insoluble aggregates in the brain of sporadic cases of schizophrenia3. Using the SMRI CC, we identified in approximately 20 % of cases with CMD but not normal controls or patients with neurodegenerative diseases sarkosyl-insoluble DISC1 immunoreactivity after biochemical fractionation. Subsequent studies in vitro revealed that the aggregation propensity of DISC1 was influenced by disease-associated polymorphism S704C4, and that DISC1 aggresomes generated in vitro were cell-invasive5, similar to what had been shown for A&beta;6, tau7-9, &alpha;-synuclein10, polyglutamine11, or SOD1 aggregates12. These findings prompted us to propose that at least a subset of cases with CMD, those with aggregated DISC1 might be protein conformational disorders.
 Here we describe how we generate DISC1 aggresomes in mammalian cells, purify them on a sucrose gradient and use them for cell-invasiveness studies. Similarly, we describe how we generate an exclusively multimeric C-terminal DISC1 fragment, label and purify it for cell invasiveness studies. Using the recombinant multimers of DISC1 we achieve similar cell invasiveness as for a similarly labeled synthetic &alpha;-synuclein fragment. We also show that this fragment is taken up in vivo when stereotactically injected into the brain of recipient animals.

The generation, purification and cell invasion of intracellular, cytoplasmic full length DISC1 protein aggresomes from cell cultures and of a labeled, multimeric recombinant DISC1 protein fragment in E. coli are described. Cell invasiveness is shown for recipient cells in cell culture and for neurons in vivo after stereotactical brain inoculation.

Generation, Reinigung und Charakterisierung von Cell-invasive DISC1 Protein Spezies

Protein aggregation is seen as a general hallmark of chronic, degenerative brain conditions like, for example, in the neurodegenerative diseases ...

Robust 3D DNA FISH Using Directly Labeled Probes

3D DNA FISH has become a major tool for analyzing three-dimensional organization of the nucleus, and several variations of the technique have been published. In this article we describe a protocol which has been optimized for robustness, reproducibility, and ease of use. Brightly fluorescent directly labeled probes are generated by nick-translation with amino-allyldUTP followed by chemical coupling of the dye. 3D DNA FISH is performed using a freeze-thaw step for cell permeabilization and a heating step for simultaneous denaturation of probe and nuclear DNA. The protocol is applicable to a range of cell types and a variety of probes (BACs, plasmids, fosmids, or Whole Chromosome Paints) and allows for high-throughput automated imaging. With this method we routinely investigate nuclear localization of up to three chromosomal regions.

We describe a robust and versatile protocol for analyzing nuclear architecture by 3D DNA FISH using directly labeled fluorescent probes.

Robust 3D DNA FISH Mit Direkt markierten Sonden

3D DNA FISH has become a major tool for  analyzing three-dimensional organization of the nucleus, and several variations  of the technique have been ...

Assessing Species-specific Contributions To Craniofacial Development Using Quail-duck Chimeras

The generation of chimeric embryos is a widespread and powerful approach to study cell fates, tissue interactions, and species-specific contributions to the histological and morphological development of vertebrate embryos. In particular, the use of chimeric embryos has established the importance of neural crest in directing the species-specific morphology of the craniofacial complex. The method described herein utilizes two avian species, duck and quail, with remarkably different craniofacial morphology. This method greatly facilitates the investigation of molecular and cellular regulation of species-specific pattern in the craniofacial complex.&#160;Experiments in quail and duck chimeric embryos have already revealed neural crest-mediated tissue interactions and cell-autonomous behaviors that regulate species-specific pattern in the craniofacial skeleton, musculature, and integument. The great diversity of neural crest derivatives suggests significant potential for future applications of the quail-duck chimeric system to understanding vertebrate development, disease, and evolution.

This article describes a method to generate chimeric embryos that are&#160;designed to test the species-specific contributions of neural crest and/or other tissues to craniofacial development.

Die Beurteilung artspezifische Um Beiträge Craniofacial Entwicklung mit Wachtel-Ente Chimären

The generation of chimeric embryos is a widespread and powerful approach to study cell fates, tissue interactions, and species-specific contributions to ...

Fish Sperm Assessment Using Software and Cooling Devices

For gamete quality evaluation, there are innovative, rapid, and quantitative techniques that can provide useful data for aquaculture. Computerized systems for sperm analysis were developed to measure several parameters and one of the most commonly measured is the sperm motility.
Initially, this computer technology was designed for mammalian species, although it can also be used for fish sperm analysis. Fish have specific features that can affect sperm assessment such as a short motility time after activation and, in some cases, adaptation to lower temperatures. Thus, it is necessary to modify both software and hardware components to make motility analysis more efficient for fish sperm analysis. For mammalian sperm, the heating plate is used to maintain optimal temperatures of spermatozoa. However, for some fish species, it is advantageous to use a lower temperature to prolong the duration of motility, since the sperm remain active for less than 2 min. Therefore, cooling devices are necessary to refrigerate samples at constant temperature over the time of analysis, including on the optical microscope. This protocol describes the analysis of fish sperm motility using software for sperm analysis and new cooling devices to optimize the results.

The present protocol describes a procedure of fish sperm assessment using computer-assisted sperm analysis and cooling devices. The software gives a rapid, accurate and quantitative analysis of fish sperm quality based on spermatozoa motility, which can be a useful tool in aquaculture to improve reproduction success.

Fisch Sperma Bewertung mit Software und Kühlgeräte

For gamete quality evaluation, there are innovative, rapid, and quantitative techniques that can provide useful data for aquaculture. Computerized systems ...

Standardizing a Non-Lethal Method for Characterizing the Reproductive Status and Larval Development of Freshwater Mussels (Bivalvia: Unionida)

Actively monitoring the timing, development, and reproductive patterns of endangered species is critical when managing for population recovery. Freshwater mussels are among the most imperiled organisms in the world, but information about early larval (glochidial) development and brooding periods is still lacking for many species. Previous studies have focused on the complex life history stage when female mussels are ready to parasitize host fish, but few studies have focused on the brooding period and timing of larval development. The protocol described here allows researchers to non-lethally evaluate the state of gravidity for female mussels. The results of this study show that this method does not affect a female mussel&rsquo;s ability to stay gravid or become gravid again after sampling has been performed. The advantage of this method may permit its use on federally threatened or endangered species or other populations of high conservation concern. This protocol can be adapted for use on both preserved or live individuals and was tested on a variety of mussel species. The database provided is a repository for a breadth of information on timing of reproductive habits and will facilitate future freshwater mussel research, conservation, and recovery efforts.

Standardizing a Non-Lethal Method for Characterizing the Reproductive Status and Larval Development of Freshwater Mussels Bivalvia: Unionida

Freshwater mussel conservation is dependent on monitoring reproductive patterns and processes of species. This study standardizes a non-lethal protocol for sampling gill contents, characterizing larval development, and providing a digital repository for data collected. This protocol-database package will be an important tool for mussel researchers in recovery of imperiled species.

Standardisierung einer nicht-tödlichen Methode zur Charakterisierung des Fortpflanzungsstatus und der Larval-Entwicklung von Süßwassermuscheln (Bivalvia: Unionida)

Actively monitoring the timing, development, and reproductive patterns of endangered species is critical when managing for population recovery. Freshwater ...

Assessing Agrochemical Risk to Mated Honey Bee Queens

Current risk assessment strategies for honey bees rely heavily upon laboratory tests performed on adult or immature worker bees, but these methods may not accurately capture the effects of agrochemical exposure on honey bee queens. As the sole producer of fertilized eggs inside a honeybee colony, the queen is arguably the most important single member of a functioning colony unit. Therefore, understanding how agrochemicals affect queen health and productivity should be considered a critical aspect of pesticide risk assessment. Here, an adapted method is presented to expose honey bee queens and worker queen attendants to agrochemical stressors administered through a worker diet, followed by tracking egg production in the laboratory and assessing first instar eclosion using a specialized cage, referred to as a Queen Monitoring Cage. To illustrate the method&#39;s intended use, results of an experiment in which worker queen attendants were fed diet containing sublethal doses of imidacloprid and effects on queens were monitored are described.

This protocol was developed to enhance the understanding of how agrochemicals affect honey bee (Apis mellifera) reproduction by establishing methods to expose honey bee queens and their worker caretakers to agrochemicals in a controlled, laboratory setting and carefully monitoring their relevant responses.

Bewertung des agrochemischen Risikos für gepaarte Honigbienenköniginnen

Current risk assessment strategies for honey bees rely heavily upon laboratory tests performed on adult or immature worker bees, but these methods may not ...