Wir danken Radek Sindelka für seine Hilfe und Cas Bresilla für die Unterstützung mit Froschhaltung und Embryo Vorbereitung. Diese Arbeit wurde durch die NIH über die Erteilung R01DE021109 zu HLS Laura Jacox finanziert wurde von der Herschel Smith Graduiertenstipendium an der Harvard University und einen F30 einzelner Stipendien Zuschuss F30DE022989-01 durch die NIDCR finanziert.

1. Vorbereiten Reagenzien <ol><li> 10x MBS: Bereiten 1 l 10x Geändert Barths Saline (MBS)-Lösung 17. Siehe Tabelle 1, Reagenzien Bestandteile und Anweisungen. Verwenden Sie destilliertes Wasser für alle Lösungen. Mischen Sie in einem Becherglas mit einem Rührstab, bis zur vollständigen Auflösung. Alle Lösungen sollten bei Raumtemperatur durchgeführt werden. </li><li> 1x MBS: Verdünnen Sie 100 ml 10x MBS-Lösung in 900 ml destilliertem Wasser auf 1 l 1x MBS zu machen. Hinzufügen von 0,7 ml 1 M CaCl 2-Lösung. </li><li> 0,1 x MBS: 1x verdünnen MBS auf 1 L 0,5 x MBS-Lösung und 2 L 0,1 x MBS-Lösung herzustellen. Um 1 L 0,1 x MBS-Lösung, 1 ml 10 mg / ml Gentamycin-Lösung. Die MBS-Lösung mit 0,1 × Gentamycin wird für langfristige Embryokultur verwendet werden. </li><li> Ficoll / MBS: In 15 g Ficoll 400 bis 500 ml 0,5 x MBS-Lösung. Gründlich mischen. Fügen Sie einen Rührstab und mischen, bis Ficoll vollständig aufgelöst ist (mehrere Stunden). </li><li> 70% Ethanol: Verdünnung 100% Ethanol auf 70% Ethanol mitdestilliertes Wasser. </li></ol> 2. Vorbereiten Glas Betriebs Werkzeuge <ol><li> Nadel-Vorbereitung: Last Kapillarrohr in eine Nadel Magnet. <ol><li> Ziehen Sie die Nadeln nach den in Tabelle 2 gezeigten Einstellungen: Nadelzieher-Einstellungen. Die Einstellungen sind für eine Sutter Instrument Co. Modell P-80/PC Mikropipette Puller und Kapillar-Schläuche, wie in der Tabelle der spezifischen Reagenzien und Geräte beschrieben. Allerdings sind diese spezifischen Einstellungen der Sutter Nadel Puller, und müssen für andere Maschinen angepasst werden. Die Einstellungen können über eine Rampe Test bestimmt werden, wie von dem Hersteller der Maschine festgelegt. </li><li> Ziehen 4-6 Nadeln in Vorbereitung für das Verfahren. Die Nadeln sollten gebrochen werden, so dass die flexible, haarähnlichen Abschnitt der Glasspitze vollständig entfernt wird, was typischerweise 2-3 mm lang ist. Die Spitze muß relativ starr, aber dennoch schmal genug ist, um als Schneidwerkzeug verwendet werden. Siehe Foto von einem idealen Nadel in 1A. </li&gt; <li> Bewahren Sie die Nadeln in einer Petrischale mit einem Streifen aus Ton in der Mitte. Drücken Sie die Welle jeder Nadel in den Ton, um es in Position zu halten und die fragile scharfe Spitze aus dem Boden und die Seiten halten. </li></ol></li><li> Für weitere Tools, erhalten Glasplättchen, ein Paar lange Standardmuster Zangen, einem Bunsenbrenner, und 3-4 Glaspasteurpipetten (Größe 5 ¾ in). </li><li> Pipette-Werkzeug: Um eine Pipette-Werkzeug machen, Licht der Bunsenbrenner und legen Sie die Spitze einer Glaspasteurpipette in den blauen Teil der Flamme, während Drehen, so dass die Spitze schmilzt und das Loch vollständig Dichtungen, die einen geschlossenen, abgerundeten Ende . Die abgerundete, versiegelte Spitze wird später verwendet, um Vertiefungen im Tontopf, der die Embryonen während der Operation hält zu machen. Siehe Abbildung 1B. </li><li> Glas-Brücken: Um Glasbrücken zu machen, verwenden lange Standardmuster Pinzette vorsichtig abbrechen 3 mm und 3 mm Stücke von Deckglas Glas. Halten Sie das Stück des Deckglases mit tweezers, legen Sie das Glas in der Flamme, bis alle vier Kanten weicher und die Kurve nach unten und bildet eine kleine Glaskuppel. Die Kanten sollten nicht mehr scharf sein. Siehe Abbildung 1C. </li><li> Bewahren Sie die Deckglas Brücken, indem Sie sie, Kanten nach unten in Modelliermasse, Futter den Boden einer Petrischale. Stecken Sie die Brücken, so dass die Oberseite der Brücke über der Ton-Oberfläche bleibt. Drücken Sie nicht zu hart, so dass die Brücke bricht, und nicht ganz die Brücke in den Ton einbetten, weil es schwer zu entfernen sein. Nach der Sterilisation mit einer Flamme oder 70% Ethanol, können die Brücken aus dem Experiment wiederverwendet, um zu experimentieren. </li></ol> 3. Vorbereitung für den Embryo Betrieb <ol><li> Richten einen kleinen 60 mm Kunststoff-Petrischale mit Knetmasse. Zwischen den Anwendungen, die Schale und Ton Oberfläche gründlich mit destilliertem Wasser mit 70% Ethanol gewaschen und dann. HINWEIS: rot, weiß oder gelb, Van Aken Plastalina Modelliermasse, die in einem lokalen zu kaufen kanny-oder Kunstspeicher. Schwarz-Ton ist nicht zu empfehlen, weil es einen Rückstand Mitteilungen. </li><li> Füllen Sie die Schale mit 3% Ficoll 0,5 x MBS-Lösung. Der höhere Salzkonzentration verhindert Gewebedissoziation und das Polysaccharid Ficoll hilft, die Lösung, die in das Gesicht halten in Position unterstützt verdicken. </li><li> Verwenden Sie die geflammt Pasteur-Pipette-Werkzeug (siehe Abbildung 1), um flache, 2-3 mm Vertiefungen im Ton zu machen, über die Tiefe der Bühne 20 Embryo Körper. Machen 20-30 Vertiefungen, 1-2 mm voneinander auf jeder Seite der Schale, so dass es insgesamt 40-60 Vertiefungen. Beschriften einer Seite LOF / GOF, und die andere Seite Wildtyp, durch das Schnitzen Initialen in den Ton mit einer Pinzette. </li></ol> 4. Preoperation Embryo Vorbereitung <ol><li> Erhalten und Kultur Xenopus laevis Embryonen mit Standardverfahren 17. Für eine detaillierte Beschreibung der Froschhaltung, finden Sie Sive et al. 17. <ol><li> Achtundvierzig Stunden vor dem Experiment obtain Eiern von weiblichen Frösche und durchzuführen, in-vitro-Fertilisation. </li><li> Injizieren 0,5-1 ng Membran verschlossen GFP mRNA sowie beliebige mRNA oder Antisense-Morpholino-modifizierten Antisense-Oligonukleotiden (&quot;Morpholino&quot;) an der einen Zellen-Stadium oder in 2-Zellen in 2-Zellen-Stadium. Die eine Zelle Stufe dauert etwa 70-90 min. Spritzen Sie ein Gesamtvolumen von 3.1 nl. Anstelle von RNA, codierend für ein Fluoreszenzprotein (wie GFP oder RFP RNA), einen Morpholino-oder FITC fluoreszenzmarkierten Dextran injizieren. Die Fluoreszenz ist wichtig zu bestimmen, ob das transplantierte Gewebe heilt und bleibt im Kopf. </li><li> Capped-mRNA kann von einer linearisierte Plasmid mit einem mMessage mMachine SP6 oder T7 Kit vorbereitet werden. Morpholinos gestaltet werden kann und durch Gene Werkzeuge LLC bestellt werden. Die Menge an Morpholin für eine gewünschte Wirkung erforderlich ist für jedes Gen 18 bestimmt werden. </li><li> Bewahren Sie die injizierten Embryonen bei 15 ° C für 48 Stunden, bis sie Stufe 19-20 zu erreichen. (Foder alle nachfolgenden Schritte, Embryonen nach der Normal-Tabelle von Xenopus laevis durch Nieuwkoop Faber und 19). HINWEIS: Am Tag der Operation, müssen beide Empfänger und Spender Embryonen in einem Stadium der jeweils anderen für die Transplantate, um optimal arbeiten zu können. Allerdings, Embryonen mit Morpholinos (&quot;morphants&quot;) injiziert entwickeln manchmal langsamer als Wildtyp-oder steuern morphanten Embryonen, die es erforderlich machen Experimente so zu koordinieren, sowohl morphanten und Wildtyp-Embryonen sind auf der gleichen Stufe. Morphants müssen möglicherweise bei einer höheren Temperatur für 12-24 Stunden vor dem Eingriff gehalten werden. Um die Wahrscheinlichkeit, dass Embryonen können bei passenden Stufen gefunden werden zu erhöhen, können Embryonen bei verschiedenen Temperaturen gehalten werden. Vierundzwanzig Stunden vor dem Experiment, sollte man die Embryonen in einer mehrere Gerichte und morphants Ort bei 18-20 ° C und Wildtyp-Embryonen bei 15-18 ° C teilen </li></ol></li><li> Am Tag der Transplantation Experiment remove die Embryonen aus the15 ° C Inkubator und inszenieren sie nach Nieuwkoop und Faber 19. Wenn sie jünger als spät neurula (Stufe 19), lassen Sie sie bei Raumtemperatur für 1-2 Stunden, bis sie Stufe 19 zu erreichen. </li><li> Bildschirm des injizierten Embryonen unter einem Fluoreszenzmikroskop. Wählen Embryonen, die gleichmäßige, helle Fluoreszenz für das Experiment zeigen. </li><li> Entfernen Sie Unordnung und mögliche Verunreinigungen in der Nähe der Arbeitsbereich. Wischen Sie die Arbeitsfläche, Stereomikroskop und alle Werkzeuge mit 70% Ethanol. </li><li> Sobald die Embryonen im Stadium 19, entfernen Sie die Dotterhaut mit # 5/45 Dumont Pinzette unter einem Stereomikroskop. <ol><li> Entfernen Sie die Dotterhaut von 20-30 von jedem Spender und Empfänger Embryonen. </li><li> Für die ersten Gesichtstransplantation mehrere Experimente, sollte man mit ein paar Embryonen für jede Bedingung zu üben. Das Verfahren ist anspruchsvoll und erfordert eine sorgfältige Praxis, bevor es in einem größeren Maßstab verwendet werden, schnell und erfolgreich. Man kann u arbeitenp zu tun, 20 Transplantationen / Experiment. </li></ol></li><li> Bewegen Host Embryonen in die Betriebsschale mit einer Kunststoff abgestuften Führungspipette mit der Spitze abgeschnitten, daß die Öffnung ist viel breiter als ein Embryo (zumindest einige Millimeter). Seien Sie vorsichtig, nicht zu berühren Embryonen Blasen oder der Wasseroberfläche, als Embryonen werden in der Oberflächenspannung explodieren. </li><li> Verwenden Sie # 5/45 Pinzetten, um die Embryonen in die Vertiefungen Ton einfügen, mit dem hinteren Teil des Embryos in der Lehm. Schließen Sie vorsichtig den Ton rund um die Grundlagen des Embryos mit der Zange, so dass die obere Viertel des Embryos, den Kopf aus der Depression herausragt. </li><li> Sobald alle Host-Embryonen in ihren Depressionen gesichert ist, auf die andere Seite der Platte bewegen und beginnen, die Spender Embryonen in ihre Depressionen einfügen. Wiederholen Sie den Prozess der Sicherung der Embryonen in ihren Brunnen. </li></ol> 5. Durchführen der Gesichtstransplantation <ol><li> Schneidmesser: Als ein Schneidmesser zum Entfernenvon Spendergewebe EAD, verwenden Sie eine geeignete Glasscherben Kapillarnadel (siehe Schritt 2.3 und Abbildung 1). HINWEIS: Man kann direkt halten die Kapillare zwischen den Fingern (dies funktioniert auch für Menschen mit kleinen Händen) oder ein in einer Insektenstifthalter die Nadel montieren. Electrosharpened Wolfram Nadeln 17 in einem Stifthalter geladen anstelle eines Kapillarrohrs Nadel verwendet werden. Bitte sehen Sie schlug vor, Stifthalter und Wolfram Nadeln in der Tabelle der spezifischen Reagenzien und Geräte. </li><li> Unter einem Stereomikroskop, legen Sie die Nadel in den Kopf des Embryos auf der linken Seite des Zementdrüse. Die Nadel sollte tief eingesetzt werden, so dass es geht von außerhalb der Embryo durch den Kopf, und in den Vorderdarm. Um die gesamte EAD verpflanzen, sollte Schnitte von der Außenseite des Embryos in die Vorderdarm verlängern. Für nur Ektoderm-Transplantationen sollten Schnitte flacher sein und sich nur durch das Ektoderm. <ol><li> Flick die Nadel von der linken zur rechten Seite derKopf, über die gesamte Breite der Zementdrüse. Das Schnippen ist wichtig, da die Bewegung gibt einen sauberen Schnitt. Siehe 2A für eine Zusammenfassung der Technik und 2B für eine Demonstration der Schnitte. Die Zementdrüse und Augen sind wichtige Meilensteine ​​für die Schnitte. Die Reihenfolge der Schnitte hat keinen Einfluss auf das Ergebnis und kann basierend auf Vorlieben oder Händigkeit des Benutzers variieren. </li></ol></li><li> Platzieren der Nadel zu Beginn des vorigen Schnitt am linken Rand der Zementdrüse und den Fingern an die Nadel nach oben, bis es den Boden des linken Auges erreicht. Dies wird einen vertikalen Schnitt vom linken Rand der Zementdrüse auf der Unterseite des linken Auges zu schaffen. </li><li> Stecken Sie die Nadel am rechten Rand des Zementdrüse, und Flick die Nadel nach oben, bis sie den Boden des rechten Auges erreicht. Dies wird einen vertikalen Schnitt vom rechten Rand der Zementdrüse an der Unterseite des rechten Auges zu schaffen. </li><li> Um vollständig herauszuschneiden das Gewebe, flick die Nadel von der Unterseite des linken Auges auf der Unterseite des rechten Auges, wodurch ein horizontaler Schnitt, die das Gewebe frei werden. Cuts von außerhalb des Embryos an der Vorderdarm erweitern, einschließlich sowohl Ektoderm und Entoderm in der EAD Explantation. Alternativ können flache Schnitte für Ektoderm nur EAD Transplantationen verwendet werden. Sobald der EAD Gewebe entfernt wird, sollte es eine rechteckige Öffnung von der Außenseite des Embryos in den Vorderdarm zu sein, die sich von der Zementdrüse bis knapp unterhalb der Augen (von oben nach unten). Das Loch sollte vom inneren Rand des linken Auges auf den inneren Rand des rechten Auges (Seite zu Seite) zu erstrecken. Siehe Abbildung 2Bb. </li><li> Schieben Sie das ausgeschnitten Gewebe auf der Spitze der Nadel, und heben Sie durch den Puffer, um den Teil der Schale mit Host-Embryonen. Sie nicht das Gewebe an der Oberfläche Luft auszusetzen oder es wird beschädigt werden. </li><li> Zuschneiden elbe Gewebe vom Wirtsembryo, wie für den Spender. Entsorgen Sie die Host-EAD Explantat oder speichern Sie es auf Insertiont in den Spender Gesicht, für die gegenseitige Transplantationen. </li><li> Legen Sie die Geber Explantation in die resultierenden Host-Loch mit # 5/45 Pinzette. </li><li> Sobald das Spendergewebe richtig positioniert ist und vollständig eingeführt ist, sorgfältig einen Glasbrücke (siehe Abbildung 1 und Abbildung 2Bc) über das Gesicht des Embryos, das Transplantat in Position zu halten. Die Enden der Brücke soll in den Ton einfügen, an Ort und Stelle hält. Die Brücke sollte sanft Druck auf das transplantierte Gewebe, so dass die Transplantation bündig mit der Host-Kopf, ohne ihn aus dem Kopf heraus oder liegend tief im Kopf. Der Kopf kann leicht durch das Deckglas abgeflacht werden, aber darauf achten, nicht den Embryo mit zu viel Druck beschädigt werden. Transplantationen sollten innerhalb von 5 Minuten durchgeführt werden. HINWEIS: Ein erfahrener Ermittler rund zwanzig Transplantationen pro Experiment über 2-3 Stunden durchführen können. Während dieser Zeit werden die Embryonen von Stufe 20-22 Fortschritte. Abschluss der Gesichtstransplantations in der Stufe 21 oder 22 hat keinen Einfluss auf die Ergebnisse. Später Transplantation (in den Stufen 22-26) kann getan werden, sind schwieriger als das Wappen frei EAD Mittellinienbereich wird als Schädel Neuralleiste bewegt sich in das Gesicht, aber verengt. Konsistenz über Transplantationen ist kritisch. </li></ol> 6. Gesichts-Transplantation nach der Operation Wiederherstellung <ol><li> Heilung dauert in der Regel 2-3 Stunden. Lassen Sie die Embryonen bei Raumtemperatur in ihrem Ton Vertiefungen mit den Glasbrücken hält die Spendergewebe an Ort ungestört. </li><li> Sobald die Transplantationen geheilt werden vorsichtig die Glasbrücken, entfernen Sie den Ton aus um die Basis der Embryonen mit einer Pinzette, und verwenden Sie absolvierte ein Kunststofftransferpipette vorsichtig absaugen die Embryonen aus ihren Depressionen. </li><li> Setzen Sie die Embryonen in eine entsprechend beschriftete Petrischale, die Hälfte mit sauberem 0,1 x MBS gefüllt mit Gentamicin. </li><li> Wachsen die Embryonen bei 15 ° C oder 18 ° C für mehrere Tage bis zum Erreichen Zuführen Kaulquappenstadium bei Stufe 40, wHenne Gesichts Phänotypen erzielt werden. <ol><li> Der 0,1 x MBS-Lösung mit Gentamicin sollte täglich gewechselt werden, und alle toten Embryonen sollten sofort entfernt werden, um Verunreinigung und Tod anderer Embryonen zu verhindern. </li><li> Der Mund öffnet um Stufe 40. In der Stufe 40-41, muss man überprüfen, dass das transplantierte Gewebe bleibt an Ort und Stelle verheilten, indem Sie seine Fluoreszenz. Transplantate gelegentlich fallen aus, so muss man sicherstellen, dass alle Embryonen hat die Spendergewebe an Ort und Stelle. </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Gorlin, R. J., Cohen, M., Levin, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Syndromes of the head and neck. , (1990).</li><li>Trainor, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Craniofacial+birth+defects:+The+role+of+neural+crest+cells+in+the+etiology+and+pathogenesis+of+Treacher+Collins+syndrome+and+the+potential+for+prevention.">Craniofacial birth defects: The role of neural crest cells in the etiology and pathogenesis of Treacher Collins syndrome and the potential for prevention.</a> Am. J. Med. Gen. A. 152, 2984-2994 (2010).</li><li>Dickinson, A. J., Sive, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+the+primary+mouth+in+Xenopus+laevis.">Development of the primary mouth in Xenopus laevis.</a> Dev. Bio. 295, 700-713 (2006).</li><li>Dickinson, A. J., Sive, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Positioning+the+extreme+anterior+in+Xenopus:+cement+gland,+primary+mouth+and+anterior+pituitary.">Positioning the extreme anterior in Xenopus: cement gland, primary mouth and anterior pituitary.</a> Sem. Cell Dev. Bio. 18, 525-533 (2007).</li><li>Dickinson, A. J., Sive, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Wnt+antagonists+Frzb-1+and+Crescent+locally+regulate+basement+membrane+dissolution+in+the+developing+primary+mouth.">The Wnt antagonists Frzb-1 and Crescent locally regulate basement membrane dissolution in the developing primary mouth.</a> Dev. 136, 1071-1081 (2009).</li><li>Gilbert, S. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Developmental Biology. , (2010).</li><li>Borchers, A., Epperlein, H. H., Wedlich, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+assay+system+to+study+migratory+behavior+of+cranial+neural+crest+cells+in+Xenopus.">An assay system to study migratory behavior of cranial neural crest cells in Xenopus.</a> Dev. Genes Evol. 210, 217-222 (2000).</li><li>Grunz, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Homoiogenetic+neural+inducing+activity+of+the+presumptive+neural+plate+of+Xenopus+laevis.">Homoiogenetic neural inducing activity of the presumptive neural plate of Xenopus laevis.</a> Dev. Growth Differ. 32, 583-589 (1990).</li><li>Servetnick, M., Grainger, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Changes+in+neural+and+lens+competence+in+Xenopus+ectoderm:+evidence+for+an+autonomous+developmental+timer.">Changes in neural and lens competence in Xenopus ectoderm: evidence for an autonomous developmental timer.</a> Dev. Bio. 112, 177-188 (1991).</li><li>Servetnick, M., Grainger, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Homeogenetic+neural+induction+in+Xenopus.">Homeogenetic neural induction in Xenopus.</a> Dev. Bio. 147, 73-82 (1991).</li><li>Couly, G., Coltey, P., Le Douarin, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+triple+origin+of+skull+in+higher+vertebrates:+a+study+in+quail-chick+chimeras.">The triple origin of skull in higher vertebrates: a study in quail-chick chimeras.</a> Dev. 117, 409-429 (1993).</li><li>Couly, G. F., Le Douarin, N. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mapping+of+the+early+neural+primordium+in+quail-chick+chimeras+:+I.">Mapping of the early neural primordium in quail-chick chimeras : I.</a> Developmental relationships between placodes, facial ectoderm. 110, 422-439 (1985).</li><li>Couly, G. F., Le Douarin, N. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mapping+of+the+early+neural+primordium+in+quail-chick+chimeras+II.+The+prosencephalic+neural+plate+and+neural+folds:+Implications+for+the+genesis+of+cephalic+human+congenital+abnormalities.">Mapping of the early neural primordium in quail-chick chimeras II. The prosencephalic neural plate and neural folds: Implications for the genesis of cephalic human congenital abnormalities.</a> Dev. Bio. 120, 198-214 (1987).</li><li>Lievre, A. L., Le Douarin, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+early+development+of+cranial+sensory+ganglia+and+the+potentialities+of+their+component+cells+studied+in+quail-chick+chimeras.">The early development of cranial sensory ganglia and the potentialities of their component cells studied in quail-chick chimeras.</a> Dev. Bio. 94, 291-310 (1982).</li><li>Kennedy, A., Dickinson, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Median+facial+clefts+in+Xenopus+laevis:+roles+of+retinoic+acid+signaling+and+homeobox+genes.">Median facial clefts in Xenopus laevis: roles of retinoic acid signaling and homeobox genes.</a> Dev. Bio. 365, 229-240 (2012).</li><li>Trainor, P., Tam, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cranial+paraxial+mesoderm+and+neural+crest+of+the+mouse+embryo-+codistribution+in+the+craniofacial+mesenchyme+but+distinct+segregation+in+the+branchial+arches.">Cranial paraxial mesoderm and neural crest of the mouse embryo- codistribution in the craniofacial mesenchyme but distinct segregation in the branchial arches.</a> Dev. 121, 2569-2582 (1995).</li><li>Sive, H. L., Grainger, R. M., Harland, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Early Development of Xenopus laevis. , (2000).</li><li>Tandon, P., Showell, C., Christine, K., Conlon, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Morpholino+injection+in+Xenopus.">Morpholino injection in Xenopus.</a> Methods Mol. Biol. 843, 29-46 (2012).</li><li>Nieuwkoop, P. D., Faber, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Normal Table of Xenopus laevis (Daudin). , (1994).</li></ol>

Die Autoren haben nichts zu offenbaren.

Kritische Schritte und Einschränkungen: Der EAD Gesichtstransplantation Verfahren ist zeit-und arbeitsintensiv. Es erfordert Übung, ruhige Hände und Fingerfertigkeit zu perfektionieren. Die Gesichtstransplantation Protokoll beruht auf der Fähigkeit des Forschers, um effizient zu entfernen und Transplantatgewebe. Wenn man zu lange braucht, um die Transplantation in das Wirts Gesicht einfügen, wird der Host Gesicht beginnen, sich zusammenzuziehen und zu heilen. Pinzetten können verwendet werden, um den Gesich...

Um Mechanismen bei kraniofazialen Entwicklung zugrunde liegenden Gesichtsschädelfehlbildungen 1-2, wichtige Gewebe und deren Signalbeiträge zu verstehen, müssen identifiziert werden. In dem Frosch Xenopus laevis, Teil des Gesichts, einschließlich der Mund-und Nasenlöcher Form aus der &quot;Extreme Anterior Domain&quot; (EAD), wo Ektoderm und Endoderm direkt nebeneinander 3-4. Der EAD dient auch als Signalzentrum, um das umliegende Gewebe, einschließlich der Schädel Neuralleiste, die die Kiefer und andere Gesichtsbereiche 5 bildet beeinflussen. Um Gene, die EAD-Funktion beitragen zu identifizieren, wurde eine &quot;Gesichtstransplantation&quot;-Technik entwickelt, bei der Gewebe wird von einem Spender in eine Wirts Embryo verpflanzt, nach dem Entfernen der entsprechenden Host-Region. Nach der Transplantation, was Gesichtsentwicklung beurteilt. Somit werden die Auswirkungen der Funktionsverlust (LOF) oder Überfunktion (GOF) für ein spezifisches Gen in der EAD lokal analysiert, wobei der Rest der head und Körper von Wildtyp-Gewebe besteht. Die wechselseitige Transplantation durchgeführt werden kann, in dem Wildtyp-Gewebe wird in Embryonen mit globaler LOF oder GOF in bestimmten Genen transplantiert. Transplantation wurde häufig in Xenopus verwendet und Küken studiert 6. Zum Beispiel hat Xenopus Transplantation homo neurale Induktion, Objektiv und neuronalen Kompetenz und Neuralleiste Migration 7-10 gerichtet. Wachtel-Küken chimären Transplantation hat die Entwicklung der anterioren Neuralplatte vorderen neuronalen Grat, Neuralleiste und Schädelknochen 11-14 analysiert. Dies ist die erste Transplantation Technik für die Untersuchung der Schädelentwicklung in Xenopus. Diese Technik hat eine neue Rolle für den Wnt-Inhibitoren Frzb1 und Halbmond bei der Regulierung der Basalmembran Bildung im Mund mutmaßlichen 5 demonstriert. Xenopus laevis ist ein ideales Modell für die Untersuchung der Schädelentwicklung als Embryonen groß sind, entwickeln extern einnd das Gesicht ist gut sichtbar, so dass die Mikromanipulation und Bild der Entwicklung. Mechanismen, die Gesichtsentwicklung konserviert erscheinen, die anzeigt, dass Ergebnisse in der Frosch machte einen Einblick in die menschliche Entwicklung 4,15-16.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="559">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:195px;">Pasteur pipette</td>
			<td rowspan="3" style="width:101px;">VWR</td>
			<td rowspan="3" style="width:136px;">14672-400</td>
			<td style="width:128px;">Lime Glass&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:195px;">Size 5 3/4&#8217;&#8217;</td>
			<td style="width:128px;">Cotton Plugged</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;"></td>
			<td style="width:128px;">Disposable</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="41" rowspan="2" style="height:41px;width:195px;">Graduated Transfer Pipette</td>
			<td rowspan="2" style="width:101px;">VWR</td>
			<td rowspan="2" style="width:136px;">16001-180</td>
			<td style="width:128px;">Disposable&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:128px;">Polyethylene</td>
		</tr>
		<tr height="80">
			<td height="100" rowspan="2" style="height:100px;width:195px;">#5/45 forceps</td>
			<td rowspan="2" style="width:101px;">Fine Science Tools by Dupont medical</td>
			<td rowspan="2" style="width:136px;">11251-35</td>
			<td rowspan="2" style="width:128px;">Angled 45 degrees</td>
		</tr>
		<tr height="20">
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="81" rowspan="3" style="height:81px;width:195px;">Standard Pattern Forceps</td>
			<td rowspan="3" style="width:101px;">Fine Science Tools</td>
			<td rowspan="3" style="width:136px;">11000-20</td>
			<td style="width:128px;">Straight; serrated tip</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:128px;">Stainless Steel;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:128px;">20cm long</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="81" rowspan="2" style="height:81px;width:195px;">Capillary Tubing (for needles)</td>
			<td rowspan="2" style="width:101px;">FHC</td>
			<td rowspan="2" style="width:136px;">30-30-1</td>
			<td style="width:128px;">Borosil 1.0mm OD x 0.5mm ID/Fiber</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:128px;">100mm each</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:195px;">Cover slip&#160;</td>
			<td rowspan="4" style="width:101px;">VWR</td>
			<td style="width:136px;">48393 252&#160;</td>
			<td style="width:128px;">24x60mm&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:195px;">micro cover glass</td>
			<td style="width:136px;">or&#160;</td>
			<td style="width:128px;">or&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:195px;">(for glass bridges)</td>
			<td style="width:136px;">48393 230</td>
			<td style="width:128px;">24x40mm</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;">No.1.5</td>
			<td style="width:136px;"></td>
			<td style="width:128px;"></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:195px;">Ficoll 400</td>
			<td style="width:101px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:136px;">F9378</td>
			<td style="width:128px;"></td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:195px;">Needle Puller&#160;</td>
			<td style="width:101px;">Sutter Instrument Co</td>
			<td rowspan="3" style="width:136px;">Needle Puller: discontinued Filament: FB300B</td>
			<td rowspan="3" style="width:128px;">The most similar, currently available&#160; needle puller is the P-97. For filaments, use Sutter 3.00mm square box filaments, 3.0mm wide.</td>
		</tr>
		<tr height="80">
			<td height="80" style="height:80px;width:195px;">Model P-80</td>
			<td style="width:101px;">Flaming / Brown micropipette puller</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;">(discontinued)</td>
			<td style="width:101px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:195px;">Stereomicroscope</td>
			<td rowspan="2" style="width:101px;">Zeiss</td>
			<td rowspan="2" style="width:136px;"></td>
			<td rowspan="2" style="width:128px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;">Zeiss Stemi 1000</td>
		</tr>
		<tr height="61">
			<td height="61" style="height:61px;width:195px;">Stereomicroscope Lighting by Fostec</td>
			<td style="width:101px;">Fostec</td>
			<td style="width:136px;"></td>
			<td style="width:128px;">Use a light box with 2 fiberoptic arms.&#160;&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="81" rowspan="2" style="height:81px;width:195px;">Nickel Plated Pin Holder</td>
			<td rowspan="2" style="width:101px;">Fine Science Tools</td>
			<td rowspan="2" style="width:136px;">26018-17</td>
			<td style="width:128px;">Jaw Opening Diameter: 0 to 1mm</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:128px;">Length: 17cm</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="101" rowspan="3" style="height:101px;width:195px;">Moria Nickel Plated Pin Holder</td>
			<td rowspan="3" style="width:101px;">Fine Science Tools</td>
			<td rowspan="3" style="width:136px;">26016-12</td>
			<td style="width:128px;">Jaw opening Diameter: 0 to 1mm</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:128px;">Length: 12cm</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:128px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="60" rowspan="2" style="height:60px;width:195px;">Tungsten Needles</td>
			<td rowspan="2" style="width:101px;">Fine Science Tools</td>
			<td rowspan="2" style="width:136px;">10130-05</td>
			<td rowspan="2" style="width:128px;">0.125mm Rod diameter</td>
		</tr>
		<tr height="20">
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:195px;">Van Aken Plastalina</td>
			<td rowspan="2" style="width:101px;">Blick&#160;</td>
			<td rowspan="2" style="width:136px;">#33268-2981</td>
			<td rowspan="2" style="width:128px;"></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:195px;">Modeling Clay- white, red or yellow</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:195px;">mMessage mMashine SP6 or T7 Kit</td>
			<td style="width:101px;">Ambion</td>
			<td style="width:136px;">AM1340</td>
			<td style="width:128px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

facial transplants in xenopus laevis embryos

Craniofacial Geburtsschäden treten in 1 aus jeden 700 Lebendgeburten, aber Ätiologie wird selten aufgrund der begrenzten Verständnis der kraniofazialen Entwicklung bekannt. Um festzustellen, wo Signalwege und Gewebe während der Strukturierung der Entwicklungs Gesicht handeln, hat eine &quot;Gesichtstransplantation&quot;-Technik in Embryonen von dem Frosch Xenopus laevis entwickelt. Eine Region der vermutlichen Gesichtstücher (die &quot;Extreme Anterior Domain&quot; (EAD)) von einem Spender an Schwanzknospen-Embryonen Stufe entfernt und auf eine Wirtsembryo der gleichen Stufe, aus dem die äquivalenten Bereich entfernt wurde transplantiert. Dies kann verwendet werden, um einen chimären Gesicht, wo der Host-oder Spendergewebe hat einen Verlust oder Gewinn von Funktion in einem Gen, und / oder enthält einen Label-Linie zu erzeugen. Nach der Heilung wird das Ergebnis der Entwicklung überwacht und anzeigt Rollen der Signalweg innerhalb des Spenders oder des umgebenden Wirtsgewebe. Xenopus ist ein wertvolles Modell für die Entwicklung Fläche, wie der Gesichtsbereich groß ist und leicht eineccessible für die Mikromanipulation. Viele Embryonen untersucht werden können, die über einen kurzen Zeitraum, da die Entwicklung rasch erfolgt. Ergebnisse in der Frosch sind relevant für die menschliche Entwicklung, da craniofacial Prozesse erscheinen zwischen Xenopus und Säugetieren konserviert.

Transplantierte Gewebe sollten vollständig nach der Transplantation in die Wirtskopf eingesetzt werden, wie in 3A gezeigt, und haben eine Glasbrücke entsprechend auf dem Gesicht des Embryos platziert, wie in Abbildung 2Bc gezeigt. Das transplantierte Spendergewebe muss korrekt für die Host-Öffnung bemessen sein, für die Transplantation erfolgreich zu sein. Die EAD Gewebe nicht aus dem Kopf herausragen, in irgendeiner Weise, wie in den 3B und 3C zu ...

Watch this Scientific Journal Video about Facial Transplants in Xenopus laevis Embryos at JoVE.com

Facial Transplants in Xenopus laevis Embryos

Eine Technik zum Trans &quot;Extreme Anterior Domain&quot; Gesichtsgewebe zwischen Xenopus laevis-Embryonen entwickelt. Tissue kann von einem Gen-Expression Hintergrund in eine andere verschoben werden, so dass die Untersuchung der lokalen Anforderungen für kraniofaziale Entwicklung und zur Signalisierung von Wechselwirkungen zwischen Gesichtsregionen.

Gesichtstransplantation in<em&gt; Xenopus laevis</em&gt; Embryonen

Craniofacial birth defects occur in 1 out of every 700 live births, but etiology is rarely known due to limited understanding of craniofacial development. ...

facial-transplants-in-xenopus-laevis-embryos

Research

JoVE Journal

Biology

Facial Transplants in Xenopus laevis Embryos

10.1K Aufrufe.  Harvard University.  Eine Technik zum Trans "Extreme Anterior Domain" Gesichtsgewebe zwischen Xenopus laevis-Embryonen entwickelt. Tissue kann von einem Gen-Expression Hintergrund in eine andere verschoben werden, so dass die Untersuchung der lokalen Anforderungen für kraniofaziale Entwicklung und zur Signalisierung von Wechselwirkungen zwischen Gesichtsregionen. 

Serie: Facial Transplants in Xenopus laevis Embryos

Dissection of Organizer and Animal Pole Explants from Xenopus laevis Embryos and Assembly of a Cell Adhesion Assay

This video demonstrates the technique used for preparation of organizer and animal pole explants from Xenopus laevis embryos, including the use of the eyebrow knife - a specialized dissection tool made of one's eyebrow. The protocol for assembling an adhesion assay is also given, which probes for the presence of key adhesion molecules present on the surface organizer or animal pole cells that are critical for proper development.

Präparation Organizer und Animal Pole Explantate aus Xenopus laevis Embryos und Montage eines Cell Adhesion Assay

Forschung

Biologie

Plastic Embedding and Sectioning of Xenopus laevis Embryos

Plastic sections maintain true tissue morphology in thin sections of tissue that can be immunostained with fluorescent secondary antibodies, making this method more useful than paraffin-embedded or frozen sections for many types of tissue. The method for staining, plastic embedding, and sectioning is demonstrated in this video.

Plastic Embedding und Schnitte von Xenopus laevis Embryonen

Obtaining Eggs from Xenopus laevis Females

The eggs of Xenopus laevis intact, lysed, and/or fractionated are useful for a wide variety of experiments. This protocol shows how to induce egg laying, collect and dejelly the eggs, and sort the eggs to remove any damaged eggs.

The eggs of Xenopus laevis intact, lysed, and/or fractionated are useful for a wide variety of experiments. This protocol shows how to induce egg laying, collect and dejelly the eggs, and sort the eggs to remove any damaged eggs.

Beziehen Eier von Xenopus laevis Weibchen

The eggs of Xenopus laevis intact, lysed, and/or fractionated are useful for a wide variety of experiments. This protocol shows how to induce egg laying, ...

Preparation and Fractionation of Xenopus laevis Egg Extracts

Crude and fractionated Xenopus egg extracts can be used to provide ingredients for reconstituting cellular processes for morphological and biochemical analysis. Egg lysis and differential centrifugation are used to prepare the crude extract which in turn in used to prepare fractionated extracts and light membrane preparations.

Crude and fractionated Xenopus egg extracts can be used to provide ingredients for reconstituting cellular processes for morphological and biochemical analysis. Egg lysis and differential centrifugation are used to prepare the crude extract which in turn in used to prepare fractionated extracts and light membrane preparations.

Vorbereitung und Fraktionierung von Xenopus laevis Egg Auszüge

Crude and fractionated Xenopus egg extracts can be used to provide ingredients for reconstituting cellular processes for morphological and biochemical ...

Microinjection of Xenopus Laevis Oocytes

Microinjection of Xenopus laevis oocytes followed by thin-sectioning electron microscopy (EM) is an excellent system for studying nucleocytoplasmic transport. Because of its large nucleus and high density of nuclear pore complexes (NPCs), nuclear transport can be easily visualized in the Xenopus oocyte. Much insight into the mechanisms of nuclear import and export has been gained through use of this system (reviewed by Pant&eacute;, 2006). In addition, we have used microinjection of Xenopus oocytes to dissect the nuclear import pathways of several viruses that replicate in the host nucleus. 
Here we demonstrate the cytoplasmic microinjection of Xenopus oocytes with a nuclear import substrate. We also show preparation of the injected oocytes for visualization by thin-sectioning EM, including dissection, dehydration, and embedding of the oocytes into an epoxy embedding resin. Finally, we provide representative results for oocytes that have been microinjected with the capsid of the baculovirus Autographa californica nucleopolyhedrovirus (AcMNPV) or the parvovirus Minute Virus of Mice (MVM), and discuss potential applications of the technique.

Here we demonstrate cytoplasmic microinjection of Xenopus laevis oocytes with a nuclear import substrate, as well as preparation of the injected oocytes for visualization by thin-sectioning electron microscopy.

Mikroinjektion von Xenopus laevis Oozyten

Microinjection of Xenopus laevis oocytes followed by thin-sectioning electron microscopy (EM) is an excellent system for studying nucleocytoplasmic ...

Tissue Determination Using the Animal Cap Transplant (ACT) Assay in Xenopus laevis

Many proteins play a dual role in embryonic development. Those that regulate cell fate determination in a specific tissue can also affect the development of a larger region of the embryo. This makes defining its role in a particular tissue difficult to analyze. For example, noggin overexpression in Xenopus laevis embryos causes the expansion of the entire anterior region, including the eye1,2. From this result, it is not known if Noggin plays a direct role in eye determination or that by causing an expansion of neural tissue, Noggin indirectly affects eye formation. Having this complex phenotype makes studying its eye-specific role in cell fate determination difficult to analyze. We have developed an assay that overcomes this problem. Taking advantage of the pluripotent nature of the Xenopus laevis animal cap 3, we have developed an assay to test the ability of gene product(s), like noggin or the eye field transcription factors (EFTFs), to transform caps into particular tissue or cell types by transplanting this tissue onto the side of the embryo 4. While we have found either Noggin protein treatment or a collection of transcription factors can determine retinal cell fate in animal caps, this procedure could be used to identify gene product(s) involved in specifying other tissues as well.

Tissue Determination Using the Animal Cap Transplant ACT Assay in Xenopus laevis

Animal caps overexpressing gene product(s) are transplanted to the flank of developing Xenopus laevis embryos in order to establish whether tissue is determined.

Tissue Bestimmung mit dem Tier Cap Transplant (ACT) Assay in Xenopus laevis</em

Many proteins play a dual role in embryonic development. Those that regulate cell fate determination in a specific tissue can also affect the development ...

Live-cell Imaging and Quantitative Analysis of Embryonic Epithelial Cells in Xenopus laevis

Embryonic epithelial cells serve as an ideal model to study morphogenesis where multi-cellular tissues undergo changes in their geometry, such as changes in cell surface area and cell height, and where cells undergo mitosis and migrate. Furthermore, epithelial cells can also regulate morphogenetic movements in adjacent tissues1. A traditional method to study epithelial cells and tissues involve chemical fixation and histological methods to determine cell morphology or localization of particular proteins of interest. These approaches continue to be useful and provide "snapshots" of cell shapes and tissue architecture, however, much remains to be understood about how cells acquire specific shapes, how various proteins move or localize to specific positions, and what paths cells follow toward their final differentiated fate. High resolution live imaging complements traditional methods and also allows more direct investigation into the dynamic cellular processes involved in the formation, maintenance, and morphogenesis of multicellular epithelial sheets. Here we demonstrate experimental methods from the isolation of animal cap tissues from Xenopus laevis embryos to confocal imaging of epithelial cells and simple measurement approaches that together can augment molecular and cellular studies of epithelial morphogenesis.

Live-cell Imaging and Quantitative Analysis of Embryonic Epithelial Cells in Xenopus laevis

Xenopus embryonic epithelia are an ideal model system to study cell behaviors such as polarity development and shape change during epithelial morphogenesis. Traditional histology of fixed samples is increasingly being complemented by live-cell confocal imaging. Here we demonstrate methods to isolate frog tissues and visualize live epithelial cells and their cytoskeleton using live-cell confocal microscopy.

Live-Cell-Imaging und Quantitative Analyse der embryonalen Epithelzellen in Xenopus laevis</em

Embryonic epithelial cells serve as an ideal model to study morphogenesis where multi-cellular tissues undergo changes in their geometry, such as changes ...

Production of Transgenic Xenopus laevis by Restriction Enzyme Mediated Integration and Nuclear Transplantation

Stable integration of cloned gene products into the Xenopus genome is necessary to control the time and place of expression, to express genes at later stages of embryonic development, and to define how enhancers and promoters regulate gene expression within the embryo. The protocol demonstrated here can be used to efficiently produce transgenic Xenopus laevis embryos. This transgenesis approach involves three parts: 1. Sperm nuclei are isolated from adult X. laevis testis by treatment with lysolecithin, which permeabilizes the sperm plasma membrane. 2. Egg extract is prepared by low speed centrifugation, addition of calcium to cause the extract to progress to interphase of the cell cycle, and a high-speed centrifugation to isolate interphase cytosol. 3. Nuclear transplantation: the nuclei and extract are combined with the linearized plasmid DNA to be introduced as the transgene and a small amount of restriction enzyme. During a short reaction, egg extract partially decondenses the sperm chromatin and the restriction enzyme generates chromosomal breaks that promote recombination of the transgene into the genome. The treated sperm nuclei are then transplanted into unfertilized eggs. Integration of the transgene usually occurs prior to the first embryonic cleavage such that the resulting embryos are not chimeric. These embryos can be analyzed without any need to breed to the next generation, allowing for efficient and rapid generation of transgenic embryos for analyses of promoter and gene function. Adult X. laevis resulting from this procedure also propagate the transgene through the germline and can be used to generate lines of transgenic animals for multiple purposes.

Production of Transgenic Xenopus laevis by Restriction Enzyme Mediated Integration and Nuclear Transplantation

This video protocol demonstrates a method for generating transgenic Xenopus laevis by introduction of transgenes into sperm nuclei followed by nuclear transplantation into unfertilized eggs.

Herstellung transgener Xenopus laevis Durch Restriktionsenzym-vermittelte Integration und Reaktorsicherheit Transplantation

Stable integration of cloned gene products into the Xenopus genome is necessary to control the time and place of expression, to express genes at later ...

Dissection of Xenopus laevis Neural Crest for in vitro Explant Culture or in vivo Transplantation

The neural crest (NC) is a transient dorsal neural tube cell population that undergoes an epithelium-to-mesenchyme transition (EMT) at the end of neurulation, migrates extensively towards various organs, and differentiates into many types of derivatives (neurons, glia, cartilage and bone, pigmented and endocrine cells). In this protocol, we describe how to dissect the premigratory cranial NC from Xenopus laevis embryos, in order to study NC development in vivo and in vitro. The frog model offers many advantages to study early development; abundant batches are available, embryos develop rapidly, in vivo gain and loss of function strategies allow manipulation of gene expression prior to NC dissection in donor and/or host embryos. The NC explants can be plated on fibronectin and used for in vitro studies. They can be cultured for several days in a serum-free defined medium. We also describe how to graft NC explants back into host embryos for studying NC migration and differentiation in vivo.

Dissection of Xenopus laevis Neural Crest for in vitro Explant Culture or in vivo Transplantation

This protocol describes how to dissect premigratory cranial neural crest (NC) from Xenopus laevis neurulas. These explants can be plated on fibronectin and cultured in vitro, or grafted back into host embryos. This technique allows studying the mechanisms of NC epithelium-to-mesenchyme transition, migration, and differentiation.

Dissektion der<em&gt; Xenopus laevis</em&gt; Neural Crest für<em&gt; In-vitro-</em&gt; Explantation Kultur oder<em&gt; In vivo</em&gt; Transplantation

The neural crest (NC) is a transient dorsal neural tube cell population that undergoes an epithelium-to-mesenchyme transition (EMT) at the end of ...

Using plusTipTracker Software to Measure Microtubule Dynamics in Xenopus laevis Growth Cones

Microtubule (MT) plus-end-tracking proteins (+TIPs) localize to the growing plus-ends of MTs and regulate MT dynamics1,2. One of the most well-known and widely-utilized +TIPs for analyzing MT dynamics is the End-Binding protein, EB1, which binds all growing MT plus-ends, and thus, is a marker for MT polymerization1. Many studies of EB1 behavior within growth cones have used time-consuming and biased computer-assisted, hand-tracking methods to analyze individual MTs1-3. Our approach is to quantify global parameters of MT dynamics using the software package, plusTipTracker4, following the acquisition of high-resolution, live images of tagged EB1 in cultured embryonic growth cones5. This software is a MATLAB-based, open-source, user-friendly package that combines automated detection, tracking, visualization, and analysis for movies of fluorescently-labeled +TIPs. Here, we present the protocol for using plusTipTracker for the analysis of fluorescently-labeled +TIP comets in cultured Xenopus laevis growth cones. However, this software can also be used to characterize MT dynamics in various cell types6-8.

Using plusTipTracker Software to Measure Microtubule Dynamics in Xenopus laevis Growth Cones

The MATLAB-based, open source software package, plusTipTracker, can be used to analyze image series of fluorescently-labeled +TIPs to quantify microtubule dynamics.

Verwendung plusTipTracker Software zum Messen in die Dynamik der Mikrotubuli<em&gt; Xenopus laevis</em&gt; Wachstumskegel

Microtubule (MT) plus-end-tracking proteins (+TIPs) localize to the growing plus-ends of MTs and regulate MT dynamics1,2. One of the most well-known and ...