Unser Protokoll ermöglicht die Abbildung des gesamten Fliegenhirns während des Verhaltens, was wichtig ist, um zu verstehen, wie Neuronen in verschiedenen Gehirnbereichen interagieren, um das Verhalten zu formen. Im Gegensatz zu anderen veröffentlichten Protokollen wurde dies speziell für den Zugriff auf das gesamte Gehirn entwickelt, während sich die Fliege durch Geruch, Geschmack oder visuelle Stimulation verhält und spürt. So erstellen Sie einen Kopfschlitz.
Nachdem Sie den Halter mit einem 3D-Drucker gedruckt haben, legen Sie ein Stück Klebeband rechteckig auf eine flache Oberfläche unter einem Stereomikroskop. Und schneiden Sie etwa fünf Millimeter um einen Zentimeter Stück. Verwenden Sie zwei parallel zusammengefestte Skalpelle, um einen 400 mal 400 Mikrometer nächsten Steckplatz in der Mitte der längeren Seite des Bandes zu schneiden, und legen Sie das Band über die flachere Seite des Lochs auf der Unterseite des Halters.
Verwenden Sie Zangen, um das Band etwa 500 Mikrometer um das Loch zu schieben. Und verwenden Sie schwarzen Nagellack, um die Oberseite des Bandes und den Halter zu bedecken. Nachdem Sie den Nagellack mindestens eine Stunde trocknen lassen, verwenden Sie ein gerolltes Gewebe, um dem Kopfschlitz etwa einen Mikroliter Fett hinzuzufügen.
Zur Vorbereitung des Körperschlitzes ein etwa zwei Zentimeter breites Stück Klebeband in zwei Stücke schneiden und 1,5 Millimeter breite Scheiben schneiden. Schneiden Sie dann einen 0,3 Millimeter tiefen Schulter- und Körperschlitz aus und stellen Sie sicher, dass das Band in den Halter passt. Um eine Fliege in den Halter zu fixieren, legen Sie zuerst einen flachen Behälter mit Eis unter das Sezieren des Mikroskops und legen Sie den Halter kopfüber auf ein Stück Laborgewebe, das über dem Eis platziert ist.
Apirieren Sie eine ein bis vier Tage alte weibliche Fruchtfliege von ihrer abscheulichen fliege, und blasen Sie die Fliege auf ungeschmolzenes Eis. Wenn die Fliege aufhört, sich zu bewegen, verwenden Sie Dell Zange, um die Fliege an der Basis der Flügel zu erfassen, und schieben Sie die Fliege mit dem Hals innerhalb des Steckplatzes in den Halter. Die Augen sollten auf beiden Seiten des Schlitzes gleichmäßig positioniert sein.
Fügen Sie bei Bedarf einen Mikroliter Fett an die Oberseite des Kopfes, um zu verhindern, dass der Kleber die Rückseite des Kopfes erreicht. Dann bedecken Sie den Körper mit einem Gewebe und etwas Eis, um sicherzustellen, dass sich die Fliege nicht bewegt. Um den Kopf zu sichern, platzieren Sie ihn in einem etwa 20-Grad-Winkel aus einer vollständig hinteren Ansicht.
Und verwenden Sie ein aufgerolltes Gewebe, um UV-Kleber um den Kopf aufzutragen, während sie eine Verschmutzung des sensorischen Bereichs von Interesse vermeiden. Für Geschmacksexperimente verwenden Sie Zangen, um die Proboscis herauszuziehen und Kleber an der Proboscis-Basis hinzuzufügen, um Bewegung zu verhindern. Wenn kein Geschmacksexperiment geplant ist, schieben und kleben Sie den Proboscis in den Kopf.
Härten Sie den Kleber mit UV-Licht für fünf Sekunden, und verwenden Sie ein aufgerolltes Gewebe, um sorgfältig die Bereiche um den Kopf zu reinigen, um alle verbleibenden flüssigen Kleber zu entfernen, die an den Beinen und Türen Boden kleben könnte, sensorische Bereiche. Verwenden Sie dann einen dünnen Band oder ein Gewebe, um die Beine nach vorne zu bewegen, wenn nötig. Um den Körper zu positionieren, entfernen Sie den Eisbehälter und drehen Sie den Halter um.
Entfernen Sie das Wasser um die Fliege und handeln Sie schnell, bevor die Fliege sich von der Anästhesie erholt, legen Sie das Körperschlitzband über das Loch und drücken Sie sanft den Körper der Fliege nach unten, wobei Darauf geachtet wird, den Hals nicht zu überdehnen. Bedecken Sie alle verbleibenden großen Löcher mit Klebeband und fügen Sie etwa einen Mikroliter Fett auf die Rückseite des Kopfes, um zu verhindern, dass Kleber an dieser Stelle klebt. Verwenden Sie ein aufgerolltes Gewebe, um UV-Kleber um den Thorax und auf der Oberseite des Bandes und Thorax zu malen, und härten Sie den Kleber mit UV-Licht für etwa fünf Sekunden.
Entfernen Sie vorsichtig Fett und ungehärteten Kleber mit einem Laborgewebe und fügen Sie etwa einen Milliliter Kochstoff auf die Oberseite des Kopfes. Verwenden Sie Zangen, um Luftblasen beiseite zu schieben und auf Leckagen zu überprüfen, indem Sie einen Deckelschlupf über die Saline legen und den Halter umdrehen, um auf der Vorderseite nach Saline zu suchen. Wenn Die Saline beobachtet wird, entfernen Sie die Saline und fixieren Sie das Loch mit mehr Kleber oder mehr Fett.
Um den Kopf zu sezieren wählen Sie die höchste Vergrößerung und verwenden Sie geschärfte sehr feine Zange, um zwei Schnitte an der Basis des zentralen dunklen Nagelnageldreiecks auf jeder Seite des Halses zu machen. Schneiden Sie um das dunkle Dreieck, und entfernen Sie diesen Teil der Nagelhaut. Muskel 16 und die Speiseröhre sollten durch dieses Loch sichtbar sein und sich rhythmisch bewegen.
Verwenden Sie die sehr feinen Zangen, um die Oberseite dieses Bereichs vorsichtig zu kneifen, um Muskel 16 zu trennen, ohne die Speiseröhre zu durchstechen. Wenn die rhythmische Bewegung stoppt, wurde der Muskel 16 wahrscheinlich entfernt. Wenn der Muskel vom medialen Rand des dunklen Dreiecksbereichs aus geschnitten wurde, verwenden Sie die Zange wie eine Schere, um die verbleibende Nagelhaut vorsichtig zu schneiden und in kleine Stücke zu entfernen.
Dann verwenden Sie die Zange zu greifen und langsam und stetig ziehen Sie einen Luftsack nach dem anderen. In diesem Video wurde eine Kalziumsonde in allen Neuronen dieser beiden Fruchtfliegengehirne exprimiert. Und es wurde ein Geruchsschimmer präsentiert.
In diesem Experiment beschränkte sich die Calciumsensorexpression auf dopaminerge und serotonerge Neuronen. Beachten Sie die enge Korrelation zwischen der starken synchronen Aktivität über dem Gehirn und dem Verhalten der Fliegen, das veranschaulicht, wie das gesamte Gehirn während eines bestimmten Verhaltens beobachtet werden kann. Mit Prinzipkomponentenanalyse und unabhängiger Komponentenanalyse können verschiedene funktionsreiche Bereiche extrahiert werden, die in verschiedenen Farben hervorgehoben sind.
Die Form und Lokalisierung der funktionsfunktionellen Bereiche ermöglicht die Zuordnung der Regionen zu anatomischen Vorlagen. Um Hirnregionen und in einigen Fällen Neuronentypen zu identifizieren. Einmal an der entsprechenden anatomischen Vorlage ausgerichtet, können Fluoreszenzwerte innerhalb bestimmter anatomischer Hirnregionen für die quantitative Analyse gemittelt werden.
In dieser Analyse können wir beispielsweise beobachten, dass alle Regionen beim Gehen aktiver sind als beim Pflegen. Seien Sie geduldig. Es ist schwierig, diese Herzsektionstechnik zu erlernen.
In meinem Labor benötigen die Leute durchschnittlich drei bis vier Monate, bevor sie es meistern und ihre ersten nützlichen Vorbereitungen erhalten. Nach diesem Protokoll können wir große Gehirnaktivität mit einem Fluoreszenzmikroskop aufzeichnen. Schnelle Methoden wie die Lichtfeldmikroskopie sind besonders indiziert.
